第四章發酵工業的無菌技術本章講述的內容第一節發酵工業的無菌處理第二節發酵過程中的染菌與防治第三節發酵工業的無菌技術第四節發酵培養基及設備管道的滅菌第五節空氣除菌第三節發酵工業的無菌技術加熱滅菌（包括干熱和濕熱加熱法）過濾除菌紫外線或電離輻射殺菌化學藥物滅菌火焰滅菌無菌技術：第四節

發酵培養基及設備管道的滅菌一、培養基濕熱滅菌原理1、微生物的熱阻

每一種微生物都有一定的生長溫度范圍；當微生物處在最低生長溫度以下，代謝作用幾乎停止，而處于休眠狀態；當溫度超過最高限度時，細胞中原生質體和酶的基本成分就發生不可逆的變性，使微生物死亡。殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度（Deathtemperature）在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間(ThermalDeathTime;TDT)在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。不同種類微生物對熱的抵抗力不同。微生物對熱的抵抗力稱為熱阻（heatresistance）。即指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間，它反映了微生物對溫度的敏感性。

微生物相對熱阻細菌和酵母的營養細胞1細菌芽孢3×106霉菌孢子2-10病毒及噬菌體1-5某些微生物對濕熱的相對熱阻（與大腸桿菌比較）相對熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值

。2、微生物的熱死規律——對數殘留定律

微生物的熱死是指微生物的受熱失活，但物理性質不變。

微生物雖然是一復雜的高分子體系，但受熱死亡是由于蛋白質變性所致。

在一定溫度下，微生物熱死遵循分子反應速度理論。對數殘留定律的概念：

數學表達式：-dN/d=NN——培養基中殘存活的微生物個數；

——死亡時間，即殺菌時間（s）;

——比死亡速率（s-1）(死亡速率常數)dN/d——微生物的瞬間變化率，即死亡速率——

對微生物進行濕熱滅菌時，培養基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的微生物數量成正比，這就是對數殘留定律。

若開始滅菌（=0）時，培養基中活的微生物數為N0=2.303logN0/N/-dN/d=NlnN/N0=-積分2.303logN0/N=or=2.303lgN0/N/可見：滅菌時間取決于污染程度(N0)、滅菌程度（殘留菌數N）和值◆

在培養基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。一般只考慮芽孢細菌和細菌的芽孢數之和作為計算依據。◆

滅菌程度，即殘留菌數，如果要求完全徹底滅菌，即

N=0，則為∞，上式無意義，事實上也不可能。

一般取N=0.001，即1000次滅菌中允許有1次失敗。例：

有一發酵罐內裝40m3培養基，在121℃溫度下進行實罐滅菌。原污染程度為每ml有2×105個耐熱細菌芽孢，121℃時滅菌死亡速度常數為1.8min－1。求滅菌失敗幾率為0.001時所需的滅菌時間。解：N0=40×106×2×105=8×1012(個)N=0.001;=1.8(min－1)

=2.303lgN0N=2.3031.8lg(8×1015)=20.34(min)滅菌時間——到達殺菌溫度后所需要維持的時間。3、死亡速率常數（比死亡速率）◆

死亡速率常數是微生物耐熱性的一種特征，它隨微生物種類和滅菌溫度而異。◆

相同溫度下，值越小，則此微生物越耐熱。如：在121℃，細菌芽孢的值約為1min-1,而營養細胞的值為10－1010min-1。=2.303lgN0/N/細菌芽孢名稱值min-1枯草芽孢桿菌FS5230硬脂嗜熱芽孢桿菌FS1518硬脂嗜熱芽孢桿菌FS617產氣梭狀芽孢桿菌PA36793.8-2.60.772.91.8121℃某些細菌芽孢的值4、滅菌溫度與時間的選擇◆

培養基滅菌過程中，除微生物被殺死外，還伴隨著培養基成分被破壞，如在加熱條件下氨基酸、維生素等受破壞。◆

培養基滅菌時，必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養基成分破壞減至最少的條件。◆

滅菌過程微生物死亡屬于一級反應動力學類型（從對數殘留定律表達式可知）。◆

在其它條件不變時，比死亡速率與溫度的關系可用阿侖尼烏斯方程式表示。SvanteAugustArrhenius

wasaSwedishphysicalchemistbestknownforhistheorythatelectrolytes,certainsubstancesthatdissolveinwatertoyieldasolutionthatconductselectricity,areseparated,ordissociated,intoelectricallychargedparticles,orions,evenwhenthereisnocurrentflowingthroughthesolution.In1903hewasawardedtheNobelPrizeforChemistry.=AeRT

