第七章

分子發光分析法molecular

luminescence

analysis

第一節分子熒光與磷光molecularfluorescenceandphosphorescence第二節分子熒光與磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis第三節化學發光分析法chemiluminescence

analysis2023/2/31一、分子熒光與磷光產生過程luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二、激發光譜與熒光光譜excitationspectrumandfluore-scencespectrum三、熒光的產生與分子結構關系

relationbetween

fluorescenceandmolecularstructure四、影響熒光強度的因素factorinfluenced

fluorescence第一節

分子熒光與磷光molecularfluorescenceandphosphorescence2023/2/32一、熒光與磷光的產生過程

luminescenceprocessofmolecularfluorescenceandphosphorescence由分子結構理論，主要討論熒光及磷光的產生機理。1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉動能級；

基態(S0)→激發態(S1、S2、激發態振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發態→基態：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢；第一、第二、…電子激發單重態S1、S2…

；第一、第二、…電子激發三重態T1、T2…

；2023/2/332.電子激發態的多重度

電子激發態的多重度：M=2S+1，S為電子自旋量子數的代數和(0或1)；例如，鈉只有一個外層電子，S=1/2，因此M=2(1/2)+1=2，所以將產生雙重線；若為堿土金屬，有兩個外層電子，它們可能同一個方向自旋，則S=1/2+1/2=1，M=3，為三重線，或者向相反方向自旋，S=1/2-1/2=0，M=1，為單重線。平行自旋比成對自旋穩定(洪特規則)，三重態能級比相應單重態能級低；大多數有機分子的基態處于單重態；通常用S和T分別表示單重態和三重態。S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率小；

2023/2/342.激發態→基態的能量傳遞途徑

電子處于激發態是不穩定狀態，返回基態時，通過輻射躍遷(發光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內轉移外轉移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷

激發態停留時間短、返回速度快的途徑，發生的幾率大，發光強度相對大；熒光：10-7～10-9

s,第一激發單重態的最低振動能級→基態；磷光：10-4～10s；第一激發三重態的最低振動能級→基態；2023/2/35S2S1S0T1吸收發射熒光發射磷光系間跨越內轉換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉換l

2T2內轉換振動弛豫2023/2/36非輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發生振動弛豫的時間10-12

s。

內轉換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過內轉換和振動弛豫，高激發單重態的電子躍回第一激發單重態的最低振動能級。外轉換：激發分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷；外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態,有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。2023/2/37輻射能量傳遞過程熒光發射：電子由第一激發單重態的最低振動能級→基態（多為S1→S0躍遷），發射波長為‘2的熒光；10-7～10-9

s。

由圖可見，發射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；‘2>2>1；磷光發射：電子由第一激發三重態的最低振動能級→基態（T1→S0躍遷）；電子由S0進入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發→振動弛豫→內轉換→系間跨越→振動弛豫→T1發光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續一段時間。2023/2/38二、激發光譜與熒光(磷光)光譜

excitationspectrumandfluore-scencespectrum熒光(磷光)：光致發光，必須選擇合適的激發光波長，激發光波長如何選擇？1.熒光(磷光)的激發光譜曲線由于分子對光的選擇性吸收，不同波長的入射光具有不同的激發效率。如果固定熒光（或磷光）的發射波長（即測量波長)而不斷改變激發光（即入射光）的波長,并記錄相應的熒光（或磷光）強度，所得到的發光強度對激發波長的譜圖稱為熒光（或磷光）的激發光譜（圖中曲線I）。如果固定激發光的波長和強度而不斷改變熒光（或磷光）的測量波長（即發射波長），并記錄相應的熒光（或磷光）的強度，所得到的發光強度對發射波長的譜圖則為熒光（或磷光）的發射光譜。2023/2/392.熒光光譜(或磷光光譜)固定激發光波長(選最大激發波長),化合物發射的熒光(或磷光強度)與發射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。激發光譜和發射光譜可作為發光物質的鑒別手段，并可用于定量測定時作為選擇合適的激發波長和測量波長的依據。2023/2/310應該指出，激發光譜曲線與其吸收曲線可能相同，但前者是熒光強度與波長的關系曲線，后者則是吸光度與波長的關系曲線，兩者在性質上是不相同的。當然激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子數目最多，這可說明所吸收的光能量也是最多的，自然能產生最強的熒光。2023/2/311200260320380440500560620熒光激發光譜熒光發射光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜2023/2/3123.激發光譜與發射光譜的關系

a.Stokes位移激發光譜與發射光譜之間的波長差值。發射光譜的波長比激發光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發射光譜的形狀與激發波長無關電子躍遷到不同激發態能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2,1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發單重態的最低振動能級再躍遷回到基態，產生波長一定的熒光(如‘2)。

c.

