核心知識全面復習高考一輪復習——選擇性必修三《生物技術與工程》——第53講微生物的培養技術及應用復習目標要求

1.獲得純凈的微生物培養物是發酵工程的基礎。2.闡明在發酵工程中滅菌是獲得純凈的微生物培養物的基礎。3.闡明無菌技術是在操作過程中，保持無菌物品和無菌區域不被微生物污染的技術。4.舉例說明通過調整培養基的配方可有目的的培養某種微生物。5.概述平板劃線法和稀釋涂布平板法是實驗室中進行微生物分離和純化的常用方法。6.概述稀釋涂布平板法和顯微鏡計數法是測定微生物數量的常用方法。考點一微生物的基本培養技術

考點二微生物的選擇培養和計數

主要考點

必備知識微生物的基本培養技術考點一一.知識梳理

必備知識1.微生物的定義：肉眼難以看清，需要借助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物概述一.知識梳理

必備知識2.微生物分類真菌:酵母菌、毛霉等原生生物:草履蟲、變形蟲等細菌:大腸桿菌、乳酸菌等病毒:SARS病毒、噬菌體等無細胞結構原核細胞真核細胞禽流感病毒SARS病毒球菌藍細菌放線菌草履蟲衣藻酵母菌青霉菌大型真菌微生物概述一.知識梳理

必備知識3.微生物菌落

分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。微生物概述由單個微生物繁殖形成的純培養物就是一個單菌落；一個單菌落就是一個種群一.知識梳理

必備知識在實驗室培養微生物的要求？

提供微生物生長繁殖所需營養和環境條件——培養基

確保其它微生物無法混入——無菌技術（1）培養基的概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。一.知識梳理

必備知識1.培養基（3）營養組成：

基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽碳源無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：牛肉膏、蛋白胨等氮源無機氮源：NH4＋、NO3-有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素等自養微生物異養微生物(2)培養基的作用：用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。一.知識梳理

必備知識乳酸桿菌:需要在培養基中添加維生素霉菌：需將培養基pH調至酸性細菌：需將培養基pH調至中性或弱堿性厭氧生物：提供無氧條件特殊需求：在提供上述幾種主要營養物質的基礎上，培養基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的需求，培養基的成分舉例如下：（1）培養基的概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。用以培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。1.培養基（3）營養組成：

一.知識梳理

必備知識補充說明（1）含有C、H、O、N的有機物可作為異養型微生物的碳源、氮源、能源；（2）自養型微生物與異養型微生物培養基的主要差別在于碳源；（3）自養型微生物所需的碳源來自無機碳源，異養型微生物所需的碳源來自有機碳源，因此可以根據培養基中營養物質判斷微生物的代謝類型；（4）無機氮源不但能給自養型微生物提供氮源，也能作為能源物質，如NH3既作為硝化細菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學能）（5）無機鹽除了可以調節酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，有些無機鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細菌）一.知識梳理

必備知識微生物例子培養基需要的特殊物質或條件

乳酸桿菌霉菌細菌厭氧微生物添加維生素調至酸性調至中性或弱堿性提供無氧的條件培養基的配制原則(1)目的要明確：不同的微生物需求不同，根據培養目的進行配制。(2)營養要協調：營養物質的濃度和比例要適宜。(3)pH要適宜：為維持pH的相對恒定，可在培養基中加入緩沖劑，常用K2HPO4－KH2PO4。一.知識梳理

必備知識1.培養基液體培養基：擴大培養、工業生產固體培養基：純化（分離）、鑒定、活菌計數、保藏菌種固體培養基液體培養基有無凝固劑瓊脂實驗室常用的固體培養基是瓊脂固體培養基瓊脂（agar）是一種從紅藻中提取的多糖。瓊脂在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常規培養條件下呈現固態。（4）按物理性質劃分一.知識梳理