E－——ArrheniusequationA—比例常數；E—殺死細菌所需的活化能，（J/mol）;T—絕對溫度，(K)R—氣體常數，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)=AeRTE－——lg=———+lgA－E2.303RT以lg對1/T作圖，得一直線，其斜率為-

E/2.303R，截距為lgA，從斜率和截距科求得A和

E值。1/Tlg截距=lgA斜率=－E

/2.303R培養基成分受熱破壞是化學分解反應，也為一級動力學反應：-dC/d=′CC—對熱不穩定物質的濃度,(mol/L);′—分解速率常數（s－1）；—分解反應時間（s）′隨反應物質種類和溫度不同而不同。在化學反應中，其他條件不變，′和溫度的關系也可用阿侖尼烏斯方程表示：′=A′eRTE

′－—A′—比例常數；E

′—分解活化能，（J/mol）;T—絕對溫度，(K)R—氣體常數，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)1=AeRT1E－———2=Ae－——ERT2相除取對數ln21=E11RT1T2－〔〕在滅菌時，當溫度變化，雜菌死亡速率常數和培養基成分破壞速率常數′都在發生變化。溫度由T1升高到T2，值分別為：同樣，滅菌時培養基成分的破壞也可得類似關系：ln2′1′=〔〕RT1T2

E

′11ln(2

/1)ln(2′

/1′)＝EE

′上面兩式相除，得由于滅菌的E值大于培養基成分分解的E′值，因此：ln2/1＞ln2′/1′名稱E(J/mol）葉酸泛酸維生素B12維生素B1嗜熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌肉毒梭菌70.387.996.792.1283318343

即隨著溫度的上升，滅菌的速度常數的增加倍數大于培養基成分破壞的增加倍數。或者說，當滅菌溫度上升時，微生物殺滅速度的上升超過培養基成分破壞的速度。也即，為達到相同的滅菌效果，提高滅菌溫度可以明顯縮短滅菌時間。

根據這一理論，培養基滅菌采用高溫短時的方法，有利于減少營養成分的破壞。

滅菌溫度/℃滅菌時間/min維生素B1破壞量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.01＜1（1）、pH◆

微生物在pH6.0～8.0范圍內耐熱性最大◆

pH低于6.0時，氫離子極易滲入微生物細胞，從而改變細胞的生理反應而促進其死亡，故培養基酸度愈高，則所需的殺菌時間愈短。5、影響培養基滅菌的其它因素

溫度孢子數滅菌時間(min)(℃)(個/ml)pH=6.15.35.04.74.51201000087533

11510000252516131311010000706535302410010000740720180150150

pH對滅菌時間的影響（2）、起始菌的濃度起始濃度越高，所需滅菌時間越長。例如：如肉毒梭狀芽孢桿菌，在105℃濕熱滅菌時間

芽孢桿菌數/ml時間(min)9×108489×106369×104209×1021492

=2.303lgN0/N/（3）、培養基成分◆

油脂、糖類及一定濃度的蛋白質會增加微生物的耐熱性。

因高濃度有機物會環繞細菌的四周形成一層薄膜，影響熱的傳入。◆

而高濃度的鹽類、色素等則會削弱其抗性。（4）培養基的物理狀態◆固體培養基的滅菌時間比液體培養基的滅菌時間長因液體培養基滅菌時，熱的傳遞除了傳導作用外還有對流作用，而固體培養基只有傳導作用而沒有對流作用。此外，液體培養基的傳熱系數比固體物質大的多。（5）、泡沫

◆泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進培養基去殺死其中潛伏的微生物。

因此，易產生泡沫的培養基在滅菌時，可加入少量消泡劑。（6）、顆粒

◆顆粒小，滅菌容易，顆粒大，滅菌難。二、空罐滅菌1、目的：

1）消除罐內死角，確保下一批發酵的成功。

2）殺滅與罐直接相通的各管路、閥門的微生物。

3）殺滅上批發酵的活的微生物，減輕環境污染。

2、步驟：

（熱蒸汽法）1）先徹底清洗作用：a）有利于消除死角

b）免于物料受熱（尤其是干熱的部位）干焦而集于罐體、管或閥門2）從底部通入蒸汽3）排冷氣4）升壓

打開各個需滅菌的管路、放氣閥等（如接種管、取樣管、空氣進管、流量計等）5）保壓

通常1kg/cm2,30～60min6)降溫

關閉各放氣閥，切斷汽源，慢慢放氣；或自然冷卻，或泵循環水加速冷卻注意:

