第13章

毛細管電泳法capillaryelectrophoresis,CE第3節毛細管電泳儀capillaryelectrophoresisapparatus第4節毛細管電泳的分離模式separatetypesofCE第5節應用與進展applicationandadvancesofHPCE第1節概述generalization第2節毛細管電泳理論basictheoryofCE2023/2/3第13章

毛細管電泳法一、概述generalization二、經典電泳法traditionalelectrophoresis三、毛細管電泳法capillaryelectrophoresis第1節

概述generalizationcapillaryelectrophoresis,CE2023/2/3

電泳：是指帶電粒子（離子或膠粒）在電場的作用下，以一定的速度在緩沖溶液中的定向移動。利用不同帶電粒子在電場的作用下，發生差速遷移的現象而進行分離分析的技術，稱為電泳技術。第1節概述generalization

高效毛細管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE），是一類以裝有緩沖溶液的毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型分離分析方法。2023/2/3

在高壓直流電場力的作用下，處于很細（內徑25~75m，長30～100cm）毛細管內電解質溶液中的不同組分，由于所帶電荷及性質的差異，遷移速率不同，經過一定時間后，各組分將按速度的大小順序，依次到達檢測器而被檢測，從而得到按時間分布的電泳圖譜，圖譜上的遷移時間（tm

）用作定性，峰面積用作定量。2023/2/3經典電泳法的局限性：①效率低、重現性差。②兩端所加高電壓引起的介電質離子流的內熱即焦耳熱較大，譜帶增寬，柱效降低。HPCE的優點：①電泳過程在毛細管內進行，易散熱，降低了焦耳熱②柱效高（105～107/m理論塔板數）、分離速度快③操作方便，分析成本低（水介質中進行）。④應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫學、藥學、化學、環境保護、材料等原因是：高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進。

一是采用了0.05mm內徑的毛細管,；二是采用了高達數千伏的電壓。2023/2/3

GC：只適用于熱穩定性好、易揮發的物質。HPLC：缺乏高靈敏的通用型檢測器（與GC相比）；實驗中需消耗大量的有機溶劑；特別是對于大分子物質因其分子擴散系數小、傳質阻力大，使柱效大大降低，以至于難于分離分子量大于2000的物質。2023/2/3毛細管電泳與色譜分離原理：同屬于分離方法，但原理不同。分離過程：都是差速遷移過程，可用相同的理論來描述，如色譜中所用的一些名詞概念和基本理論，如保留值、塔板理論和速率理論等均可借用于CE中。儀器流程：都包括進樣部分、分離柱、檢測器和數據處理等部分。2023/2/3第13章

毛細管電泳法一、電泳和電泳淌度electrophoresisandmobility二、電滲與電滲率electroosmosisandelectroosmoticmobility三、表觀淌度和權均淌度apparentmobility四、分離效率和分離度separationefficiencyandResolution第2節

毛細管電泳理論capillaryelectrophoresis,CEbasictheoryofHPCE2023/2/3第2節基本原理當帶電粒子以速度u在電場中移動時，所受的電場力為

FE=qE

式中FE

——電場力；q——溶質粒子所帶的有效電荷；E——電場強度。帶電粒子運動時所受的阻力，即為摩擦力，

Ff

=fuep式中Ff——摩擦力；f——摩擦系數；uep——溶質粒子在電場中的遷移速度。當平衡時，電場力和摩擦力相等而方向相反，qE=fuep

一、電泳和電泳淌度

electrophoresisandmobility1.電泳和電泳速度2023/2/3則uep=qE/ff的大小和帶電粒子的大小、形狀以及介質粘度有關。對于球形粒子，；對于棒狀粒子，其中是離子半徑；是液體介質的粘度。所以或q/r越大，即體積越小，電荷越高的粒子uep越高，遷移越快；q/r越小，即體積越大，電荷越低的粒子uep越低，遷移越慢；不同物質在同一電場中，由于它們的有效電荷、形狀、大小的差異，因它們電泳遷移速度的不同，而實現分離。球形粒子棒狀粒子2023/2/32.電泳淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