必備知識1.培養基天然培養基：利用天然的動、植物或微生物包括其提取物制成的培養基。其營養成分復雜而豐富，難以確切了解培養基的化學成分。合成培養基：根據微生物的營養需求，將各種純化學物質按一定比例配制而成的培養基。半合成培養基：由一部分純化學物質、一部分天然物質配制而成的培養基。（舉例：牛肉膏蛋白胨培養基）注意：人工合成的培養基，培養基成分明確（第2個）；含化學成分不明確的天然物質（其他2個）拓展：培養基的類型之其他劃分方式按組成成分劃分一.知識梳理

必備知識

鑒別培養基：根據微生物的代謝特點在培養基中加入某種指示劑或化學藥品，進而產生特定的顏色或其他變化。①加入青霉素的培養基：分離酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源的無氮培養基：分離固氮菌①加入伊紅美藍的培養基：鑒別大腸桿菌②加入剛果紅的培養基：鑒別纖維素分解菌選擇培養基：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。將某種類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。1.培養基拓展：培養基的類型之其他劃分方式按功能劃分一.知識梳理

必備知識標準培養基種類培養基特點作用物理性質固體培養基加凝固劑，如瓊脂

微生物的分離與鑒定，活菌計數，保藏菌種半固體培養基加凝固劑，如瓊脂。容器放倒不致流出，劇烈震動則破散觀察微生物的運動、分類鑒定液體培養基不加凝固劑常用于擴大培養，工業生產功能選擇培養基允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長培養、分離出特定微生物鑒別培養基在培養基中加入某種指示劑或化學藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物成分來源天然培養基含化學成分不明確的天然物質工業生產合成培養基培養基成分明確分類、鑒定2.無菌技術一.知識梳理

必備知識關鍵：在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。常用方法：主要包括消毒和滅菌。①消毒目的：獲得純凈的微生物培養物

(1)消毒是指使用較為溫和的物理、化學或生物等方法殺死物體表面或內部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。

一.知識梳理

必備知識2.無菌技術☆方法：①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。可殺死微生物的營養細胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：62-65℃煮30min或80℃-90℃下處理30s-1min。

可殺死絕大多數微生物，不破壞食物的營養成分。③化學藥物消毒法：用75%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等④紫外線消毒法：對接種室、接種箱或超凈工作臺用紫外線照射30min，以殺死物體表面或空氣中的微生物。一.知識梳理

必備知識2.無菌技術(2)滅菌概念：用強烈的理化方法殺死物體內外的所有的微生物，包括芽孢和孢子?！挎吆玩咦樱貉挎撸耗承┘毦L到一定階段，在細胞內形成的休眠體孢子：某些生物的繁殖體芽孢和孢子具有高度的耐熱性，可抗化學藥物和抗輻射一.知識梳理

必備知識方法：濕熱滅菌干熱滅菌灼燒滅菌高壓蒸汽滅菌鍋干熱滅菌箱接種環灼燒滅菌充分燃燒層不充分燃燒層2.無菌技術(2)滅菌一.知識梳理

必備知識濕熱滅菌干熱滅菌一.知識梳理

必備知識灼燒滅菌23接種環的灼燒滅菌1迅速徹底滅菌一.知識梳理

必備知識①做好消毒和滅菌工作后，要注意避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。②為了避免周圍環境中微生物的污染，接下來的許多操作都應在超凈工作臺上并在酒精燈火焰附近進行。(3）其他操作2.無菌技術注意：選擇無菌技術的原則：一要考慮無菌技術的效果，滅菌的效果比消毒要好；二要考慮操作對象的承受能力，活體生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用滅菌。一.知識梳理

必備知識類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物（不包括芽孢、孢子）強烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學藥劑生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養基、培養皿等,生產和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內,100kPa,溫度121℃,15～30min接種室、接種箱，超凈工作臺一.知識梳理

必備知識3.微生物的純培養培養物純培養物純培養將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體由單一個體繁殖所獲得的微生物群體過程配制培養基→滅菌→接種→分離→培養菌落一.知識梳理

必備知識采用劃線或涂布的接種方法實現目標微生物的分離與純化原理①分散的微生物在適宜的固體培養培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見菌落。②采用平板劃線法或稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養基上。之后經培養得到的的單菌落一般是由單個為微生物繁殖形成的純培養物。一.知識梳理

