第6章熒光分析法用熒光抗體染色之原生動物澳大利亞科學家最新發現，一種叫“螳螂蝦”的海里動物通過發出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對者或者吸引性配偶，

主要內容基本原理1熒光分光光度計2分析方法3概述熒光：物質分子吸收光子能量被激發后從激發態的最低振動能級返回到基態時所發射出的光。熒光分析法特點：靈敏度高，比UV-Vis的靈敏度高得多；選擇性好；應用不廣泛，主要是因為能發熒光的物質不具普遍性。熒光分析法：根據物質的熒光譜線位置和強度進行物質鑒定和物質含量測定的方法。概述分子和原子均可產生熒光：X射線熒光分析法——原子受X射線激發原子熒光分析法——原子特征譜線激發熒光分析法——紫外-可見光激發概述基態分子吸收一定能量后，躍遷至激發態，當激發態分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態時，便產生分子發射光譜。依據激發的模式不同，分子發光分為光致發光（按激發的類型又可分為熒光和磷光兩種）、熱致發光、場致發光和化學發光等。光致發光：分子、原子吸收光輻射時被激發，然后再發射出與吸收的波長相同或更長光的現象。

按分子激發態的類型劃分時，由第一激發單重態所產生的輻射躍遷而伴隨的發光現象稱為熒光。

由最低的電子激發三重態所產生的輻射躍遷，其發光現象稱為磷光。概述1.1基本原理（1）分子中電子的激發過程

在每個電子能級上，都存在振動、轉動能級。1.基本原理

基態(S0)→激發態(S1、S2、激發態振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位。

激發態→基態：多種途徑和方式；速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢。1.基本原理在光致激發和電激發光的過程中，分子中的價電子可以處在不同的自旋狀態，可用電子自旋狀態的多重性來描述。多重性(multiplicy,M)：電子自旋的狀態單重態(singletstate,Sn)：分子中所有電子自旋都相反，自旋配對的電子態(M=1)三重態(tripletstate,Tn)：分子中電子對的電子自旋平行的電子態(M=3)1.基本原理電子激發態的多重性：M=2S+1

S為電子自旋量子數的代數和(0或1)；大多數有機分子的基態處于單重態（Pauli不相容原理）。

1.基本原理分立軌道上的平行自旋比成對自旋穩定(洪特規則)，三重態能級比相應單重態能級低。S0→S1、S2允許躍遷；S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進入；進入的幾率小；1.基本原理1.基本原理（2）分子熒光的產生

處于激發態分子不穩定，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式去活化過程返回至基態。輻射躍遷方式熒光發射：處于第一激發單重態的最低振動能級的分子以輻射躍遷的形式返回基態各振動能級（S1→S0躍遷）時，產生熒光。磷光發射：電子由第一激發三重態的最低振動能級→基態（T1

→S0躍遷）。1.基本原理振動弛豫：同一電子能級內以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。內轉換：能量差較小的激發態之間，部分能量重疊，激發態由高電子能級轉移至低電子能級的無輻射能級交換。外轉換：激發分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷；外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。體系間跨越：不同多重態,有重疊的振動能級間的非輻射躍遷。無輻射躍遷方式1.基本原理1.基本原理

電子處于激發態是不穩定狀態，返回基態時，通過輻射躍遷(發光)和無輻射躍遷等方式失去能量；

激發態停留時間短、返回速度快的途徑，發生的幾率大，發光強度相對大；1.基本原理輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內轉移外轉移系間跨越振動弛預無輻射躍遷傳遞途徑1.基本原理（3）熒光和磷光的區別發光機制發光時間發光波長應用面熒光單重態單重態10-8-10-14s能量大，波長較短廣泛磷光三重態單重態10-4-10s能量小，波長較長采用液氮在冷凍條件下檢測1.2熒光光譜的類型和特征1）激發光譜和發射光譜任何因熒光化合物都具有兩種特征光譜：

激發光譜和發射光譜1.基本原理熒光激發光譜（激發光譜）

通過測量熒光體的發光通量隨波長變化而獲得的光譜，它反映了不同激發光引起熒光的相對效率。激發光譜可供鑒別熒光物質，在進行熒光測定時供選擇適宜的激發波長。1.基本原理熒光發射光譜

又稱熒光光譜，如果激發光的波長和強度保持不變，而讓熒光物質所產生的熒光通過發射單色器后，照射于檢測器上，掃描發射單色器并檢測各種波長下相應的熒光強度，然后通過記錄儀記錄熒光強度對發射波長的的關系曲線，所得到的譜圖。熒光光譜表示在所發射的熒光中各種波長組分的相對強度。熒光光譜可供鑒別熒光物質，并作為在熒光測定時選擇適當的測定波長或濾光片的根據。1.基本原理激發λ、ε熒光λ圖形激發光譜變不變F~λex圖發射光譜不變變F~λem圖激發光譜：反應了不同激發波長激發熒光的相對效率；發射光譜：反應了不同發射波長激發熒光的相對效率。1.基本原理2）熒光光譜特征①Stokes位移在溶液中，分子熒光的發射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去轉動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。因此，在激發和發射之間產生了能量損失。1.基本原理②熒光發射光譜的形狀與激發波長無關