棒狀粒子球形粒子

由于不同組分電泳淌度的差異，而有不同的電泳速度。中性粒子電泳淌度為零2023/2/33.有效淌度

在實際溶液中，離子活度系數、溶質分子的離解程度均對粒子的淌度有影響，考慮了這些影響因素后的淌度稱為有效淌度。式中為樣品分子的第i級離解度，為活度系數。

總之，帶電粒子在電場中的遷移速度，除與電場強度和介質特性有關外，還與粒子的解離度、電荷數及其大小和形狀有關。2023/2/3二、電滲和電滲流

electroosmosisandelectroosmoticmobility1.電滲

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷（如石英毛細管柱內壁，當內充液pH>3時，表面電離成≡Si-O-,帶負電荷），因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。2023/2/32.

電滲流（electroosmoticflow，EOF

）電滲現象中整體移動著的流體叫電滲流。速度uos。

當在毛細管兩端施加電壓時，帶正電荷的陽離子向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起管中的溶液整體向負極移動，這種液體相對于固體表面的移動叫電滲。

2023/2/33.

電滲流的速度與方向電滲流的速度用

表示，取決于電滲淌度

和電場強度E，即

在通常的毛細管區帶電泳條件下，電滲流從陽極流向陰極，其大小受電場強度、溶液的極性、Zeta電勢、和介質粘度的影響。在一般情況下，電滲流的速度是電泳速度的5-7倍。實際電泳分析中，可按下式計算

uos=Lef/tos

Lef—毛細管有效長度（毛細管的進樣端至檢測窗的長度）；tos—電滲流標記物（中性物質）的遷移時間。2023/2/3雙電層與zeta電勢

zeta勢一般在10-100mV的數量級

緊密層（sternlayer）—不可移動層擴散層——可移動層為表面電勢為stern電勢，是stern平面與本體溶液間的電勢差。該電勢與所吸附離子的性質和數量有關。切變平面與本體溶液間的電勢差稱為Zeta電勢（），該電勢與擴散層的厚度成正比。而擴散層的厚度又與溶液組成、離子的強度有關，離子強度越大，擴散層的厚度越薄。2023/2/32023/2/32023/2/3電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質：內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；

石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；

（2）加電滲流反轉劑內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。2023/2/34.電滲流的流形電滲流的流動為塞式流動（塞流）（譜帶展寬很小）；高效液相色譜中的溶液流動為層流（壓力流），拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。2023/2/35.電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的實際遷移速度為：

陽離子:電泳方向與電滲流方向一致（uef>0，

uos>0，uap0

）,實際遷移速度最大,最先流出柱.

中性粒子:uef=0，uap=uos,隨電滲流同行,中間流出柱.

陰離子:電泳方向與電滲流相反,最后流出柱或無法流出柱.

陽離子陰離子中性分子uos>uef，uap>0，在中性分子之后流出；

uos<uef

，uap<0，被陰極排斥，無法流出。2023/2/3因此，在CE中:①利用EOF可將陽離子、陰離子和中性粒子一起朝一個方向（如陰極方向）產生差速遷移，并可在一次操作中完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離分析。②此外，改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速。2023/2/3三表觀淌度和權均淌度表觀遷移速度：表觀淌度：

ap

為單位場強下粒子的實際遷移速度

問題：由于樣品中不同結構的中性分子的表觀淌度都等于電滲流速度，無法相互分離!