必備知識原理平板劃線法通過接種環在固體培養基（平板）表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經數次劃線后培養，可以分離得到由單個微生物繁殖而形成的單菌落。采用劃線或涂布的接種方法實現目標微生物的分離與純化一.知識梳理

必備知識(1)酵母菌純培養的操作步驟制備培養基(配制培養基、滅菌、倒平板)↓接種和分離酵母菌↓培養酵母菌(將接種后的平板和一個未接種的平板倒置、培養)3.微生物的純培養一.知識梳理

必備知識制備培養基

稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖、15～20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。馬鈴薯(200g)去皮、切塊馬鈴薯塊加水(1000mL)煮沸紗布過濾濾液加葡萄糖/蔗糖(20g)加瓊脂加水定容(1000mL)酵母菌培養基配置培養基一.知識梳理

必備知識滅菌

將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15～30min。將5～8套培養皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃滅菌2h。酵母菌培養基--高壓蒸汽滅菌轉移包牛皮紙錐形瓶加棉塞皮筋勒緊放入高壓蒸汽滅菌鍋中(100kPa、121℃)滅菌15~30min制備培養基一.知識梳理

必備知識①拔出錐形瓶的棉塞。②將瓶口迅速通過火焰。③用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基（10~20mL）倒入培養皿，立即蓋上皿蓋。④等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒轉過來放置。④③①②防止瓶口的微生物污染培養基倒平板待培養基冷卻到50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。制備培養基一.知識梳理

必備知識在接種前隨機取若干個滅菌后的未接種的平板，先行培養了一段時間，這樣做的目的是？檢測培養基平板滅菌是否合格注意：平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。一.知識梳理

必備知識

通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經數次劃線后培養，可以分離得到單菌落。連續劃線法分區劃線法接種和分離酵母菌一.知識梳理

必備知識平板劃線法操作步驟1、將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅。2、在火焰旁冷卻接種環，并拔出裝有酵母菌的棉塞3、將試管口通過火焰.4、將已冷卻的接種環伸入菌液中，蘸取一環菌液5、將試管通過火焰，并塞上棉塞6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基7、灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最后一區的劃線與第一區相連8、將平板倒置放入培養箱中培養。一.知識梳理

必備知識第1區劃線接種環滅菌第2區劃線接種環滅菌第3區劃線接種環滅菌接種環滅菌分區劃線法12345（1）接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次。（2）劃線首尾不能相接。（3）每次劃線前接種環進行滅菌。（4）劃線后,培養皿倒置培養。（5）不能劃破培養基，一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。平板劃線法注意事項:一.知識梳理

必備知識思考1為什么要將平板倒置（背誦）？思考2為什么要同時放入未接種的平板？既可以防止培養基表面的水分揮發；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。作對照，該培養皿無菌落說明培養基沒有污染。完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右(培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異)的恒溫培養箱中培養24-48h。培養酵母菌一.知識梳理

必備知識(1)酵母菌純培養的操作步驟制備培養基(配制培養基、滅菌、倒平板)↓接種和分離酵母菌↓培養酵母菌(將接種后的平板和一個

的平板倒置、培養)未接種3.微生物的純培養二.精題精練考向

培養基與無菌技術1.消毒和滅菌是兩個不同的概念，滅菌是指徹底殺滅微生物使其永遠喪失生長繁殖的能力。消毒僅指殺死一部分對人體有害的病原菌而對被消毒的物體基本無害。下列哪些事物適用于消毒處理(

