離子交換層析1離子交換(ionexchange)利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據其電荷差異，依靠庫侖力吸附在樹脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質從樹脂上洗脫下來，達到分離的目的。2離子交換樹脂的構成具有三維空間離體結構的網絡骨架聯接在骨架上的活性基團活性基團所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）3樹脂的網絡骨架45離子交換的分類按活性基團分類，可分為陽離子交換樹脂(cation

exchange)（含酸性基團）和陰離子交換樹脂(anionexchange)（含堿性基團）。具體又可以分為：強陽、弱陽強陰、弱陰67常用的離子交換樹脂強酸性陽離子交換樹脂：活性基團是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性陽離子交換樹脂：活性基團有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基團；強堿性陰離子交換樹脂：活性基團為季銨基團，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基；弱堿性陰離子交換樹脂：活性基團為伯胺或仲胺，堿性較弱；8pH56789交換容量（meq/g）0.82.58.09.09.0羧酸陽離子交換樹脂在不同pH下的交換容量H＋和弱酸陽離子樹脂的結合力很強，容易再生。910新型離子交換樹脂大孔離子交換樹脂大孔離子交換樹脂具有和大孔吸附劑相同的骨架結構，在大孔吸附劑合成后（加入致孔劑），再引入化學功能基團，便可得到大孔離子交換樹脂11大孔離子交換樹脂的優點通過在合成時加入惰性致孔劑，克服了普通凝膠樹脂由于溶脹現象，產生的“暫時孔”現象，從而強化了離子交換的功能；減少了凝膠樹脂在離子交換過程中的“有機污染”現象（大分子不易洗脫）；可以通過致孔劑選擇調整孔徑大小、樹脂的比表面積，以適應不同的分離要求。12和凝膠樹脂比較，大孔樹脂有以下特點：1。交聯度高、溶脹度小，有較好的理化穩定性；2。有較大的孔度、孔徑和比表面，給離子交換提供良好的接觸條件，交換速度快，有較好的抗有機污染性能；其永久性孔隙在水化作用時起緩沖作用，耐脹縮不易破碎；3。流體阻力小，工藝參數比較穩定。缺點：裝填密度小、體積交換量小、洗脫劑用量多，價格高，一次性投資較大等缺點13其它離子交換樹脂類型兩性樹脂：同時含有酸、堿兩種基團的樹脂；均孔型離子交換樹脂：主要是陰離子型凝膠離子交換樹脂，孔徑均勻，交換容量高、機械強度好；螯合樹脂：樹脂上含有具有螯合能力的基團，既可以形成離子鍵，又可以形成配位鍵；主要用于脫除金屬離子；*多糖基離子交換樹脂：固相載體為多糖類物質，親水性強、交換空間大、對生物大分子物質變性作用小。14離子交換纖維素和離子交換葡聚糖

親水性離子交換劑。都是由葡萄糖聚合而成的大分子物質，在分子中帶有很多羥基，通過化學反應可引入活性離子的基團，從而具備離子交換劑的性質。15多糖基離子交換樹脂離子交換纖維素

樹脂骨架為纖維素，根據活性基團的性質可分為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類 特點：骨架松散、親水性強、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高常用的離子交換纖維素有：

甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素、二乙基氨基乙基纖維素

16CMCCationExchanger17DEAEanionexchanger18離子交換纖維素具有開放性的支持骨架，大分子能自由地進入和迅速地擴散，故對大分子的吸附容量較大。離子交換纖維素上交換基團排列疏散，對大分子的吸附不是太牢固，用溫和的條件便可將其洗脫下來，因此不致引起大分子的變性，同時它有較理想的回收率。離子交換纖維素特別適用于分離那些水溶性的大分子物質，如蛋白質、多糖、酸性多糖等。192021交換體系中緩沖鹽的濃度不宜高(一般控制在0.001～0.02mol/L之間)，過高會大大減少蛋白質的吸附量。22離子交換纖維素的解吸