鏡像規則通常熒光發射光譜與它的吸收光譜（與激發光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。2023/2/313鏡像規則的解釋

基態上的各振動能級分布與第一激發態上的各振動能級分布類似；基態上的零振動能級與第一激發態的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

2023/2/314應用鏡像對稱規則，可以幫助判別某個吸收帶究竟是屬于第一吸收帶中的另一振動帶，還是更高電子態的吸收帶。根據鏡像對稱規則，如不是吸收光譜鏡像對稱的熒光峰出現，表示有散射光或雜質熒光存在。誠然，也存在少數偏離鏡像對稱規則的現象，究其原因，或是由于激發態時核的幾何構型與基態時不同，或是由于在激發態時發生了質子轉移反應或形成激發態二聚體（或激發態復合物）等原因而引起的。2023/2/315200250300350400450500熒光激發光譜熒光發射光譜nm蒽的激發光譜和熒光光譜2023/2/316三、熒光的產生與分子結構的關系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子產生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構；（2）具有一定的熒光量子產率。熒光量子產率（）：熒光量子產率與激發態能量釋放各過程的速率常數有關，如外轉換過程速度快，不出現熒光發射。2023/2/3172.化合物的結構與熒光（1）躍遷類型：→*的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數小，有利于熒光的產生；（2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應：芳環上有供電基，使熒光增強，如-OH、-NH2、-OCH3、-NR2等；吸電子基團如-NO2、-COOH等減弱熒光，程度高時，無熒光。2023/2/3182023/2/319（5）取代基的空間障礙對熒光也有影響（一般空間阻礙導致熒光減弱），立體異構現象對熒光強度有顯著的影響（一般反式熒光強，順式弱或無熒光）。（6）金屬螯合物的熒光除過渡元素的順磁性原子會發生線狀熒光光譜外，大多數無機鹽類金屬離子，在溶液中只能發生無輻射躍遷，因而不能產生熒光。但是，在某些情況下，金屬螯合物卻能產生很強的熒光，并可用于痕量金屬離子的測定，主要是由于螯合物中配位體的發光。一般來說，能產生這類熒光的金屬離子具有硬酸型結構，如Be、Mg、Al、Zr、Th等。2023/2/320四、影響熒光強度的因素

factorsaffectingfluorescenceintensity

影響熒光強度的外部因素1.溶劑的影響除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發生變化（極性大，熒光強）；2.溫度的影響熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉換去活的幾率增加。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；2023/2/3214.內濾光作用和自吸現象自吸現象：化合物的熒光發射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。內濾光作用：溶液中含有能吸收激發光或熒光物質發射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；2023/2/3225.溶液熒光的猝滅碰撞猝滅，是熒光熄滅的主要原因。它是指處于單重激發態的熒光分子與熄滅劑發生碰撞后，使激發態分子以無輻射躍遷方式回到基態，因而產生熄滅作用。熒光熄滅的程度主要取決于熒光分子與熄滅劑的反應速度和熄滅劑的濃度，另外碰撞猝滅還與溶液的黏度有關，黏度大、熄滅作用小，碰撞熄滅隨溫度的升高而增加。能量轉移使熒光猝滅。氧的熄滅作用，溶液中的溶解氧常對熒光產生熄滅作用。這可能是由于順磁性的氧分子與處于單重激發態的熒光物質分子相作用，促進形成順磁性的三重態熒光分子，即加速系間跨越所致。2023/2/323一、儀器與結構流程instrumentandgeneralprocess

二、熒光分析法和應用fluorescenceanalysisandapplication三、磷光分析法的應用phosphorescenceanalysisandapplication第二節

分子熒光與磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis

2023/2/324一、儀器結構流程測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發光源、樣品池、雙單色器系統、檢測器。特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。基本流程如圖：單色器：選擇激發光波長的第一單色器和選擇發射光(測量)波長的第二單色器；光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區)檢測器：光電倍增管。2023/2/325儀

器

光

路

圖2023/2/326儀器框圖該型儀器可進行熒光、磷光和發光分析；2023/2/327同步掃描技術根據激發和發射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差()和固定能量差及可變波長三種；同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；如圖。合適的可減少光譜重疊；酪氨酸和色氨酸的熒光激發光譜相似，發射光譜嚴重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現分別測定。2023/2/328可獲得三維光譜圖的儀器可獲得激發光譜與發射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖2023/2/329磷光檢測熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發射的同時測量磷光。測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術。室溫測量時，不需要杜瓦瓶（英國化學家、物理學家杜瓦發明的瓶子）。2023/2/330二、熒光分析方法與應用1.特點（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數量級；為什么？（光度法，檢測大信號的微小差別，熒光法小背景下的熒光強度）檢測下限：0.1～0.1g/cm-3相對靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強既可依據特征發射光譜，又可根據特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點：應用范圍小。為什么？2023/2/3312.定量依據與方法(1)定量依據熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時，將括號項近似處理后：