解決措施：毛細管內壁改性或在緩沖溶液中添加添加劑。2023/2/3

在毛細管內除了緩沖溶液s以外，如果在毛細管內再引入另一相（比如膠束、高分子團等準固定相或色譜固定相）P。這就有可能使樣品組分在電遷移過程中發生相間分配（分配系數為Kp），從而導致遷移速度或淌度發生變化。

這種改變了的遷移速度和淌度，稱之為加權平均速度和加權平均淌度，簡稱為權均速度（u）和權均淌度（）。設相分配過程快于電泳過程，則有

權均淌度2023/2/3

式中μp為P相的表觀淌度，kp為容量因子

np和ns分別為樣品在P相和溶劑中的分子數注意：P相在電場中可靜止，也可遷移，運動方向可正、可負，這與純色譜不同。利用兩相分配，能使中性組分產生不同的權均淌度，因而可以分離。2023/2/3四、分離效率和分離度

1.理論塔板數和塔板高度由于只有粒子的縱向擴散項，所以板高方程為

由上式可見：①理論塔板數n與外加電壓V或電場強度、電滲淌度成正比，提高電場強度或電滲淌度可提高柱效。②擴散系數D小的組分，柱效高。所以CE特別適合分離生物大分子。2023/2/3帶來的問題：增加電場強度→產生焦耳熱。

解決方法：使用很細內徑的毛細管。

Knox等人研究指出：

d為管徑，c為介質濃度。在E=50kv·m-1，c=0.01mol·L-1的常規條件下，求得d值小于140μm。

即當d小于140μm，自熱就不會引起太嚴重的譜帶展寬和效率損失。

毛細管柱的分離效率可直接由電泳圖譜求出，并按下式計算2023/2/3（二）.分離度

分離度可由譜圖直接按下式計算：或∵E=V/L∴影響分離度的主要因素；①工作電壓V；②毛細管有效長度與總長度比；③相鄰兩個組分的有效電泳淌度之差；④電滲淌度。2023/2/3第13章

毛細管電泳法一、毛細管電泳儀capillaryelectrophoresisapparatus二、流程與主要部件processandmainassembly三、進樣方式injectionmethod第3節

毛細管電泳儀capillaryelectrophoresis,CEcapillaryelectrophoresisapparatus2023/2/3高效毛細管電泳儀

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus2023/2/3儀器22023/2/3儀器32023/2/3主要部件（mainassembly）

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21

mol/L）2023/2/3一.高壓電源（1）0～30

kV穩定、連續可調的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電壓穩定性：0.1%；（4）電源極性易轉換；二、電極槽

CE的電極通常由直徑0.5~1mm的鉑絲制成，電極槽通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑料瓶（1~5mL不等），要便于密封。2023/2/3三、進樣系統

injectionmethodof

HPCE

由于毛細管柱的柱體積一般只有4~5μL，因此進樣體積只能數納升或更小。進樣方式：柱頭進樣法（無死體積進樣法）。即讓毛細管直接與樣品接觸，然后通過重力、電場力或其他動力驅動使樣品導入毛細管柱內。

進樣方法主要有下列三種：2023/2/3將毛細管一端插入樣品瓶，然后施加電壓。組分就會因電遷移和電滲作用而進入管內。

1.電動力學進樣法

進樣不均：電歧視現象，淌度大的離子比淌度大的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；

特別適合黏度大的試樣；2023/2/32.壓力進樣

（1）進樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣3.擴散進樣試樣通過擴散作用進入分離柱內。優點：不存在組分的電歧視現象2023/2/3四.毛細管柱系統

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；（2）規格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度30～100cm。柱型：開口毛細管柱、凝膠柱及電色譜柱等類別2023/2/3五.檢測器

由于進樣量很小，為提高檢測的靈敏度與分離效率，一般采用柱上檢測。

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；2023/2/3第13章

毛細管電泳法一、毛細管區帶電泳(CZE)capillaryzoneelectrophoresis二、膠束電動毛細管色譜(MECK)micellarelectrokineticchromatography三、毛細管凝膠電泳(CGE)capillarygelelectrophoresis四、毛細管電色譜(CEC)capillaryelectrochromatography五、非水毛細管電泳(NAGE)non-aqueouscapillaryelectrophoresis第4節

