第2節

微生物的培養技術及應用二微生物的選擇培養和計數（第2課時）1.間接計數法——稀釋涂布平板法（1）原理

當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照三、微生物的數量測定（2）計數原則①

一般選擇菌落數為30～300的平板計數。②

在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值。③

適當的稀釋度、涂布是否均勻是成功統計菌落數目的關鍵。分析實驗結果時，要考慮重復組結果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實驗。1.間接計數法——稀釋涂布平板法（3）結果分析①統計的菌落數往往比活菌的實際數目少；②統計結果一般用菌落數而不是用活菌數來表示。原因：當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。三、微生物的數量測定（4）計算公式每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數；M代表稀釋倍數。V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；（5）使用范圍

可以用來測定土壤、水、食品等樣品中的細菌、酵母菌、芽孢和孢子等的數量，但不適于測定樣品中的放線菌、絲狀真菌等絲狀體微生物的數量。例1.某同學在稀釋倍數為106的培養基中測得平板上菌落數的平均數為234，那么每g樣品中的菌落數是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4B學以致用某兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。從對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果：甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230；乙同學在該濃度下涂布了A、B、C三個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學以這三個平板上菌落數的平均值163作為統計結果。請評價這兩位同學的實驗結果的有效性：1.甲同學________________________________；2.乙同學_____________________________________________；實驗操作不合理，未設置重復實驗組結果計算不合理，21與另外兩組數值相差太大，應舍去學以致用2.直接計數法——顯微鏡直接計數（1）原理

利用特定的__________或____________在______下觀察、計數，然后再計算________的樣品中微生物的數量；

*血細胞計數板常用對相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等；

細菌計數板可對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。（2）優點________（3）缺點①統計結果一般是_________________，不能區分死菌與活菌。②個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察。

③不適于對運動細菌的計數。細菌計數板血細胞計數板顯微鏡一定體積快速、直觀活菌數和死菌數的總和三、微生物的數量測定計數區放大后的計數室(4)計數方法：每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數注意：統計結果一般是活菌數和死菌數的總和。（“染色排除法”）三、微生物的數量測定2.直接計數法——顯微鏡直接計數內容直接計數法間接計數法主要用具計數依據優點缺點計算公式顯微鏡、細菌計數板或血細胞計數板涂布器細菌個數培養基上菌落數計數方便、操作簡單計數的是活菌不能區分死菌與活菌操作較復雜且有一定誤差每毫升原液含菌株數＝400×10000×每小格平均菌株數×稀釋倍數每毫升原液含菌株數＝平均菌落數/所用涂布液體積×稀釋倍數三、微生物的數量測定（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌（2）統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用

的_____培養基，可以從土壤中分離出

的細菌。脲酶以尿素作為唯一氮源選擇分解尿素CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶土壤中分解尿素的細菌的分離和計數1.實驗目的2.實驗原理

常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。實驗流程：樣品稀釋涂布平板微生物的培養與觀察

菌落計數土壤取樣制備培養基土壤中分解尿素的細菌的分離和計數①取樣地點要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。

（細菌適宜在該環境中生長）②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。

（細菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。）

土壤中分解尿素的細菌的分離和計數3.實驗步驟（1）土壤取樣注意事項：取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml（2）制備培養基①選擇培養基：以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養基：作為對照組，來判斷選擇培養基是否具有選擇作用土壤中分解尿素的細菌的分離和計數3.實驗步驟怎樣證明此培養基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養基牛肉膏蛋白胨培養基

是分離尿素細菌判斷該培養基有無選擇性實驗組對照組培養基類型是否接種

目的

結果只生長尿素細菌生長多種微生物是土壤中分解尿素的細菌的分離和計數①

測細菌數：一般用104、105、106稀釋液。②

測放線菌數：一般用103、104、105稀釋液。③

測真菌數：一般用102、103、104稀釋液。（3）樣品的稀釋與涂布平板

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數在30～300之間適于計數的平板。土壤中分解尿素的細菌的分離和計數在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？思考