)①皮膚②飲用水③牛奶④注射器⑤培養皿⑥接種環⑦培養基⑧果汁⑨醬油⑩手術刀A．①②③⑧⑨ B．④⑤⑥⑦C．①②③④⑤⑥ D．以上全部A二.精題精練解析：消毒指用比較溫和的方法殺死微生物的營養細胞，適用于那些不耐高溫的液體，如③牛奶、⑧果汁、⑨醬油，這樣可以使其中的營養成分不被破壞；對要求不是很嚴格的①皮膚、②飲用水也用消毒的方法處理；而對于嚴格要求的④注射器、⑤培養皿、⑥接種環、⑦培養基、⑩手術刀等必須進行滅菌處理。所以，①②③⑧⑨應該用消毒的方法處理，A正確，BCD錯誤。故選A。二.精題精練對點訓練1．自然界里有多種微生物，將其進行合理的篩選、培養和應用，能給醫藥和化工等生產領域帶來巨大經濟效益?；卮鹣铝袉栴}：(1)對培養基進行滅菌時，多采取_____________法，而對接種環或涂布器滅菌時則用________法，若要將微生物采用平板劃線法進行分離操作，在固體培養基表面連續進行了5次劃線，則需要對接種環灼燒________次。平板劃線在做第二次及其后的劃線操作時，要從上次劃線的________開始劃線，最后一次劃的線不能與第一次劃的線________。高壓蒸汽滅菌灼燒滅菌6末端相連(2)將接種后的固體培養基和一個未接種的固體培養基放入恒溫箱中______培養，以減少培養基中水分的揮發。其中，培養未接種的固體培養基是為了______________________________。長期保存菌種時，應將培養的菌液與甘油充分混勻后，放在－20℃的冷凍箱中保存。倒置作為對照組，排除培養基被雜菌污染二.精題精練(3)甲、乙兩組同學用稀釋涂布平板法測定某種微生物的數量，在同一稀釋倍數下每隔一段時間記錄數據(統計時間內微生物總數小于環境容納量)，得到如表結果：培養時間/小時24487296甲組菌落均值/個18253632乙組菌落均值/個20283832據表可知，計數時最好取培養________小時記錄的菌落數作為實驗結果，一方面是由于培養時間較短，會遺漏菌落數目，另一方面是由于___________________________________________。72培養時間過長，兩個或多個菌落連成一個菌落二.精題精練解析：(1)對培養基進行滅菌時，多采取高壓蒸汽滅菌法，而對接種環或涂布器滅菌時則用灼燒滅菌法。接種環在每次接種前都要灼燒滅菌，最后一次接種完也要滅菌，所以在固體培養基表面連續進行了5次劃線，需要對接種環灼燒6次。平板劃線在做第二次及其后的劃線操作時，要從上次劃線的末端開始劃線，使菌體的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終獲得由單個菌體形成的單個菌落。最后一次劃的線不能與第一次劃的線相連。(2)將接種后的固體培養基和一個未接種的固體培養基放入恒溫培養箱中倒置培養，以減少培養基中水分的揮發。培養未接種的固體培養基是為了作為對照組，排除培養基被雜菌污染。長期保存菌種時，應將培養的菌液與甘油充分混勻后，放在－20℃的冷凍箱保存。(3)根據表中數據可知，甲組和乙組中的菌落數都在72小時達到最大，由此推知最好取72小時記錄的菌落數作為實驗結果，原因：①培養時間不足會遺落菌落數目；②培養時間過長會導致兩個或多個菌落連成一個菌落，使計數不準確。二.精題精練考向二微生物的純培養2.如圖為實驗室培養和純化大腸桿菌的部分操作步驟，下列說法正確的是(

)A．步驟②中打開含菌種的試管后需將試管口通過酒精燈火焰滅菌B．步驟④中接種環共需5次灼燒處理C．將接種后的圖④平板放入培養箱中培養時無須倒置D．①②③步驟操作時都不需要在酒精燈火焰旁進行A二.精題精練解析:打開含菌種的試管需通過火焰滅菌，取出菌種后需再次通過火焰，塞上棉塞才可以，A正確；每次接種前后都要灼燒接種環，因此完成步驟④中的5次劃線操作共需灼燒接種環6次，B錯誤；劃線接種結束后，將平板倒置后放入培養箱中培養，這樣可以防止表面的水分過快揮發和防止皿蓋上的水珠落入培養基造成污染，C錯誤；①②③步驟操作時需要在酒精燈火焰旁進行，防止被雜菌污染，D錯誤。二.精題精練對點訓練2．微生物培養時常利用無菌技術避免雜菌的污染，相關敘述錯誤的是(

