第八章印跡雜交技術分子生物學常用的分析技術之一DNA印跡法、RNA印跡法和蛋白質印跡法（免疫印跡法）

第一節核酸分子雜交

核酸雜交技術是在DNA變性和復性原理的基礎上建立起來的一種分子生物學技術

一、變性（denaturation）在某些理化因素的作用下，維系核酸二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA雙螺旋結構松散，變成單鏈的過程稱為核酸的變性核酸雙螺旋區的氫鍵斷裂，變成單鏈，但并不涉及共價鍵的斷裂DNA解鏈曲線DNA變性的本質是氫鍵的斷裂核酸的變性因素變性方法熱變性、酸堿變性、化學變性劑（乙醇、尿素和甲酰胺）增色效應（hyperchromiceffect）由于DNA變性而引起的光吸收增加的現象使雙鏈DNA解鏈度達到50%所需的溫度稱為解鏈溫度(Tm)、變性溫度、熔點

DNA的解鏈溫度一般在82-95℃

，與DNA的分子大小和堿基組成、溶液的pH值和離子強度（+）等有關

二、復性DNA復性：緩慢降溫可以使熱變性DNA重新形成互補雙鏈結構DNA的最適復性溫度通常比解鏈溫度低20-25℃復性導致DNA的紫外吸收降低，稱為減色效應檢測DNA紫外吸收的變化可以分析其變性和復性

不是簡單的逆變性過程，受多種因素影響:①DNA濃度越高，兩股互補鏈相遇的可能性就越大，因而復性越快②序列簡單的DNA(例如重復序列)復性快，序列復雜的DNA(例如單一序列)復性慢，因而可以通過測定復性速度分析DNA序列的復雜性③DNA片段越大，尋找完全互補序列的難度就越大，因而復性越慢④DNA溶液的離子強度越高，兩股互補鏈重新結合的速度就越快，因而復性越快變性復性

DNA-DNA雜交雙鏈分子三、雜交與核酸分子雜交技術

雜交定義不同來源的、序列互補的單鏈RNA、DNA，或DNA和RNA，根據堿基互補原則，借助氫鍵連接為雙鏈分子的過程。核酸雜交類型單鏈DNA與單鏈DNA雜交（DNA-DNA）單鏈DNA與單鏈RNA雜交（DNA-RNA）單鏈RNA與單鏈RNA雜交（RNA-RNA）核酸分子雜交技術定義：將已知序列的單鏈核酸片段進行標記后，再與另一種未知序列的待測核酸樣品進行雜交，從中鑒定互補序列，以分析該樣品中是否存在特定基因序列、基因序列是否存在變異，或研究目的基因的表達情況探針(Probe)：是帶有標記物且序列已知、用于鑒定互補序列的單鏈核酸片段根據雜交體系的不同，核酸分子雜交可以分為：1、液相雜交：待測核酸和標記的探針都游離于溶液中，在一定條件下進行雜交優點：速度快、效率高，操作簡便缺點：難以有效避免待測核酸的復性雜交之后也不易將未雜交的多余探針完全除去，誤差較大2、固相雜交：將待測核酸先固定在固相支持物上，然后與溶液中的游離探針進行雜交，形成的雜交體結合在固相支持物上優點：既可以避免待測核酸的復性，又可以通過漂洗除去末雜交的多余探針，而且結合在固相支持物上的雜交體的檢測也很方便印跡雜交技術中的核酸分子雜交就是以固相雜交為基礎的第二節探針與標記

合適的探針具備以下條件:①具有高度特異性，只與待測核酸雜交。因此，通常首選編碼序列制備探針②為單鏈核酸，用雙鏈核酸制備的探針使用前要先變性解鏈③帶有標記物，標記物靈敏度高而穩定，檢測方便

一、探針種類

1·基因組DNA探針（最常用的DNA探針）多為某一基因的全部序列或部分序列2·RNA探針雜交效率高、穩定性高、敏感性和均一性強非特異性雜交較少、低本底3·cDNA探針

