緒論一、分子生物學的基本含義分子生物學是從分子水平研究生命本質為目的的一門新興邊緣學科，它以核酸和蛋白質等生物大分子的結構及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當前生命科學中發展最快并正在與其它學科廣泛交叉與滲透的重要前沿領域。所謂在分子水平上研究生命的本質主要是指對遺傳、

生殖、生長和發育等生命基本特征的分子機理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎和提供新的手段。分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細胞內、細胞間通訊過程中發揮著重要作用的蛋白質等生物大分子。生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊藏各種信息，并且具有復雜的空間結構以形成精確的相互作用系統，由此構成生物的多樣化和生物個體精確的生長發育和代謝調節控制系統。闡明這些復雜的結構及結構與功能的關系是分子生物學的主要任務。Mendel的遺傳因子階段摩爾根的基因階段順反子階段現代基因階段一、基因的發展Mendel的遺傳因子階段Mendel提出：生物的某種性狀是由遺傳因子負責傳遞的。是顆粒性的，體細胞內成雙存在，生殖細胞內成單存在。遺傳因子是決定性狀的抽象符號。1866年發表論文，提出分離規律和獨立分配規律；1900年Mendel遺傳規律被重新發現1909年丹麥遺傳學家Yohannsen(1859-1927)發表了“純系學說”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遺傳因子”的概念。但沒有提出基因的物質概念。Morgan的基因階段MorganT.H.等提出了基因的連鎖遺傳規律。說明了基因是在染色體上占有一定空間的實體。基因不再是抽象符號，被賦予物質內涵。順反子階段1957年，本澤爾（SeymourBenzer）以T4噬菌體為材料，在DNA分子水平上研究基因內部的精細結構，提出了順反子（cistron）概念。順反子是1個遺傳功能單位，1個順反子決定1條多肽鏈。現代基因階段操縱子（operon）：結構基因+調控元件+調節基因LacOperon2．跳躍基因

指DNA能在有機體的染色體組內從1個地方跳到另一個地方，它們能從1個位點切除，然后插入同一或不同染色體上的另一個位置。3．斷裂基因

1個基因被間隔區分成不連續的若干區段，這種編碼序列不連續的間斷基因被稱為斷裂基因。4．假基因

不能合成出功能蛋白質的失活基因

。5．重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時是可以共用的即重疊的。

1983年，McClintock由于在50年代提出并發現了可移動遺傳因子（jumpinggene或稱mobileelement）而獲得Nobel獎。BarbraMcClintock1993年，美國科學家Roberts和Sharp因發現斷裂基因(introns)而獲得Nobel獎Gene的定義“基因”的分子生物學定義是：產生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。Agenecanbedefinedasfollowing:

TheentirenucleicacidsequencethatisnecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptideorRNAmolecule.分子生物學發展簡史19世紀后期到20世紀50年代初，是現代分子生物學誕生的準備和醞釀階段。在這一階段產生了兩點對生命本質的認識上的重大突破.確定了蛋白質是生命的主要基礎物質確定了DNA是生物遺傳的物質基礎一、準備和醞釀階段19世紀末Buchner兄弟證明酵母無細胞提取液能使糖發酵產生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀20-40年代提純和結晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黃酶、細胞色素C、肌動蛋白等），證明酶的本質是蛋白質。隨后陸續發現生命的許多基本現象（物質代謝、能量代謝、消化、呼吸、運動等）都與酶和蛋白質相聯系，可以用提純的酶或蛋白質在體外實驗中重復出來。在此期間對蛋白質結構的認識也有較大的進步。1902年EmilFisher證明蛋白質結構是多肽；40年代末，Sanger創立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個多肽分子--胰島素A鏈和B鏈的氨基全序列分析。由于結晶X-線衍射分析技術的發展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結構模型。所以在這階段對蛋白質一級結構和空間結構都有了認識。遺傳物質是核酸的確定肺炎雙球菌的轉化實驗噬菌體侵染細菌實驗煙草花葉病毒的重建實驗結論：加熱殺死的S型菌有某種轉化因子Avery在1944年更精密的實驗設計提取可能的轉化因子：DNA、RNA、蛋白質、莢膜進行試驗分別用降解DNA、RNA、蛋白質的酶作用于S型菌細胞抽提物組分提純試驗結果：DNA組分純度越高，轉化效率越高。結論：使R型菌變為S型菌的物質是S型菌的DNAAvery在1944年的報告中這樣寫道：當溶液中酒精的體積達到9/10時，有纖維狀物質析出；如稍加攪動，這種物質便會像棉線繞在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其他成分則以顆粒狀沉淀留在下面。溶解纖維狀物質并重復沉淀數次，可提高其純度。這一物質具有很強的生物學活性，初步實驗證實它很可能就是DNA。T2噬菌體感染試驗

（1952年，Hershey&Chase）

病毒重建試驗雜種病毒的感染特征和蛋白質外殼的特性是由其中的RNA決定的，而不是蛋白質決定的結論證明核酸（DNA或RNA）是遺傳的物質基礎簡單的細菌（或病毒）解決復雜而重大的問題微生物與高等生物具有共同的遺傳本質二、現代分子生物學的建立和發展階段1962年，Watson和Crick因為在1953年5月25日的《Nature》提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫學獎，后者通過X射線衍射證實了Watson-Crick模型。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規律鋪平了道路。1、DNA雙螺旋模型的提出TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962：fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial.