升高pH值,降低pH值,增加離子強度

H2N-P表示蛋白質,C表示纖維素。23葡聚糖凝膠離子交換樹脂

采用淀粉或蔗糖制備。

骨架為葡聚糖凝膠sephadex，根據功能基團的不同，亦可分為陽離子交換和陰離子交換樹脂常用的葡聚糖凝膠離子交換樹脂：CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-25等24

除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率.優點：載體親水，對生物大分子變性小，分辨率高。比纖維素樹脂交換容量大。缺點：洗脫液pH或離子強度變化時，凝膠體積變化大，影響流速。2526離子交換樹脂的性能參數交聯度交換容量表征骨架性能的參數表征活性基團的性能參數是指交聯劑在反應物中所占的質量分數交聯度大，樹脂孔隙，交換反應速度，選擇性。小慢高交聯度小，樹脂孔隙，交換反應速度，選擇性。大快低氨基酸的分離，交聯度8%，多肽的分離2~4%每克干樹脂所能交換的物質的量（mmol)。決定于網狀結構中活性基團的數目。交換容量由實驗測得27影響離子交換選擇性的因素水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；離子化合價：高價離子易于被吸附；溶液pH：影響交換基團和交換離子的解離程度，但不影響交換容量；離子強度：越低越好；有機溶劑：不利于吸附；交聯度、膨脹度、分子篩：交聯度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯度小，膨脹度大，吸附量減少；樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；28RSO3-H++H3+NR1COO-RSO3-H3+NR1COO-H+RSO3-H3+NR1COOH

RSO3-H++H3N+R1COOHRSO3-Na++H3+NR1COO-RSO3-H3+NR1COO-Na+氫型磺酸樹脂吸附丙氨酸:酸洗脫丙氨酸:鈉型磺酸樹脂吸附丙氨酸:2930離子交換操作方法樹脂預處理離子交換吸附洗脫31樹脂預處理物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒；化學處理：轉型（氫型或鈉型）陽離子樹脂酸—堿—酸陰離子樹脂堿—酸—堿最后以去離子水或緩沖液平衡32離子交換纖維素的處理和再生處理時間:從4h縮短為0.3-1h,浸泡用的酸堿濃度要適當降低,使用前須用大量水浸泡，充分溶漲。然后用數十倍的(如50倍)0.5mol/L鹽酸和0.5mol/L氫氧化鈉溶液反復浸泡處理，每次換液皆須用水洗至近中性,第二步處理時按交換的需要決定平衡離子。最后以交換用緩沖液平衡備用，堿處理時，陽離子交換纖維素膨脹很大，影響過濾或流速，解決方法：0.5mol/LNaOH+0.5mol/LNaCl.33離交操作方式靜態：操作簡單、但是分批操作，交換不完全動態：離子交換柱，操作連續、交換完全，適宜多組份分離

34洗脫方式（1）改變溶液pH值（2）改變溶液離子強度35樹脂再生酸性陽離子樹脂酸-堿-酸-緩沖溶液淋洗堿性陰離子樹脂堿-酸-堿-緩沖溶液淋洗36離子交換分離法的應用水的凈化H+OH-陽離子交換陰離子交換R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+H3OH-+X-RN+H3X-+OH-H++OH-H2O除去水中的雜質離子去離子水3738離子交換應用離子交換法提取蛋白質較無機離子的離子交換平衡復雜，其吸附行為與離子間的靜電引力、氫鍵、疏水作用以及范德華力有關蛋白質是生物大分子物質，其擴散行為也較無機離子復雜39SomeofthechargedregionswhichwillinfluenceionexchangeDifferentproteinshavedifferentchargesanddifferentpatternsofsurfacechargeBasisforselectivity40NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlostEffectofpHoncharge41-+OverallchargeonproteinNH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-acidisoelectricpoint alkalineexcesspositivechargebalancedpositiveandnegativechargeexcessnegativechargepH310Titrationcurves42離子交換法分離氨基酸