a）確保無死角產生

b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法

c）勿激碎視鏡三、培養基分批滅菌（實罐滅菌）分批滅菌指在發酵罐中加入培養基后，直接通入蒸汽將培養基和發酵設備一起進行滅菌的過程，也稱實罐滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程。一）操作1、在進行培養基滅菌之前，通常應先把發酵罐的分空氣過濾器滅菌并用無菌空氣吹干。（若已先行空罐滅菌，此步可不進行）2、預熱向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養基加熱至70℃左右。作用：減少冷凝水的生成；減輕噪音。如果是直接通蒸汽，則需通過試驗掌握冷凝水的生成量，確保培養基的濃度。3、開啟蒸汽管，向培養基中通入蒸汽，升溫。4、罐壓達1kg/cm2(0.1MPa)時，安裝在發酵罐封頭的接種管、補料管、消泡劑管等應排汽。升溫階段5、保溫調節好各進汽和排汽閥門，使罐壓和溫度保持在一穩定水平，維持一定時間。在保溫階段，凡進口在培養基液面下的各管道都應通入蒸汽；在液面上的其余管道則應排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。保溫階段6、保溫結束后，依次關閉各排汽、進汽閥；待罐內壓力降至0.5kg/cm2左右時，向罐內通入無菌空氣，向夾套或蛇管中通入冷水，使培養基降至所需溫度。通入無菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內正壓。降溫階段ABCD升溫保溫降溫小型罐升、降溫快，可忽略升、降溫時間；但大型罐不可忽視。℃min二）滅菌時間的計算=2.303lgN0/N/在不同規模的發酵罐中達到同樣滅菌效果所需維持的時間發酵罐規模（升）１２０℃維持時間（分）

20017.550012.6500011.3500008.8為什么罐越大，維持的時間越短？三）分批滅菌的優缺點優點：●

不需專門的滅菌設備，投資少、設備簡單、滅菌效果可靠。●

對蒸汽的要求較低，一般3-4kg/cm2即可滿足。缺點：在滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大◆中小型罐經常采用四、培養基的連續滅菌（連消）

將配制好的培養基在向發酵罐輸送的同時進行加熱、保溫和冷卻等滅菌操作的過程。培養基連消工藝流程圖

溫度（℃）時間（min)12124.81304.11380.721460.141540.0291630.0061滅菌時間與溫度的關系（以殺死細菌芽孢為準）噴淋冷卻連續滅菌流程一）連續滅菌流程1、預熱可在專門的預熱罐，也可用配料罐兼作溫度：一般預熱至70℃左右預熱的物料用泵泵入連消裝置輸料泵：

常用旋渦泵、往復泵、螺桿泵旋渦泵往復泵螺桿泵2、加熱常用連消裝置有三類：

套管式連消器

汽液混合式連消器

噴射式加熱器物料泵入加熱器，培養基與蒸汽混合，溫度迅速上升至130～140℃。套管式連消塔開孔上疏下密，45°小孔，孔徑6毫米左右培養液流動線速度小于0.1m/s;在管內逗留時間為15～20秒

汽液混合式連消器噴射加熱器3、保溫保溫設備（維持設備）保溫材料包裹兩種形式：

罐式管式

1）、維持罐連續滅菌時，關2開1；預熱罐中的物料輸送完后，關1開2。培養基的平均停留時間=V/FM---平均停留時間（s）V---維持罐的體積（m3）FM---培養基的流量（m3/s）Note:

培養基在維持罐的流動不可能非常均勻，可能產生滑流，造成一部分培養基在罐內的停留時間少于平均值。為保證滅菌徹底，在設計罐式維持器時，通常取平均停留時間的3～5倍。經驗：在滅菌溫度為130℃時，實際平均時間可取10分鐘；在140℃時則可取3～4分鐘。2）、管式維持器在設計管式維持設備時，須采用停留時間分布的概念，而不能采用單純的停留時間。圓管內不同流動形式流體的速度分布情況

湍流

Vaverage=0.82Vmax

活塞流

Vaverage=Vmax

粘滯流

Vaverage=0.5Vmax

在管式維持器中，若培養基流動為活塞流，可根據維持管的內徑、培養基的流量求出管長。

但實際上培養基不可能呈活塞流，當培養基處于粘滯留狀態時，管內速度呈拋物線，管中心部位的最大流速為平均流速的2倍；若以平均流速確定管長，則會造成邊緣部分的培養基過熱（加熱過長）。