)A．配制好的培養基應放入干熱滅菌箱中進行干熱滅菌B．實驗中避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸C．接種前后的接種環都要在酒精燈火焰上進行灼燒D．實驗結束后對實驗室噴灑石碳酸同時配合紫外線照射A解析：對培養基滅菌的方法是高壓蒸汽滅菌法，A錯誤；為避免雜菌污染，實驗中應避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸，B正確；為了防止雜菌污染，每次接種前后，接種環都要進行灼燒滅菌，C正確；紫外線能破壞DNA結構，密閉空間內的空氣常采用紫外線照射消毒，噴灑石碳酸同時配合紫外線照射可提高對密閉空間的消毒效果，D正確。故選A。課堂練習：一、易錯辨析1.培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，有時還需要加入一些特殊的物質(

)2.消毒的原則是既殺死材料表面的微生物，又減少消毒劑對細胞的傷害(

)3.無菌操作的對象只要是沒有生物活性的材料(如培養基、接種環等)都可采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌(

)4.配制培養基時應先滅菌再調pH(

)5.平板劃線法中每一次劃線后要將接種環灼燒(

)6.倒平板時，應將打開的皿蓋放到一邊，以免培養基濺到皿蓋上(

)√√××√×課堂練習：二、填空默寫1.(選擇性必修3P10)培養基的化學成分包括

等。2.(選擇性必修3P10)獲得純凈的微生物培養物的關鍵是

，無菌技術除了用來

外，還能___

。3.選擇性必修3P10“旁欄思考”：培養基中加入氮源的原因是_____________________________________________

。4.選擇性必修3P10“相關信息”：生物消毒法是指利用生物或其_____除去環境中的部分微生物的方法。水、無機鹽、碳源、氮源防止雜菌污染防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染有效避免操作者自身被微生物感染培養基中的氮元素是微生物合成蛋白質、核酸等物質所必需的代謝物課堂練習：二、填空默寫5.(選擇性必修3P12)菌落是指____________________________________

。采用_____

法和

法能將單個微生物分散在固體培養基上，之后經培養得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體平板劃線稀釋涂布平板6.(選擇性必修3P12)平板冷凝后，要將平板倒置的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以減少培養基中的水分過快地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染7.選擇性必修3P13“結果分析”：如果在未接種的培養基表面有菌落，說明

。培養基被雜菌污染課堂練習：二、填空默寫8.(選擇性必修3P13)操作的第一步灼燒接種環是為了________________

；每次劃線前灼燒接種環是為了_________________________________________________________________________________________________，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結束后灼燒接種環，能__________________________________________________________。9.(選擇性必修3P13)在灼燒接種環之后，要等其冷卻后再進行劃線的原因是

。避免接種環上可能存在的微生物污染培養物殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者以免接種環溫度太高，殺死菌種課堂練習：二、填空默寫10.(選擇性必修3P13)在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________。劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落微生物的選擇培養和計數考點二一.知識梳理

必備知識1.區分選擇培養基與鑒別培養基種類特點用途舉例選擇培養基允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長從眾多微生物中分離所需的微生物加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌鑒別培養基根據微生物的代謝特點在培養基中加入某種指示劑或化學藥品，進而產生特定的顏色或其他變化鑒別不同種類的微生物用伊紅—亞甲藍培養基鑒別大腸桿菌一.知識梳理

必備知識2.微生物的選擇培養對土樣充分稀釋后，將菌液涂布到制備好的選擇培養基上，即稀釋涂布平板法。1g土壤中有多少能分解尿素的細菌？分離：獲得分解尿素的細菌的純培養物計數：測定分解尿素的細菌的數量稀釋涂布平板法:是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。注意：稀釋度足夠高時，能在培養基表面形成單個菌落。包括系列稀釋（梯度稀釋）和涂布平板兩個步驟一.知識梳理

