一、

熒光分析的基本原理

二、熒光分析儀

三、分子熒光分析法及其應(yīng)用

第七章

分子熒光分析法

molecularfluorescenceanalysis

熒光的發(fā)現(xiàn)植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液——天蘭色熒光；第一節(jié)概述熒光的發(fā)現(xiàn)1928：Jette和West第一臺光電熒光計(jì)1952：第一臺商品化的熒光分光光度計(jì)特點(diǎn)：1)靈敏度高（1-100ppb)：有的可達(dá)0.01ppb；2)選擇性強(qiáng)；3)方法簡單快速，用樣量少;4)提供比較多的物理參數(shù)。概述

某些物質(zhì)被一定波長的光照射時(shí)，會在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，如果這個(gè)時(shí)間比較短，這種光就稱為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物

螢石(fluospar)而得名。

紫外熒光、可見熒光紅外熒光、X射線熒光用熒光抗體染色之原生動物澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫“螳螂蝦”的海里動物通過發(fā)出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對者或者吸引性配偶，

K.Brejcet.al.,PNAS94(1997)23061nmgreen-fluorescentprotein(GFP)一、分子熒光化合物分子吸收電磁波并發(fā)射出另一波長電磁波二、分子熒光分析法利用物質(zhì)分子的熒光進(jìn)行分析測定的方法lex、I0lem、Iflex、I激發(fā)光發(fā)射光透射光什么結(jié)構(gòu)的化合物具有分子熒光？——基本原理分子熒光如何測量？——熒光分光光度計(jì)分子熒光法有何應(yīng)用？——分子熒光分析法應(yīng)用概述第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜三、分子熒光與濃度間的關(guān)系四、影響熒光強(qiáng)度的因素第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生1.電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫

3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫

3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生S0S1S2T1激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜:固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）

激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！

發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)單色器熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。

原因！

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

‘2>2>1

熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；3.熒光光譜的特征

a.Stokes位移:熒光光譜的波長比激發(fā)光譜的長b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

c.與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1c.鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的各振動能級之間的躍遷和反躍遷幾率相等分子熒光產(chǎn)生的必備條件三、分子熒光與濃度間的關(guān)系分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)分子失活過程的速率常數(shù)有關(guān)發(fā)射過程中的速率常數(shù)其他過程有關(guān)的速率常數(shù)，主要取決于環(huán)境1.熒光量子產(chǎn)率2.分子熒光與濃度間的關(guān)系A(chǔ)≤0.05若

稀溶液一、

熒光分析的基本原理

二、熒光分析儀

三、分子熒光分析法及其應(yīng)用

第七章

分子熒光分析法

molecularfluorescenceanalysis

第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜三、分子熒光與濃度間的關(guān)系四、影響熒光強(qiáng)度的因素激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生S0S1S2T1激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)單色器

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

‘2>2>1

熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；3.熒光光譜的特征

a.Stokes位移:熒光光譜的波長比激發(fā)光譜的長b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

c.與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。

ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)

稀溶液三、分子熒光與濃度間的關(guān)系1.熒光量子產(chǎn)率第一節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜三、分子熒光與濃度間的關(guān)系四、影響熒光強(qiáng)度的因素（1）躍遷類型（2）共軛效應(yīng)（3）取代基效應(yīng)（4）結(jié)構(gòu)剛性效應(yīng)四、分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系n振動弛豫激發(fā)

n熒光（1）躍遷類型躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型較大的摩爾吸光系數(shù)較短的激發(fā)態(tài)壽命10-7~10-9s系間竄越至三重態(tài)幾率小產(chǎn)生熒光的物質(zhì):芳香族化合物含脂肪族和指環(huán)族羰基結(jié)構(gòu)的化合物稠環(huán)化合物苯環(huán)被稠化至雜環(huán)核上的雜環(huán)化合物（2）共軛效應(yīng)共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強(qiáng)。0.070.180.930.27化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.521）給電子取代劑加強(qiáng)熒光（3）取代基效應(yīng)—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光、強(qiáng)磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強(qiáng)度10182020202）吸電子取代基減弱熒光、加強(qiáng)磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光化合物熒光相對強(qiáng)度苯10苯酚18苯胺20苯甲酸3硝基苯0空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯強(qiáng)熒光物質(zhì)F=0.75F=0.03立體異構(gòu)體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質(zhì)含有重原子的溶劑，由于重原子效應(yīng)熒光減弱、磷光增強(qiáng)。4）重原子取代基效應(yīng)—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強(qiáng)（4）結(jié)構(gòu)剛性效應(yīng)（1）躍遷類型（2）共軛效應(yīng)（3）取代基效應(yīng)（4）結(jié)構(gòu)剛性效應(yīng)2.分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系五、影響熒光強(qiáng)度的主要因素