確定維持管的長度，應采用擴散模型(Dispersionmodel).（復雜，略）4、冷卻噴淋冷卻器板式冷卻器真空冷卻器噴淋冷卻器結構簡單；廣泛使用板式換熱器體積小，換熱效率高；但流動阻力較大板式換熱器板式換熱器原理圖二）連續滅菌的優缺點及注意事項1）可采用高溫短時滅菌，培養基受熱時間短，營養成分破壞少，有利于提高發酵產率；2）蒸汽負荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便。3）適于自動控制，降低勞動強度。缺點：

設備復雜，投資大優點：連消注意事項：1）連消前，應先進行空罐、維持罐（管）、冷卻系統的滅菌；2）確保管路無滲漏；3）當培養基含有較大固體顆粒或有較多泡沫時，采用連消容易發生滅菌不徹底。第五節空氣除菌（一）概述

空氣除菌的必要性

以一個50m3的發酵罐為例，若裝料系數為0.7，要求每立方米發酵液每分鐘通氣0.8m3，培養周期170h，那么每個周期需通氣量2.86×105

m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大氣中約有103-104個微生物。無菌空氣的概念發酵工業應用的“無菌空氣”是指：通過除菌處理使空氣中含菌量降低到一個極低的百分數，從而能控制發酵污染至極小機會，此種空氣稱為“無菌空氣”。發酵對無菌空氣的要求是：無菌，無灰塵，無雜質，無水，無油，正壓等幾項指標；發酵對無菌空氣的無菌程度要求是：只要在發酵過程中不因無菌空氣染菌，而造成損失即可。輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β射線、γ射線、紫外線(2265?-3287?)加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機產生的熱量靜電除菌：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。過濾除菌：采用定期滅菌的介質來阻截流過的空氣所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、有機和無機燒結材料等等。

（二）空氣除菌方法（三)、空氣除菌流程不同的發酵、不同的工廠采用的工藝不盡相同。流程的制定應根據所在地的地理、氣候環境和設備條件綜合考慮環境污染比較嚴重的地方，要考慮改變吸風的條件；在溫暖潮濕的南方，要加強除水設施；壓縮機耗油嚴重的設備流程中則要加強消除油霧的污染，也可采用無油潤滑的往復式壓縮機；往復式壓縮機，要配備前置粗過濾器及空氣貯罐。通常要求壓縮空氣的相對濕度Φ=50%-60%時通過過濾器為好。1、空氣過濾除菌流程的要求2.

空氣除菌流程的分析幾種典型的設備流程：兩級冷卻、加熱除菌流程冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程高效前置過濾空氣除菌流程將空氣冷卻至露點以上的流程利用熱空氣加熱冷空氣流程一次冷卻和析水的空氣過濾流程

兩級冷卻、加熱的空氣過濾除菌流程流程的特點是：兩次冷卻，兩次分離，適當加熱。１—粗過濾器,２—壓縮機,３—貯罐,４,６—冷卻器,５—旋風分離器,７—絲網分離器,８—加熱器,９—過濾器冷熱空氣直接混合式空氣過濾除菌流程特點：可省第二冷卻分離設備和空氣再加熱設備，流程比較簡單，冷卻水用量較少，利用壓縮空氣的熱量來提高空氣溫度。

冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程圖1-粗過濾器；2-壓縮機；3-貯罐；4-冷卻器；5-絲網分離器；6-過濾器