If

=2.3I0lc

=Kc2023/2/332（2）定量方法標準曲線法：

配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度。比較法：在線性范圍內，測定標樣和試樣的熒光強度，比較。2023/2/333例、還原態的NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型或輔酶I還原型）是一種具有高熒光的重要的輔酵素。它在340nm有最大吸收，在465nm有最大發射。由標準NADH溶液得到下列熒光強度數據：濃度NADH,μM相對強度濃度NADH,μM相對強度0.10013.00.50059.70.20024.60.60071.20.30037.90.70083.50.40049.00.80095.12023/2/334請建立一個校正曲線，并用以估計某未知溶液中的NADH濃度，此溶液的熒光相對強度為42.3。解：以熒光相對強度為縱坐標，以NADH之濃度為橫坐標，標出以上八個數據點，以直線相連，即可得到校正曲線如下：2023/2/335相對熒光強度NADH濃度/μM2023/2/336該曲線的回歸方程為：Y=1.76071+116.64286X(r=0.99978)將未知溶液的相對強度標于校正曲線上，可得其對應濃度為0.34μM。或代入回歸方程：2023/2/3373.熒光分析法的應用(1)無機化合物的分析與有機試劑形成配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)生物與有機化合物的分析見表2023/2/3382023/2/3392023/2/340三、磷光分析法的應用1.稠環芳烴分析采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環芳烴和雜環化合物（致癌物質）；見表2.農藥、生物堿、植物生長激素的分析煙堿、降煙堿、新煙堿、2，4-D（一種植物生長激素）、萘乙酸等分析檢測限0.01g/cm-3

3.藥物分析和臨床分析見表2023/2/3412023/2/342重原子效應：I、Br、Pb等稱為重原子。在重原子中，能級之間的交叉現象比較嚴重，因此容易發生自旋軌道的相互作用，增加由單重態轉化為三重態的速度，即加快了系間跨越的速度。這就是鹵素取代基隨原子序數增加而熒光下降的原因。不難理解，由于重原子效應增加系間跨越的速度，使熒光減弱，磷光則相應增強。2023/2/3432023/2/344一、基本原理principle

二、化學發光分析的特點characteristics三裝置與技術instrumentandtechnology第三節

化學發光分析法chemiluminescence

analysis2023/2/345一、基本原理principle1.化學發光反應化學發光不是由光、熱、電能所產生的光輻射。在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發，從激發態返回基態時，發射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能夠發光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物；（2）化學發光反應多為氧化還原反應，激發能與反應能相當E

=

170～300kJ/mol；位于可見光區；（3）發光持續時間較長，反應持續進行；化學發光反應存在于生物體(螢火蟲、海洋發光生物)中，稱生物發光(bioluminescence)。2023/2/3462.化學發光效率激發態產物分子的化學效率：激發態分子的發光效率：時刻t的化學發光強度(單位時間發射的光量子數)：dc/dt分析物參加反應的速率；2023/2/3473.化學發光強度與化學發光分析的依據在化學發光分析中，被分析物相對于發光試劑小得多，對于一級動力學反應：

dc/dt=Kc；K為反應速率常數。定量依據：（1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：2023/2/3484.化學發光反應的類型（1）氣相化學發光反應a.一氧化氮與O3的發光反應

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h發射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發光反應

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2+h最大發射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；2023/2/349

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h發射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發光反應：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h發射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與NO的發光反應：2023/2/350c.乙烯與O3的發光反應

乙烯與O3反應，生成激發態乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大發射波長：435nm；對O3的特效反應；線性響應范圍1ng/cm-3～1g/cm-3；2023/2/351（2）火焰中的化學發光反應在富氫火焰中，也存在著很強的化學發光反應；a.一氧化氮NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h發射光譜范圍：660～770nm；

最大發射波長：690nm；

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O該反應十分迅速；可用于測定空氣中NOx的總量。2023/2/352b.硫化物揮發性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產生很強的化學發光（藍色）：SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h發射光譜范圍：350～460nm；

最大發射波長：394nm；靈敏度：0.2ng/cm-3；發射光強度與硫化物濃度的平方成正比。2023/2/353（3）液相中的化學發光反應機理研究較多，在分析中應用最多；可測痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。應用最多的發光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學發光反應效率：0.15～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應過程：該發光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應,使發出的光大大增強；利用這一現象可測定這些金屬離子。如Co(II)、Cu(II)、Ni(II)、Au(III)、Os(III、IV、V)等。2023/2/3545.化學與生物發光分析的應用（1）魯米諾發光。該發光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應；利用這一現象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可檢測低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測定某些生物試樣

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通過測定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2023/2/355

草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