不含內含子等非編碼序列，特異性高，研究基因表達不易制備4·寡核苷酸探針

根據已知核酸序列人工合成的DNA探針;分析點突變5·鎖式探針

一種特別設計的DNA探針，中間為連接序列6·實時定量PCR探針

二、探針標記物

(一)放射性同位素標記物(32P、2H和32S)極高的靈敏度和特異性放射性污染,半衰期短,昂貴(二)非放射性標記物(生物素、地高辛和熒光素等)實驗周期短;穩定性好,標記探針可以長時間存放備用;無放射性污染靈敏度和特異性有時不理想三、探針標記法1、體內標記：將放射性化合物加入培養基，由細胞吸收之后經過合成代謝摻入新合成的核酸分子2、體外標記（最常用）：化學法和酶促法化學法：利用標記物分子上的活性基團與探針分子上的基團進行交聯，將標記物直接結合到探針分子上。簡便快速、標記均勻酶促法：先用標記物標記核苷酸，再通過酶促反應將標記核苷酸摻入探針分子，或將標記基團從核苷酸轉移到探針分子

(一)切口平移標記法

(二)隨機引物標記法

末端標記法(三)聚合酶鏈反應標記法一種標記dNTP和三種普通dNTP為底物，短鏈探針(四)末端標記法T4多核苷酸激酶、末端轉移酶、Klenow片段和T4DNA聚合酶

四、探針純化1·乙醇沉淀法

DNA片段可以被無水乙醇沉淀操作簡便，首選方法2·凝膠過濾法

利用凝膠的分子篩特性凝膠填料是SephadexG-50和Bio-GelP-60第三節固相支持物與印跡

一、固相支持物：硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和活化濾紙1·硝酸纖維素膜結合量大、本底較低、操作簡便結合力不強，堿性、真空烘烤破裂變脆2·尼龍膜韌性較強，不易破裂中性尼龍膜和正電荷修飾尼龍膜二、印跡方法

第四節常用核酸印跡雜交技術

常用的核酸分子雜交技術多為固相雜交根據操作方法的不同分為印跡雜交：將凝膠電泳的高分辨率與核酸分子雜交的高靈敏度相結合，包括DNA印跡法和RNA印跡法等原位雜交：包括組織原位雜交法及菌落雜交法、噬菌斑雜交法等核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉移、固化DNA片段雜交加入標記核酸探針檢測雜交信號標記核酸探針預雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標記探針一、DNA印跡法

1.樣品制備；2.電泳分離；3.變性；4·印跡；5·固定；6·預雜交；7.雜交；8·洗膜；9·分析放射自顯影照片二、RNA印跡法

RNA印跡法分析的待測核酸是RNA與DNA印跡法基本一致，所不同的是:

①為了保持RNA呈單鏈狀態進行電泳，以使RNA按分子大小分離，需要先用變性劑將RNA樣品完全變性，再電泳分離

②RNA樣品只能用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜(DMSO)等變性，不能用堿變性，因為堿會導致RNA降解。RNA印跡法可以用于定性或定量分析組織細胞內的總RNA或某一特定RNA，特別是分析mRNA的大小和含量，從而研究基因表達。避免RNase污染，包括抑制內源性RNase的活性三、斑點雜交法和狹縫雜交法將粗制或純化的DNA或RNA樣品變性之后直接點于固相膜表面，經過固定、預雜交之后與過量探針進行雜交分析印跡:圓斑(dot),短線(slot)用于檢測DNA樣品的同源性、細胞內特定基因的拷貝數和基因表達情況優點:用樣量少，操作簡便，不電泳和轉移，在同一張固相膜上可以分析多個樣品缺點:特異性不高,不能分析樣品的分子量

斑點雜交和狹縫雜交制備樣品→點樣→固定（可用斑點雜交儀或直接點樣）優點：簡便、快速、靈敏、樣本用量少缺點：特異性不高，有一定比例的假陽性四、組織原位雜交(insituhybridization)把組織切片進行適當處理，增加細胞膜的通透性，然后置于含探針的雜交液中，使探針進入細胞內，與DNA或RNA雜交以cDNA為探針檢測與其互補的mRNA在細菌或其他真核細胞中的位置，稱為RNA原位雜交，是分析基因表達的常用方法不需提取核酸，保持組織和細胞的形態，分析待測核酸的組織、細胞、亞細胞甚至染色體定位分析特定基因表達情況、病原體的存在部位和方式熒光原位雜交(FISH)是用熒光素標記探針進行的原位雜交①靈敏、穩定、安全、直觀②多色熒光原位雜交可以同時分析多種靶序列熒光標記探針檢測精子五、菌落雜交和噬菌斑雜交