Wilkins通過對DNA分子的X射線衍射研究證實了該模型。RosalindE.Franklin1920-1958被遺忘的英格蘭玫瑰

RosalindE.Franklin1920-1958在發現DNA雙螺旋結構同時，Watson和Crick就提出DNA復制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先發現DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素標記和超速離心分離實驗為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續復制模型；1972年證實了DNA復制開始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓撲異構酶，并對真核DNA聚合酶特性做了分析研究。

完善了對DNA復制機理的認識3、中心法則和操縱子學說的提出以Nireberg等為代表的一批科學家經過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一個氨基酸，到1966年，全部破譯了64個密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。在研究DNA復制將遺傳信息傳給子代的同時，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質過程中起著中介作用的假說。1958年Weiss及Hurwitz等發現依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiegelman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補；逐步闡明了RNA轉錄合成的機理。

1968年，Nirenberg，Holley和Khorana共享諾貝爾生理醫學獎Nirenberg：破譯DNA遺傳密碼；Holley：闡明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列，并證實了所有tRNA具有結構上的相似性；Khorana：第一個合成了核酸分子，并且人工復制了酵母基因。中心法則

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規律1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀后修正的“中心法則”1961年，法國科學家Jacob和Monod提出并證實了操縱子（operon）作為調節細菌細胞代謝的分子機制。他們還推測存在一種與DNA序列相互補、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質合成場所并翻譯產生蛋白質的mRNA（信使核糖核酸）。對分子生物學的發展產生了極其重要的指導作用。FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right),1965分享了諾貝爾生理醫學獎三、初步認識生命本質并開始改造生命的深入發展階段工具酶的發現和應用1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相繼發現了EcoRI

一類重要的限制性內切酶。1967年，世界上有五個實驗室幾乎同時發現DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發現的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發現了反轉錄酶，完善了中心法則，用于構建cDNA

文庫。1.重組DNA技術的建立和發展1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相繼發現了EcoRI

一類重要的限制性內切酶。1967年，世界上有五個實驗室幾乎同時發現DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發現的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發現了反轉錄酶。載體的發現及其應用載體主要是小分子量的復制子如：病毒、噬菌體、質粒。1972年，美國Stanford大學的P.Berg等首次成功地實現了DNA的體外重組；pSC101質粒載體，ColE1質粒載體，pBR322質粒載體，pUC質粒載體，pGEM-3Z質粒，穿梭質粒載體，pBluescript噬菌粒載體etc.在多克隆位點區（MCS）的兩側，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉錄活動；具有單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉化子克隆的選擇標記；含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。

LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導該基因表達，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能與宿主細胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶相互補，產生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培養基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚，使生長于含X-gal培養基中的轉化菌落呈藍色。重組子導入受體細胞技術1944年，肺炎鏈球菌被成功轉化。1970年，大腸桿菌才被成功轉化，得益于CaCl2的應用轉化定義：同源或異源的游離DNA分子(質粒和染色體DNA)被自然或人工感受態細胞攝取，并得到表達的基因轉移過程。感受態細胞：具有攝取外源DNA能力的細胞。自然遺傳轉化1928年，Griffith發現肺炎鏈球菌（S.pneumoniae）的轉化現象。目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉化的能力:枯草芽孢桿菌：20%細胞出現感受態，持續幾小時；肺炎鏈球菌：培養后100%細胞為感受態；、大腸桿菌不能出現自然的感受態狀態。必備條件：1.建立了感受態的受體細胞；2.外源游離DNA分子。人工轉化在自然轉化的基礎上發展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎技術。不是由細菌自身的基因所控制；用多種不同的技術處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態”質粒的轉化效率高，因為質粒的轉化多數情況下不涉及重組過程。2、基因組研究的發展分子生物學已經從研究單個基因發展到研究生物整個基因組的結構與功能。1977年Sanger測定了ΦX174-DNA全部5375個核苷酸的序列；1978年Fiers等測出SV-40DNA全部5224對堿基序列；80年代λ噬菌體DNA全部48,502堿基對的序列全部測出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因組的全序列也陸續被測定；1996年底許多科學家共同努力測出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長4x106堿基對。.1990年人類基因組計劃（HumanGenomeProject）開始實施分子生物學與其他學科的關系分子生物學是由生物化學、生物物理學、遺傳學、微生物學、細胞學、以至信息科學等多學科相互滲透、綜合融會而產生并發展起來的，凝聚了不同學科專長的科學家的共同努力。它雖產生于上述各個學科，但已形成它獨特的理論體系和研究手段，成為一個獨立的學科。生物化學與分子生物學關系最為密切。兩者同在我國教委和科委頒布的一個二級學科中，稱為“生物化學與分子生物學”，但兩者還是有區別的。生物化學是從化學角度研究生命現象的科學，它著重研究生物體內各種生物分子的結構、轉變與新陳代謝。傳統生物化學的中心內容是代謝，包括