1.溶液熒光的猝滅2.溶劑的影響3.溫度的影響4.溶液pH的影響1.熒光猝滅熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起熒光強(qiáng)度降低或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象。

熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。

溶液熒光猝滅的主要原因1）靜態(tài)猝滅2）動態(tài)猝滅濃度限量1g~1mg/ml熒光猝滅法：利用熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系測定熒光猝滅劑含量的方法。

3）熒光物質(zhì)自猝滅2）溶劑對熒光強(qiáng)度的影響極性增加，熒光光譜紅移，熒光產(chǎn)率增加；粘度增加，熒光產(chǎn)率增加一般溶劑效應(yīng)：介電常數(shù)，折射率。普遍存在特殊溶劑效應(yīng)：形成氫鍵溶劑相對介電常數(shù)熒光峰/nm熒光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率3）溫度對熒光強(qiáng)度的影響隨著溫度的增高，熒光物質(zhì)溶液的熒光量子產(chǎn)率及熒光強(qiáng)度將降低不同溫度下鄰菲啰啉的

熒光光譜（在鄰二苯中）碰撞幾率增大粘度降低pH<2無熒光7~12藍(lán)色熒光>13無熒光

4）介質(zhì)酸度的影響五、影響熒光強(qiáng)度的主要因素

1.溶液熒光的猝滅2.溶劑的影響3.溫度的影響4.溶液pH的影響第二節(jié)基本原理一、分子熒光的產(chǎn)生光致激發(fā)非輻射躍遷失活輻射躍遷二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜三、分子熒光與濃度間的關(guān)系A(chǔ)≤0.05四、影響熒光強(qiáng)度的因素1.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系躍遷類型、共軛、剛性平面、取代基2.影響熒光強(qiáng)度的主要因素?zé)晒忖纭囟取H、溶劑激發(fā)光源(lightsource)

樣品池(吸收池)(absorptioncell)單色器(monochromator)檢測器(detecor)記錄及數(shù)據(jù)處理器(display)

一、儀器的主要部件

7-3熒光分析儀器光源1.光源的要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強(qiáng)度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型：氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源：發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強(qiáng)度大樣品池紫外-可見分光光度計(jì)

測量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池（液池）I0ItI0ItIF,p濾光片、棱鏡、光柵單色器混合光單色光狹縫狹縫色散原件準(zhǔn)直鏡光電池或光電倍增管,光電二極管陣列式檢測器檢測器二、熒光光譜儀吸收池光源檢測器單色器信號顯示系統(tǒng)二、熒光光譜儀基本結(jié)構(gòu)單色器問題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別

紫外-可見分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)光路光源儀器校正吸收池入射光與吸收光同方向入射光與熒光垂直方向兩種光源(紫外+可見)一種光源(紫外)空白溶液(F=0)熒光對照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外無吸收兩面透光低熒光材料四面透光7-4熒光分析法的應(yīng)用一、熒光分析法的特點(diǎn)（1）信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子產(chǎn)率、熒光壽命等。（2）選擇性強(qiáng)（3）試樣量少，應(yīng)用范圍廣。（4）靈敏度高分析物濃度范圍：10-5～

10-8mol/L，檢測下限：0.1～0.001g/mL比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級。

定性方法特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。定量方法

If

=2.3I0bc

=Kc二、定性、定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法直接熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法FCsFxCx2.比較法3.熒光分析注意事項(xiàng)1）防止熒光污染2）防止散射光的干擾三、熒光分析法的應(yīng)用1.直接測定和間接測定

直接測定：被測物質(zhì)本身發(fā)生熒光間接測定：被測物質(zhì)本身不發(fā)熒光或熒光量子產(chǎn)率很低。①衍生化法；②熒光猝滅法三、熒光分析法的應(yīng)用1.無機(jī)物分析：采用間接法（1）與有機(jī)試劑形成配合物后測量Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr（2）通過其對熒光試劑的熒光增強(qiáng)或猝滅效應(yīng)進(jìn)行測定。CN-、F-與Al、Zr離子強(qiáng)烈配合→使原有熒光配合物的熒光猝滅。目前可測量元素已有約60多種。