必備知識1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1049mL無菌水稀釋涂布平板法及其操作過程①鏟取土樣，將樣品裝入紙袋中。②將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。1ⅹ1090mL無菌水1mL③取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。④將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。⑤將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進行涂布。⑥用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。1mL1mL1mL1mL1mL10g注意：移液管要經過滅菌，并且操作應在酒精燈火焰附近完成。浸滴灼涂一.知識梳理

必備知識注意：1.10g土樣加入盛有90mL無菌水中后，已稀釋10倍，再計算時，不要忽略；2.由于使用的是選擇培養基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因為有些微生物可以利用目的菌的代謝產物來生長繁殖，所以還需要進一步驗證；3.過程中所有操作都應在酒精燈火焰旁進行；4.將涂布器從酒精中取出時，要讓多于的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。一.知識梳理

必備知識

稀釋涂布平板法除可以分離微生物外，也常用來統計樣品中活菌的數目。培養與觀察恒溫培養箱不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養1～2d；放線菌一般在25～28℃的溫度下培養5～7d；霉菌一般在25～28℃的溫度下培養3～4d。每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。一.知識梳理

必備知識3.微生物的數量測定(1)間接計數法——稀釋涂布平板法計數原則

①一般選擇菌落數為30～300的平板計數；

②在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。

③適當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。原理：減小實驗誤差一.知識梳理

必備知識3.微生物的數量測定(1)間接計數法——稀釋涂布平板法統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，這是因為當兩個或多個細胞連在一起，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不用活菌數來表示?！镒⒁猓寒敇悠返南♂尪茸銐蚋邥r，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。原理：一.知識梳理

必備知識每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×MM代表稀釋倍數；C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)計算公式：3.微生物的數量測定(1)間接計數法——稀釋涂布平板法當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。原理：一.知識梳理

必備知識某同學在稀釋倍數為106

的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每克樣品中的細菌數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）。（）A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B每克樣品中含菌數=×稀釋倍數某一稀釋度下平板上平均菌落數n涂布平板時所取稀釋液的體積V（每毫升原液含菌數）一.知識梳理

必備知識3.微生物的數量測定每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。(2)直接計數法——顯微鏡直接計數快速、直觀，能觀察微生物的形態特征。特點：不能區分死菌和活菌，統計結果一般是活菌數和死菌數的總和

土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶。利用尿素作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。一.知識梳理

必備知識4.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數的實驗操作(1)分離原理

設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。設置對照的方法：①空白對照：不給對照組任何處理因素；②條件對照：給對照組施以部分實驗因素，但不是所要研究的處理因素；③自身對照：對照組和實驗組都在同一研究對象上進行；④相互對照：不單設對照組，而是幾個實驗組相互對照。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。一.知識梳理

必備知識實驗的具體操作：（一）土壤取樣（二）配制土壤溶液和制備培養基（三）系列稀釋（四）涂布平板（五）微生物的培養、觀察及菌落計數（六）鑒定一.知識梳理

必備知識土壤取樣一.知識梳理

必備知識①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。細菌適宜在該環境中生長。（細菌適宜在該環境中生長）②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。（細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。）取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。配制土壤溶液和制備培養基一.知識梳理

必備知識①選擇培養基

以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養基

作為對照組，來判斷選擇培養基是否具有選擇作用。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml系列稀釋在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行。分離不同的微生物采用不同的稀釋度。

為保證獲得菌落數為30～300的平板進行計數，可將細菌稀釋倍數為1×103～1×107的稀釋液分別涂布到平板上培養。一.知識梳理

必備知識一.知識梳理

必備知識涂布平板選用1×104、1×105、1×106、1×107倍稀釋倍數進行涂布平板1×1061×1071×1041×105無菌水對照涂布平板實驗時要對培養皿作好標記。注明培養基類型、培養時間、稀釋度培養物等。如果得到了2個或2個以上菌落數目在30~300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數，如果同稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。一.知識梳理

必備知識微生物的培養、觀察及菌落計數在本實驗中，我們可以每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。一.知識梳理

必備知識

待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫培養箱中培養1～2d，在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。一.知識梳理