利用熱空氣加熱冷空氣的流程示意圖1-高空采風；2-粗過濾器；3-壓縮機；4-熱交換器；5-冷卻器；6，7-析水器；8-空氣總過濾器；9-空氣分過濾器

將空氣冷卻至露點以上的流程1－高空采風；2－粗過濾器；3－壓縮機；4－冷卻器；5－冷卻器；6－空氣總過濾器；7－空氣分過濾器

高效前置過濾空氣除菌流程圖1—高效前置過濾器；2—壓縮機；3—貯罐；4—冷卻器；5—絲網分離器；6—加熱器；7—過濾器特點：無菌程度高

一次冷卻和析水的空氣過濾流程示意圖1－高空采風；2－粗過濾器；3－壓縮機；4－冷卻器；5，6—析水器；7—貯罐；8—加熱器；9—空氣總過濾器；10—空氣分過濾器（四）空氣預處理除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和濾器壽命；降溫：防燒傷介質及水分蒸發嚴重，對發酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長菌堵塞（因水滴）加熱：保持相對濕度穩壓：防止壓力波動，貯罐預處理流程設計的簡繁關鍵：去濕問題措施：建吸風塔、粗過濾器（布袋過濾器、填料過濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置等）、高效前置過濾器1、空氣預處理方法將濾布縫制成與骨架相同形狀的布袋，繃緊縫于焊接在進風口的骨架上。多用毛質絨布或合成纖維濾布；濾布應定期更換。結構簡單，過濾效率高；但過濾阻力大布袋式過濾器油浴洗滌過濾器空氣通過油箱中的油層洗滌，空氣中的微粒被油黏附而逐漸沉降于油箱底部而被除去。百葉窗式的圓盤可分離大滴油霧，過濾網分離小顆粒油霧。效果好；但耗油多水霧除塵過濾器空氣從設備底部進口管吸入，經裝置上部噴下的水霧洗滌，空氣中的灰塵、微生物微粒被黏附沉降，從器底排出。空氣流速1-3m/s，太高則帶入水霧太多，降低空壓機的排氣量。過濾機理大型空壓機2、空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻

空氣的壓縮過程可看作絕熱過程，故壓縮后的空氣溫度與被壓縮的程度有關：

T2=T1(P2/P1)(k-1)/k

式中T1,T2——壓縮前后空氣的絕對溫度，K。P1,P2——壓縮前后空氣的絕對壓強，Pa。k——絕熱指數，空氣為1.4。

若壓縮為多變過程，則可用多變指數m（對于空氣m=1.2-1.3）代替絕熱指數k。例3：20oC的大氣被壓縮至表壓2.5kg/cm2時溫度是多少？解：T1=20+273=293kP2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42m=1.3T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=293×3.420.3/1.3=389k

∴t2=389-273=116oC空氣預處理流程設計3.

幾個概念空氣的絕對濕度：1m3

濕空氣中含有的水蒸氣絕對量(kg)空氣的相對濕度（Φ）：空氣的絕對濕度與同溫度下飽和絕對濕度之比值或者空氣中水蒸汽分壓與同溫度時的飽和水蒸汽壓之比值，稱為空氣的相對濕度。

Φ=Pw/Ps

式中

Pw——空氣中水蒸氣分壓，

Pa

Ps——同溫度下水的飽和蒸氣壓，Pa，

它可由各類手冊中查到。空氣的濕含量（X）：1kg干空氣中含有的水汽量

（kg/kg干空氣）空氣的濕含量（X）

設Ggkg干空氣中含Gwkg水蒸汽時，則

X=Gw/Gg

又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg)=(Gw/Gg)·(Mg/Mw)

（Mw，Mg分別為水和空氣的分子量）∴X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)·(Pw/Pg)=0.622Pw/(P-Pw)Φ與X的關系

將ΦPs=Pw代入式4-1中得

X=0.622ΦPs/（P-ΦPs）所以，已知某一溫度T時Φ值，便可求得X。①當X一定時，T1→T2，導致Φ1→Φ2

，則X1=0.622Φ1Ps1/(P1-Φ1Ps1)X2=0.622Φ2Ps2/(P2-Φ2Ps2)∵X1=X2∴Φ2=Φ1(PS1/PS2)(P2/P1)

（式4-2）②當X發生變化，即有水析出時，X降低，此時Φ2=100%，

定義：當Ф=1時，空氣中水蒸氣已飽和，此時溫度稱為露點Td。當T<Td時，有水析出，X↓。當ΔX=0時，壓縮過程中，隨著T↑，Ps↑，P↑，Ф↓；降溫過程中，隨著T↓，Ps↓，P一定，Ф↑

。加熱后空氣的溫度設析出水后，在升溫階段ΔX=0，根據式4-2可以求出析水后應升溫到多少度才能滿足相對濕度保持50-60%。

∵Φ后=ΦdPsd/Ps后∴Ps后=ΦdPsd/Φ后

Ps后→T后１—粗過濾器,２—壓縮機,３—貯罐,４,６—冷卻器,５—旋風分離器,７—絲網分離器,８—加熱器,９—過濾器例4：溫度20℃、Φ=85%的空氣，當壓縮至2.0kg/cm2時，溫度為120℃，求此時空氣相對濕度是多少？若在壓力不變的情況下將溫度冷卻至40℃后，相對濕度又是多少？

已知：20℃時，Ps1=0.0238kg/cm2,120℃時，P