六、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)

ASOH：最早檢測已知點突變，目前廣泛采用的基因診斷方法關鍵：設計一對ASO，長度15-20nt，只有一個堿基不同，對應突變位點（正常探針，突變探針）診斷遺傳病，例如診斷苯丙酮酸尿癥(PKU)，根據某個突變位點(例如Arg243Gln)設計一對探針:用兩種探針分別和待測DNA雜交，顯性純合子只與正常探針雜交，雜合子與正常和突變探針都雜交，隱性純合子只與突變探針雜交，因此根據雜交結果可以判斷待測個體的基因型苯丙酮酸尿癥患者基因型是隱性純合子第五節影響雜交的因素

核酸分子雜交的效果取決于雜交的特異性和雜交的效率1·核酸分子大（↓）小和濃度（正相關）發生碰撞才可能雜交2·探針種類和濃度：單鏈探針雜交效率會隨著濃度的增加而提高，雙鏈探針與此相反3·雜交溫度：最適雜交溫度(比解鏈溫度低20-25℃時)；特異性4·↓離子強度和↑甲酰胺濃度：↓最適雜交溫度5.雜交時間：控制在20小時左右6·雜交促進劑:＞250nt探針雜交用惰性多聚體(硫酸葡聚糖/PEG)7.非特異性雜交：預雜交，即用封閉物（變性的非特異性DNA、高分子化合物）封閉非特異性雜交位點第六節蛋白質印跡法蛋白質印跡法可以用于定性和半定量分析混合物中的蛋白質綜合了聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高和固相免疫分析特異性高、靈敏度高等優點一、基本內容

二、注意事項1·選用合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度2·印跡時，應選用小孔徑的固相膜，以免小分子量蛋白質透過固相膜丟失3·蛋白質印跡法檢測信號的強弱受多種因素的影響，所以一般只用于半定量分析即測定目的蛋白的相對含量，確定該目的蛋白是否存在，比較其在不同細胞內的含量不同目的蛋白用不同抗體檢測時，分析結果沒有可比性三種印跡技術的比較第七節生物芯片

定義：也稱為生物微陣列，是指通過微電子、微加工技術，用生物大分子

(例如核酸、蛋白質)或細胞等在數平方厘米大小的固相介質表面構建的微型分析系統，用以對生物組分進行快速、高效、靈敏的分析與處理種類：基因芯片、蛋白質芯片、組織芯片、微流控芯片和芯片實驗室

固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龍膜等特點：高通量、集成化、標準化和微型化

一、基因芯片（genechip）

DNA芯片、DNA微陣列、寡核苷酸微陣列定義:是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量DNA探針以點涂的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品的信號（即基因序列或表達的信息）基本原理依然是基于核酸分子雜交，屬于固相雜交不同：探針固相化、集成化并且不標記;而待測樣品游離于液相并且被標記

基因芯片發展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray

(一)基本原理和基本操作

基因芯片技術是以斑點雜交為基礎建立的高通量檢測DNA的技術基本操作分為四個步驟芯片制作樣品制備分子雜交檢測分析1·芯片制作一個復雜而精密的過程，需要專門的儀器(1)原位合成法:光引導原位合成法分子印章法(2)微量點樣法:噴墨打印（微孔）接觸打印（點樣針）2·樣品制備待測樣品（Cy3）；對照樣品（Cy5）3.分子雜交探針含量遠多于待測DNA含量（雜交信號強弱與待測DNA含量成正比）優化雜交條件：離子強度、溫度、時間4、檢測分析以掃描儀對熒光信號進行檢測和分析，通過陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來DNA芯片技術流程大規模基因芯片的應用

(二)應用

基因芯片技術的主要用途是進行DNA測序和研究基因表達在這兩種用途的基礎上，基因芯