必備知識培養觀察與計數倒置于30~37℃下培養1~2d1×1061×1071×1041×105無菌水菌落的特征包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面。一.知識梳理

必備知識微生物的培養、觀察及菌落計數鑒定酚紅培養基：鑒定分解尿素的細菌，伊紅一美藍培養基：鑒定大腸桿茵

原理：代謝產物與伊紅—美藍結合→菌落呈深黑色。一.知識梳理

必備知識脲酶陰性脲酶陽性原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養基堿性增強→酚紅變紅→脲酶陽性一.知識梳理

必備知識平板劃線法稀釋涂布平板法純化原理接種工具單菌落的獲得用途接種效果圖相同點通過連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散。將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養基的表面，進行培養，以得到單菌落接種環涂布器從最后劃線的區域挑取稀釋度合適，整個平板上都可找到單菌落分離純化菌種，獲得單菌落①分離純化菌種，獲得單菌落②用于計數①都能分離純化菌種；②都是在固體培養基上進行的二.精題精練考向微生物的選擇培養1.下列關于微生物培養和分離的說法中，正確的是(

)A．先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，立即出現有透明圈的菌落B．篩選纖維素分解菌的實驗流程中不可省略選擇培養這一步C．菌落的大小、顏色、有無莢膜、隆起程度等特征都可作為菌種肉眼鑒定的依據D．在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑可初步鑒定尿素分解菌D二.精題精練解析:先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，此種方法需用氯化鈉洗去浮色，再觀察出現有透明圈的菌落，A錯誤；選擇培養可省略，但培養分離的纖維素分解菌少，B錯誤；菌落的大小、顏色、隆起程度等特征都可作為菌種鑒定的依據，但是有無莢膜通過肉眼無法觀察，C錯誤；在只含有尿素作為氮源的培養基中加入酚紅指示劑可初步鑒定尿素分解菌，D正確。故選D。二.精題精練[對點訓練]1．進行垃圾分類收集可以減少垃圾處理時間，降低處理成本?？蒲行〗M欲分離及培養若干種微生物用于對濕垃圾(包括剩菜剩飯、骨頭、菜根菜葉、果皮等食品類廢物)的處理。下列有關敘述正確的是(

)A．在微生物培養操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養基和操作者的雙手進行滅菌B．培養過程需要向培養基通入無菌空氣并進行攪拌，目的是使菌體充分接觸營養物質和溶解氧，促進細菌繁殖C．科研小組若從生活垃圾中分離分解尿素的微生物，可在培養基中加入酚紅指示劑，如果有尿素分解菌存在，則培養基中該菌落的周圍會出現黑色D．該實驗培養基為選擇培養基，無需進行未接種培養基的培養B二.精題精練解析:在微生物培養操作過程中，為防止雜菌污染，需對培養基和培養皿進行滅菌處理，對操作者的雙手進行消毒處理，A錯誤；培養過程需要向培養基通入無菌空氣并進行攪拌，目的是使菌體充分接觸營養物質和溶解氧，促進細菌生長繁殖，B正確；科研小組若從生活垃圾中分離分解尿素的微生物，可在培養基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，可確定該種細菌能夠分解尿素，C錯誤；進行細菌培養的同時需進行未接種培養基的培養，其對照作用，D錯誤。故選B。二.精題精練考向微生物的分離和計數2.某興趣小組從校園土壤取樣，進行“土壤中分解尿素的細菌的分離和計數”實驗。小明從稀釋度為106培養基中篩選出約120個菌落，而其他同學只篩選出約40個菌落。下列敘述錯誤的是(