選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。3.實驗步驟組別具體組別具體操作作用實驗組實驗組1涂布接種的選擇培養基三次重復排除偶然因素對實驗結果的影響，用以分離并計數能分解尿素的細菌。實驗組2涂布接種的選擇培養基實驗組3涂布接種的選擇培養基實驗組4涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養基實驗組4與實驗組1、2、3組對比用以驗證選擇培養基是否具有選擇作用。對照組對照組1不涂布接種的選擇培養基對照組1與實驗組1、2、3組對比用以驗證選擇培養基中是否含有雜菌。對照組2不涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養基對照組2與實驗組4對比用以驗證牛肉膏蛋白胨培養基中是否含有雜菌。實驗結果實驗組1、2、3分離得到尿素分解菌的單菌落；第4組得到多種菌落；第5、6組正常情況下無菌落。本實驗實驗組和對照組設計如下：土壤中分解尿素的細菌的分離和計數①本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例如，在標記培養皿時應該注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。土壤中分解尿素的細菌的分離和計數（3）樣品的稀釋與涂布平板注意事項：②建立“有菌觀念”。實驗室、實驗器材(取土樣的小鐵鏟、盛土樣的紙袋等)、操作者、空氣中都存在微生物，都有污染的可能，必須進行嚴格的消毒、滅菌，整個實驗過程(稱取土樣、稀釋土壤溶液等)要在酒精燈火焰旁進行。3.實驗步驟③本實驗耗時較長，需要事先規劃時間，以便提高實驗效率，在操作時有條不紊。①

培養條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌一般在30～37℃的溫度下培養1～2d。②

觀察：每隔24h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。③

一般來說，在相同的培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（4）微生物的培養與觀察3.實驗步驟土壤中分解尿素的細菌的分離和計數

（1）結合對照組，分析培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出一些菌落。

如果沒有接種的培養基上沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養基上的菌落數明顯多于選擇培養基上的菌落數，說明選擇培養基篩選出了一些尿素分解菌。土壤中分解尿素的細菌的分離和計數4.結果分析與評價

（2）你是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個平板的菌落數接近？

如果得到了兩個或多個菌落數為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進行菌落的計數。土壤中分解尿素的細菌的分離和計數4.結果分析與評價（3）你統計的每克土樣中能分解尿素的細菌的菌落數是多少？與其他同學統計的結果接近嗎？如果差異很大,可能是什么原因引起的？

如果是用同一土樣進行的操作，數據應該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規范、培養基配制是否合理等方面查找原因。內容現象結論有無雜菌污染的判斷對照的培養皿中無菌落生長培養基中菌落數偏高菌落形態多樣，菌落數偏高選擇培養基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數目大于選擇培養基上的數目樣品的稀釋操作得到3個或3個以上菌落數目在30~300的平板重復組的結果若選取同一土樣，統計結果應接近土壤中分解尿素的細菌的分離和計數4.結果分析與評價未被雜菌污染被雜菌污染培養基中混入其他雜菌選擇培養基具有篩選作用操作成功

本活動只是初步篩選了能分解尿素的細菌,對分離的菌種進行鑒定還需要借助生物化學的方法。你可以查閱相關資料,進一步設計實驗來鑒定自己分離的菌種。

細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會使培養基的堿性增強，pH升高，因此可以通過檢測培養基pH的變化來判斷是否發生了該化學反應，進而判斷該菌是否為尿素分解細菌。原理土壤中分解尿素的細菌的分離和計數5.進一步探究脲酶的檢測土壤中分解尿素的細菌的分離和計數5.進一步探究方法

在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。這樣，我們就可以初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。液體培養基：可以直接看液體的變色情況。固體培養基：可以觀察菌落周圍是否出現紅色環帶，紅色環帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強。課堂小結1.研究人員用無機鹽、瓊脂和石油配制的培養基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關表述是否正確。（1）這種培養基是一種選擇培養基。（

）（2）利用這種石油降解菌可以降解石油。修復土壤。（

）（3）相對于未被污染的土壤,從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。（

）√√√練習與應用一、概念檢測2.用稀釋涂布平板法來統計樣品中的活菌數時，通過統計平板上的菌落數就能推測出樣品中的活菌數,原因是（

）A.菌落中的細菌數目是固定的B.平板上的一個菌落就是一個細菌C.通過此方法統計的菌落數與活菌的實際數目相同D.平板上的一個菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個活菌D練習與應用一、概念檢測1.反芻（chú）動物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請你設計一個實驗從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。

反芻動物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空