離子交換法是利用各種氨基酸等電點的差異，只有當混合氨基酸之間的等電點相差較大時才能較好地分開。離子交換樹脂研究較為成熟，提取氨基酸處理量大，成本低，操作條件容易控制。離子交換法在工業應用中已經有很多成功的實例，如谷氨酸,苯丙氨酸,精氨酸等的分離提取。43TypicalionexchangeproteinseparationLoadingstartsLoadingends,LowsaltwashbeginsProteinabsorbancePeakofunboundproteinSaltgradient01MSaltgradientbeginsSaltgradientendsElutedpeaksofweaklybound(I),moderatelybound(II)andtightlybound(III)proteinsIIIIII44常用于蛋白質提取分離的離子交換劑要求：良好的親水性、具有較大的均勻網格結構、粒度越小分辨率越高種類：多糖類離子交換纖維素交聯葡聚糖交聯瓊脂糖

聚乙烯醇類Mono系列AmershamPharmacia45蛋白質離子交換分離的基本步驟平衡上樣吸附洗脫再生46++++++-------anionexchangebeadEquilibration47Sampleapplicationandwash-----------++++++----48Elution----------------------------------++++++++++++--49Regeneration-----------------------++++++50SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------51蛋白質層析介質的發展概況層析技術的核心是層析介質,選擇合適的層析介質、應用合理的工藝條件已成為蛋白質層析技術的關鍵。52最初主要是天然高分子物質,都為多糖如纖維素、葡聚糖和非交聯的瓊脂糖凝膠,特點是親水性好、生物相容性高,缺點是質地較軟、不耐壓、流速慢,一般稱之為軟膠(softgel)。隨著對蛋白質分離要求的不斷提高,新型的層析介質被不斷地開發出來,53新型的層析介質

粒度均勻的珠狀交聯多糖。在保證了經典多糖介質良好的吸附性能的基礎上進行交聯,不但增加了強度,而且較窄的粒徑分布提高了分離效率。如交聯瓊脂糖凝膠,商品化的有AmershamBiosciences生產的SepharoseFastFlow、SepharoseHighPerformance等系列。54

人工合成的大孔聚合物。基于這類填料的層析被稱為灌注層析.其特點是在介質中除了有小的擴散孔,還有大的穿透孔,從而大大加快傳質,增加流速。最早商業化的產品是PerSeptiveBiosystems公司1989年推出的Poros系列,目前還有Ciphergen公司的HyperD系列。55觸角型(tentacle)吸附劑。這類介質通過增長間隔臂和有效官能團來增加活性配基與蛋白質的相互作用,從而提高效率,如Merck公司的FractogelEMD系列。56軟膠包裹在硬膠表面(softgelinarigidshell)。特點是結合了軟膠(如瓊脂糖)良好的吸附性能和無機材料(如硅膠)的剛性優點,如Ciphergen公司的Spherodex系列。57離子交換層析介質