因為分子吸收了不同能量的光子可以由基態激發到幾個不同的電子激發態，而具有幾個吸收帶。在熒光發射時，不論用哪一個波長的光輻射激發，電子都從第一電子激發態的最低振動能層返回到基態，所以熒光發射光譜只有一個發射帶，與激發波長無關。1.基本原理③熒光光譜與激發光譜的鏡像關系通常熒光發射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關系。吸收光譜是物質分子由基態激發至第一電子激發態的各振動能層形成的。其形狀決定于第一電子激發態中各振動能層的分布情況。1.基本原理1.基本原理1.3影響熒光強度的因素（1）熒光效率與熒光產生的條件1）熒光壽命當激發停止后,分子的熒光強度降到激發時最大強度的1/e所需的時間稱為熒光壽命，常用f表示。一般熒光物質的εmax為103~105，所以熒光壽命常為10-10~10-8s,利用分子熒光壽命的差別，可以進行熒光混合物的分析。1.基本原理2）熒光效率激發態分子發射熒光的光子數與基態分子吸收激發光的光子數之比，常用f表示：f(0~1)，f大的有熒光發射1.基本原理①強紫外-可見吸收②一定的熒光效率

π→π*躍遷強吸收帶

n→π*躍遷弱吸收帶存在共軛的π→π*躍遷，f高，熒光強度大。3）產生熒光的必備條件1.基本原理①共軛效應提高共軛度利于增加熒光效率并產生紅移。絕大多數能產生熒光的物質都含有芳香環或雜環，因為芳香環或雜環分子具有長共軛的π→π*躍遷。π電子共軛程度越大，熒光強度（熒光效率）越大，而熒光波長也長移。

（2）影響熒光強度的結構因素1.基本原理②分子的剛性與共平面性在同樣的長共軛分子中，分子的剛性和共平面性越大，熒光率越大，并且熒光波長產生長移。多數具有剛性平面結構的有機分子具有強烈的熒光。因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。1.基本原理1.基本原理③取代基效應取代基的性質對熒光體的熒光特性和強度均有強烈影響。苯環上的取代基會引起最大吸收波長的位移及相應熒光峰的改變。通常給電子基團，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3

和-N(CH3)2

等，使熒光增強。因為產生了p-共軛作用，增強了電子共軛程度，使最低激發單重態與基態之間的躍遷幾率增大。吸電子基團，如－Cl、－Br、－I、-NHCOCH3、－NO2

和－COOH，使熒光減弱。具有剛性結構的分子容易產生熒光。1.基本原理（3）影響熒光強度的外部因素①溫度溫度升高，熒光物質的熒光效率和熒光強度下降。

其中一個原因是分子的內部能量轉化作用。當激發分子接受額外熱能時，有可能使激發能轉換為基態的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是碰撞頻率增加，使外轉換的去活幾率增加。1.基本原理溶劑極性增大，熒光波長隨著而長移，熒光強度增強。這是因為在極性溶劑中，ππ*躍遷所需的能量差△E小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強度也增強。②溶劑1.基本原理溶劑粘度減小，熒光強度減弱。溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強度下降。②溶劑1.基本原理③pH值的影響帶有酸性或堿性官能團的大多數芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關。具有酸性或堿性基團的有機物質，在不同pH值時，其結構可能發生變化，因而熒光強度將發生改變；對無機熒光物質，因pH值會影響其穩定性，因而也可使其熒光強度發生改變。

對于金屬離子與有機試劑形成的發光鏊合物，一方面pH會影響鏊合物的形成，另一方面還會影響鏊合物的組成，因而影響它們的熒光性質。1.基本原理④

熒光熄滅劑的影響熒光熄滅是指熒光物質分子與溶劑分子或溶質分子相互作用引起熒光強度降低的現象。引起熒光熄滅的物質稱為熒光熄滅劑。常見的熒光熄滅劑有鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物。1.基本原理在濃度較高的熒光物質溶液中，單重激發態的分子在發生熒光之前和未激發的熒光物質分子碰撞而引起的自熄滅現象。i.碰撞猝滅有些熒光物質分子在溶液濃度較高時會形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發生變化，也引起溶液熒光強度的降低或消失。ii.靜態息滅1.基本原理小部分光子和物質分子相碰撞，使光子的運動方向發生改變而向不同角度散射。⑤

散射光的干擾瑞利光：光子和物質發生彈性碰撞，不發生能量交換，只是光子運動方向發生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：光子和物質發生非彈性碰撞，發生能量交換，光子把部分能量轉移給物質分子或從物質分子獲得部分能量。從而發射出比入射光稍長或稍短的光。1.基本原理散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當溶劑的拉曼光與被測物質的熒光光譜相重疊時，應更換溶劑或改變激發光波長。1.基本原理2.1熒光分光光度計由光源、單色器、液槽、檢測器和信號顯示記錄器五部分組成。（1）激發光源氙燈光源：波長范圍250~800nm連續光譜。是應用最廣泛的光源。高壓汞燈光源：光譜略呈帶狀常用熒光分析光源：

氙燈，高壓汞燈。2.熒光分光光度計（2）單色器（3）樣品池選擇激發光波長的第一單色器選擇發射光(測量)波長的第二單色器低熒光的玻璃或石英方形適用于90°測量（4）檢測器（5）讀出裝置光電倍增管2.熒光分光光度計

(1)靈敏度校正

(2)波長校正

(3)激發光譜和熒光光譜的校正

2.熒光分光光度計2.2儀器的校正3.1熒光強度與物質濃度的關系F

∝

（I0－I）F:熒光強度

Io:入射光強度

I：出射光強度F

=K′（I0－I）根據比爾定律：I=I0×10－cl低濃度時，（cl≤0.05）F=Kc3.分析方法3.2定量分析方法①

標準曲線法用已知的標準物質經過和試樣同樣的處理后，配成一系列標液。測定標液的熒光強度，用熒光強度對標液濃度繪制標準曲線，然后根據試液的熒光強度，在標準曲線上求出試樣中熒光物質的含量。3.分析方法②

比例法純物質：cs、FS

FS－F0=Kcs試液：

cx、Fx

FX－F0=Kc