小鼠骨髓細胞微核試驗受試物:環磷酰胺受試動物:小鼠實驗目的

學習和掌握小鼠骨髓細胞微核試驗的原理和方法

細胞分裂分為四個期：1、G1期（DNA合成前期）：細胞生長，為DNA復制做準備。2、S期（DNA合成期）：體細胞的DNA含量由2C增加到4C3、G2期(DNA合成后期)：該期主要為M期作準備，包括復制因子的失活和有絲分裂促進因子的分化,有關細胞骨架系統重新組裝的蛋白質合成4、M期(有絲分裂期)：前期，早中期，中期，后期（微核形成期），末期圖13-1細胞周期可劃分為四個階段

微核（micronucleus）

是染色體或染色單體的無著絲點片斷或紡錘體受損而丟失的整個染色體，于細胞分裂后期留在細胞質中，末期后，單獨形成一個或幾個規則的次核，包含在子細胞的胞質內，比主核小，故叫微核。

原理：1有絲分裂毒物的作用使個別染色體或帶著絲點的染色體環和斷片在細胞分裂后期被滯留在細胞質中2斷片或無著絲點染色體在細胞分裂后期不能定向移動，從而遺留在細胞質中

結論：

微核試驗能檢測化學或其他物質因素誘導產生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學終點微核可出現于多種細胞中，但在有核細胞中難以與正常核的分葉及核突出物區分，故常計數PCE細胞中的微核，因為在此階段，主核排出，易于觀察微核，這些細胞保持其嗜堿性約24小時，然后成為正染紅細胞（NCE）,并進入外周血。注：在主核排除時，微核仍保留在細胞中操作步驟：一

染毒：染毒途徑：腹腔注射環磷酰胺，染毒二次，

0、24小時各染毒一次，6h后取樣染毒劑量：50mg/kg二

處死：頸椎脫臼法處死小鼠

三：骨髓液的制備和涂片

1處理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去每節骨骺，用彎止血鉗將骨髓擠于預先滴有小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片

2固定：將推好涼干的骨髓片放進染色缸，甲醇固定15分鐘，取出晾干

3染色：用新鮮配制的Giemsa應用液（Giemsa儲備液一份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份）染色10－15分鐘，細流水沖掉玻片染色液，晾干四觀察和計數：１觀察：先用低倍鏡觀察，選擇分布均勻的區域，再在油鏡下觀察計數。PCE細胞呈灰藍色，正染紅細胞（NCE）桔黃色。細胞中的微核大半呈圓形，邊緣光滑，嗜色性與核質一致，一個細胞內可以出現一個或多個微核。２計數：1000個PCE中含微核的PCE數，并計算200個細胞中PCE/NCE的比值結果與分析：

1結果：試驗只計數PCE中的微核，微核率以千分率表示。每組的雌雄動物分開計數微核PCE均值。2分析：正常的PCE/NCE比值為1（0.6-1.2），如果＜0.1，則表示PCE形成受到嚴重抑制；如果＜0.05，則表示受試物劑量過大，結果不可靠。

圖1：正常嗜多染紅細胞PCE（×400）圖2帶微核嗜多染紅細胞MNPCE（×400）微核嗜多染細胞注意事項：

1、剪胸骨時通過剪斷兩邊的肋骨來把整塊胸骨取下來，以防不小心把胸骨剪斷

2、擠出骨髓處的肌肉要剔除干凈

3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂時要涂勻，以便推片

4、染色前可以先看一下整體涂片情況，細胞分散度是否良好

5、關鍵步驟是制作良好的骨髓涂片以及優良的染色流程圖

處死小鼠，取胸骨

推片

固定（甲醇固定15分鐘）

染色（吉姆薩染色15分鐘）

觀察并