毛細管電泳分離模式capillaryelectrophoresis,CEseparatetypesofCE

2023/2/3分離模式毛細管區帶電泳CZE膠束電動毛細管色譜MEKC微乳液電動毛細管色譜MEECC毛細管凝膠電泳CGE毛細管等電聚焦CIEF毛細管電色譜CEC非水毛細管電泳

NACE2023/2/3一、毛細管區帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

陽離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出。中性粒子：無電泳現象，隨電滲流同行，在陽離子后流出。但不同結構的中性分子無法相互分離。

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出。相反時，無法流出

最基本、應用最廣的分離模式；在含有緩沖溶液的毛細管中進行的電泳，其分離原理是電泳淌度的差別。2023/2/32023/2/3操作條件的選擇工作電壓

柱效隨工作電壓的增大而增高，但工作電壓增加，工作電流也增大，焦耳熱的影響加劇，柱效反而下降。

一般通過作I—V曲線來選擇體系的最佳外加電壓值。2.緩沖液的選擇2023/2/3（1）緩沖液的種類

直接影響粒子的遷移和最后的分離一般應考慮：①所選擇的pH值范圍內有很好的緩沖容量。②檢測波長的吸收低。③自身的淌度低，即分子大而電荷小，以減少電流的產生。④為了達到有效的進樣和合適的電泳淌度，緩沖液的pH值至少必須比分析物質的等電點高或低1個pH單位。⑤只要條件允許就盡可能采用酸性緩沖液，在低pH值下，吸附和電滲流值都很小，毛細管涂層的壽命較長。一般多采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液。2023/2/3（2）緩沖液的pH值pH值增大，表觀淌度增大，分離時間縮短，柱效提高。緩沖溶液的離子強度增大，電滲流減小，遷移時間延長。對于遷移時間較短的組分，其柱效隨濃度的增加而明顯增大。（3）緩沖溶液的離子強度或濃度（4）緩沖溶液添加劑在緩沖溶液中適當添加其它試劑，如表面活性劑、有機溶劑、中性鹽類、兩性物質和手性選擇劑等，可以改善柱效，改變選擇性，進而改善分離度。2023/2/3圖13-7金銀花樣品的毛細管電泳指紋圖譜８（s）.綠原酸2023/2/32023/2/3藥物分析

analysisofpharmaceutics2023/2/3應用實例

1.CZE測定葛根及其制劑正心泰膠囊中葛根素的含量

緩沖液為3Ommol／L硼砂緩沖溶液(pH9.37)，電壓30kV，檢測波長254nm，雙氯滅痛為內標物。葛根素的線性范圍10～100g／ml，回收率為97.53%，RSD為0.9%(n=5)。

2.CZE測定枸櫞酸苷多芬的含量

采用40cm×75μm毛細管柱，以粉防己堿為內標，25mmol／L硼砂(pH7.89)為緩沖液，電壓14kV，紫外檢測器，檢測波長214nm，在4min內可完成枸櫞酸苷多芬與內標物的分離和測定，最低檢測濃度為5g／ml，在24～48g／ml范圍內線性關系良好(r一0.9998)，日內RSD<1.58％，日間RSD<2.46%，回收率為95%～105%。

2023/2/33.CZE測定三烯酸腺苷二鈉制劑含量及有關物質

采用熔融石英毛細管柱，以0.025mol／L磷酸氫二鈉(pH10.2)為緩沖液，檢測波長為214nm，電壓21kV的條件下進行定量分析。三烯酸腺苷二鈉的線性范圍為0.3～2.0mg／ml，(r=0.9939)，回收率99.1%，RSD<2.0，最小檢出濃度0.5g／ml。