)A．小明出現這種結果的可能原因是和其他同學取樣的土壤不同B．要證明培養基是否受到污染，可將小明配制的培養基不接種進行培養C．當稀釋倍數太小時，可能由于菌落重疊導致計數結果偏小D．其他同學土樣的細菌懸液中分解尿素的細菌數量約為4×108個D二.精題精練解析:小明篩選出的菌落數明顯比其他同學多，出現這種結果的可能原因是和其他同學取樣的土壤不同，也有可能是培養基混入其他氮源或培養基被污染，A正確；要證明培養基是否受到污染，可將小明配制的培養基不加土樣進行培養，即進行空白對照，B正確；當稀釋倍數太小時，兩個或兩個以上細菌連在一起時，培養基上看到的是一個菌落，可能會出現菌落重疊而導致計數結果偏小，C正確；其他同學選出約40個菌落，所以土樣的細菌懸液中分解尿素的細菌數量約為40×106＝4×107個，D錯誤。故選D。二.精題精練[對點訓練]2．某同學將1mL土壤樣液稀釋100倍，在3個平板上用稀釋涂布平板法分別接入0.1mL稀釋液，經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為56、57和58。下列敘述錯誤的是(

)A．可得出土壤樣液中活菌數大約為5.7×107個/LB．此方法統計的菌落數往往比實際的活菌數目低C．一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數D．顯微鏡直接計數法統計的都是稀釋液中活菌數D二.精題精練解析:將1mL樣品稀釋100倍，在3個平板上分別接入0.1mL稀釋液；經適當培養后，3個平板上的菌落數分別為56、57和58，據此可得出每升樣品中的活菌數為(56＋57＋58)÷3÷0.1×1000×100＝5.7×107個，A正確；當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一處菌落，所以統計的菌落數往往比實際的活菌數目低，B正確；一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數，C正確；顯微鏡直接計數法統計的都是稀釋液中所有個體的數目，包括死菌，D錯誤。課堂練習：一、易錯辨析1.選擇培養基可以鑒定某種微生物的種類(

)2.尿素在脲酶的催化作用下分解成無機物(

)3.對細菌進行計數只能采用稀釋涂布平板法，而不能用平板劃線法(

)4.篩選能分解尿素的細菌所利用的培養基中，尿素是唯一的氮源(

)5.分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養基的酸堿度降低(

)×√×√×課堂練習：一、易錯辨析6.配制培養不同微生物的培養基時都要將培養基調至中性或弱堿性(

)7.統計菌落數目時為保證結果準確，一般選擇菌落數目最多的平板進行統計(

)××課堂練習：二、填空默寫1.(選擇性必修3P16)選擇培養基是指______________________________

。在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基2.（選擇性必修3P18）血細胞計數板常用于相對

的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數；細菌計數板常用于相對

的細菌等的計數。較大較小3.(源于選擇性必修3P18“正文”)統計某一稀釋度下平板上的菌落數的要求是

。4.(選擇性必修3P18)當__________________________________________

，統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。統計3個菌落數在30～300之間的平板，計算菌落數的平均值兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落課堂練習：二、填空默寫5.(選擇性必修3P19)檢測培養物中是否有雜菌污染的方法是_________

。判斷選擇培養基是否起到篩選作用的方法是_____________________________________________

。同時培養滅菌后的未接種的培養基，觀察是否有菌落產生配制牛肉膏蛋白胨培養基作為對照，觀察選擇培養基上的菌落數是否遠少于牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目6.選擇性必修3P19“探究·實踐”：本活動初步篩選了能分解尿素的細菌，請進一步借助于生物化學的方法來鑒定所分離的菌種：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。分解尿素的細菌合成的脲酶可以將尿素分解成氨，氨會使培養基的堿性增強，在培養基中加入酚紅指示劑培養細菌，若指示劑變紅，可確定該細菌能夠分解尿素課堂練習：二、填空默寫7.(選擇性必修3P20“拓展應用2”)在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________。由于生物與環境的相互依存關系，在富含纖維素的環境中，纖維素分解菌的含量相對較高，從這種土樣中獲得目的微生物的概率要高于普通環境三.高考真題1．(2020·浙江7月)下列關于微生物培養及利用的敘述，錯誤的是(

)A．利用尿素固體培養基可迅速殺死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培養基時應根據微生物的種類調整培養基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉發酵得到糯米酒D．適宜濃度的酒精可使醋化醋桿菌活化A解析:利用尿素固體培養基，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生長繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非殺死，A錯誤；