纖維素離子交換劑,纖維素高度的親水性能與蛋白質有很好的相容性,缺點:容量低、流速慢。珠狀交聯葡聚糖、瓊脂糖、交聯纖維素,是目前得到廣泛應用的離子交換介質。人工合成的剛性材料被陸續開發。58活性基團活性基團的pK值決定了相應的離子交換劑的pH工作范圍。通常通過酸堿滴定曲線來確定,對同類型的離子交換劑來說,強陽(陰)離子交換劑比弱陽(陰)離子交換劑有更寬的工作范圍,是強弱介質的一個重要區別。59活性基團密度對蛋白質吸附能力也有影響。研究了陽離子交換介質活性基團密度的增加(10～500μmol/g)對溶菌酶和細胞色素C的吸附容量的影響,結果表明,在配基密度達到一個極限值之前,蛋白質的吸附容量隨著配基密度的增加而明顯增加;過了極限值,基本上沒有影響。60活性基團種類對蛋白質吸附能力也有影響。一般對同類型的離子交換劑來說,強陽(陰)離子交換劑比弱陽(陰)離子交換劑對蛋白質的結合能力強,需較強的鹽濃度進行洗脫。61對于在高鹽濃度不穩定或難溶解在高鹽濃度的蛋白質進行離子交換層析時,可以使用結合力相對較弱的弱離子交換劑。62基質及其對分離性能的影響基質對蛋白質分離效果影響較大的是其表面性質,如親水性和內部的孔徑分布。目前,用于蛋白質分離的離子交換介質一般都有較好的親水性能,內部的孔徑分布對蛋白質的分離影響更大,不但決定了蛋白質分離的范圍,而且還決定了蛋白質擴散的速度。63和凝膠過濾介質相比,離子交換對孔徑沒有特定的要求,一般選擇較大孔徑以利于蛋白質分子的擴散從而加快平衡、提高容量。基質的性質還決定了介質的溶脹性能、耐壓性能等。64離子交換介質性能表征離子交換介質性能的參數很多,可以分為物理性能、化學性能和色譜性能三大類。物理性能有粒徑、孔徑、壓降、溶脹性、流速、擴散等,化學性能主要指交換量、介質的化學穩定性等色譜性能主要有容量、分辨率、塔板高度、保留值等。65“三相純化策略”

富集(capturestep)

對目標蛋白質進行初步純化,去除那些與目標蛋白質性質差異很大的物質,如細胞的DNA、RNA等;尤其是去除那些對目標蛋白質不穩定的物質如各種蛋白酶。通常應用的層析技術有離子交換、疏水作用、親和層析,對層析介質的要求是流速快、載量大。66

中間純化(intermediatestep)

進一步純化目標蛋白,去除那些在分子大小、理化性質與目標蛋白質類似的雜質,通常采用與富集時不同的層析技術,對分離介質的要求是選擇性好(分辨率高)、載量大,通常應用顆粒較小的介質。67精制(polishingstep)最終去除那些痕量雜質,達到產品的純度要求,凝膠過濾是這一步中經常使用的層析技術,對分離介質的要求集中在高選擇性上。68蛋白質層析介質存在問題目前通用型介質大都采用瓊脂糖這類軟基質,填料的耐壓性較差,易變形而破碎,而且不耐酸,使用壽命無法和聚合物類型的介質相比。69動力學性能遠不如膜分離技術,尤其在大分子蛋白質分離過程中。傳統層析介質由于其內擴散的速度相對膜分離緩慢，因此介質內的功能基團無法被充分利用,工作交換(吸附)容量有限由于蛋白質大分子的擴散慢,層析時間較長和洗脫液體積較大,影響效率。70越來越多的人工合成或復合型的剛性材料被開發出來,提供了高流速、高選擇、高載量及可操作性的介質,是未來蛋白質層析介質發展的趨勢。71對策用低價、生物相容性好的基質材料制備層析介質。多糖類的天然高分子材料可以作為介質的基質,如纖維素、殼聚糖。由于價廉和生物相容性好的兩大優點可以取代瓊脂糖成為蛋白質分離的理想填料。也可將它們和其它聚合物涂層或混融制備填料基質。72良好的致孔技術

研制多種類的致孔劑介質的動力學性能取決于內部的孔結構,只有擁有均勻的、大小合適的孔徑分布才能有好的動力學性能,才能最大限度發揮填料的交換(吸附)作用和選擇性能。73開發大顆粒的耐壓性能好的全合成聚合物顆粒的增大提高了流速,給大規模生產操作帶來極大的便利,相應的設備投資可以大大降低,在具備良好的孔結構的基礎上還要保證介質具有耐壓的性能。74離子交換樹脂在食品工業中的應用

樹脂用于制糖工業已有30多年的歷史。蔗糖、甜菜糖、葡萄糖等在制造中都需要脫除色素。糖液中的色素種類很多，其中多以有機陰離子或兩性離子存在，用大孔氯型強堿陰離子樹脂可有效