4.CZE拆分布洛芬對應體異構體

以20mmol／L硫酸鹽為運行緩沖液(pH7.1)，50mmol／Lβ-CD和3Ommol／L去氧膽酸鈉(SDC)為手性選擇試劑，石英毛細管柱47cm×75μm，二級管陣列檢測器，214nm處檢測，運行電壓12kV，溫度23℃，布洛芬的加樣回收率分別為97.8%和101.4%，RSD分別為0.14%和0.26%。

2023/2/31.膠束準固定相：在含有緩沖溶液的毛細管中加入離子型表面活性劑，當濃度增加到一定程度時，表面活性劑分子在溶液中形成疏水基向內，親水基向外的多分子聚集體，稱作膠束。形成膠束的最低濃度被稱作臨界膠束濃度（criticalmicellarconcentration,CMC）。低于該濃度時，主要是以單個分子或離子狀態存在。二、膠束電動毛細管色譜（MEKC）

micellarelectrokineticchromatography，MEKC

由于CZE無法分離不同結構的中性分子，為了分離不同結構的中性分子，發展了MEKC。該法集電泳、電滲與分配于一體，是一種電泳技術與色譜技術相結合的分離方法，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍。如十二烷基硫酸鈉所形成的帶負電荷的球體—膠束。2023/2/3

在MEKC系統中，存在類似于色譜的兩相：一是流動的水相，另一是起到固定相作用的膠束相。由于該相（“固定相”）是可移動的，這種移動的“固定相”被稱之為準固定相或假固定相。2．分離原理在MEKC中，中性溶質按其疏水性不同，在緩沖溶液（水相）和膠束（準固定相）之間分配。疏水性強的溶質分配到膠束中的多，Kp大；反之，親水性強的溶質分配到膠束中的少，Kp小。當溶質進入膠束時，以膠束的速度向陰極遷移；溶質進入緩沖溶液時，以電滲的速度向陰極遷移。在膠束中分配系數越大的溶質，在柱中遷移時間越長。從而使疏水性稍有差別的不同中性物質在電泳中得以分離。2023/2/3疏水性強的溶質后流出，疏水性弱的溶質先流出

3.應用MEKC在天然藥物和中成藥的有效成分分析中最具特色，它可以排除高含量組分的基本干擾，能分離CZE無法分離的電中性化合物，適用于天然藥物中各種復雜組分的測定。中藥的有效成分種類繁多，MEKC目前主要用于生物堿、黃酮類、葸醌類、苷類化合物等各種成分的分離。2023/2/3三、毛細管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。2023/2/3

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以電滲流為流動相，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程。四、毛細管電色譜

capillaryelectrochromatography，CEC五、非水毛細管電泳（NACE）non-aqueouscapillaryelectrophoresis在有機溶劑為主要的非水體系中進行的毛細管電泳。2023/2/3思考題1.簡述毛細管電泳的分離機制和特點以及與色譜的區別。2.請用色譜基本理論來解釋CE能實現高效和高速分離的原因。3.在CE中影響譜帶展寬的因素有哪些？4.MECC和CZE的區別是什么？5.設某CE系統的電壓為25kV，柱長Ld為55cm，某離子的擴散系數為2.0×10-9

m2/s，該離子通過柱的時間是10min。求該毛細管柱的理論塔板數。6.設某CZE系統的毛細管長度L=65cm，由進樣口至檢測器長度Ld=58cm，分離電壓V=20kV，擴散系數D=5.0×10-5

cm2/s。測得某中性分子A的遷移時間是9.96min。①求出該系統的電滲淌度；②求電泳淌度為2.0×10-5cm2/(Vs)的陰離子B的遷移時間；③以A計算的理論塔板數；④求A和B的分離度。2023/2/3第十一章

高效毛細管電泳分析法一、離子分析analysisofion二、藥物分析analysisofpharmaceutics三、手性化合物分析analysisofchiralcompounds四、氨基酸分析analysisofaminoacids五、核酸分析及DNA測序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA六、新進展及熱點問題advancesandspecialtopics第五節

高效毛細管電泳應用與進展highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEapplic