本章主要學習內容和要求主要學習內容要求

miRNA概念與特點

常用miRNA檢測與定量的方法

掌握

第二十一章microRNA檢測技術在臨床的應用miRNA生物合成與功能miRNA檢測在腫瘤診斷中的應用

熟悉了解miRNA檢測在神經系統疾病診斷中應用

miRNA檢測在心血管系統疾病診斷中應用

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一、

miRNA概念與特點

(一)miRNA概念

miRNA是一類進化上保守的單鏈非編碼小分子RNA，定位于RNA前體的3‘端或5’端，具有在翻譯水平調控基因表達的功能。上一頁下一頁返回第一節概述

一、

miRNA概念與特點

（二）miRNA基本特征

1.結構特征

2.miRNA的存在形式

3.保守性

4.時空特異性上一頁下一頁返回第一節概述

一、

miRNA概念與特點

（三）不同生物的miRNA特點

植物與動物miRNA的區別

上一頁下一頁動物植物前體莖環結構短，簡單長，復雜，折回長度變異明顯加工過程先在細胞核內，后再細胞質僅在細胞核內作用機制大部分作為翻譯阻遏子，小部分導致靶mRNAs的降解大部分介導靶mRNAs的降解長度21-23nt21nt保守性高更高返回第一節概述

一、

miRNA概念與特點

（四）miRNA與siRNA的比較

1.miRNA與siRNA相同之處（1）二者的長度都約在22nt左右。（2）二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產物，所以具有Dicer產物的特點:5＇端磷酸，3＇端均有2個游離核苷酸。（3）miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。（4）二者都是RNA誘導的基因沉默復合體(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)組分，都具有組成RISC復合體的Argonaute蛋白家族，其功能界限已變得不清晰，如二者在介導沉默機制上有重疊。上一頁下一頁返回第一節概述

一、

miRNA概念與特點

（四）miRNA與siRNA的比較

2.miRNA和siRNA區別：（1）根本區別是miRNA是內源的，在基因組中有固定的基因座位；siRNA可以是人工體外合成的，也可以是基因組的轉錄片斷，降解片斷和轉座片斷，病毒基因組轉錄片斷等，。（2）二者結構上沒有本質區別，功能分子都是單鏈RNA，miRNA轉錄出來時必然是發夾狀的，siRNA可以由完全互補的雙鏈切斷而來，也可以從發夾來。（3）本質區別在于作用位點上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位點，一般在靶基因3′-UTR區，而siRNA由于是隨機產生的或者人工設計的，因此作用位點可以設計或改變，可作用于mRNA的任何部位。（4）在作用方式上，沒有本質區別，是否降解或翻譯抑制取決于互補程度，siRNA也可抑制靶標基因的翻譯。（5）miRNA的生理功能在于調控發育分化和調亡，適時調節內源基因表達，而siRNA是生物抵抗外來核酸片斷入侵的一種方式，原始作用是抑制轉座子活性和病毒感染。上一頁下一頁返回第一節概述二、miRNA生物合成與功能（一）miRNA生物合成

上一頁下一頁1miRNA生物合成過程

在細胞核內，基因組DNA轉錄生成較長的RNA分子（可長達1000nt），被雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Drosha

切割成長度大約70-100堿基的、具發夾結構的RNA分子（前體microRNA）。這些發夾結構的RNA通過核輸出蛋白exportin5機制轉運到細胞質，然后被第二個雙鏈RNA特異的核糖核酸酶Dicer切割，得到19-23nt大小的成熟的miRNAs

產物。返回第一節概述二、miRNA生物合成與功能（一）miRNA生物合成

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miRNA生物合成過程

返回第一節概述二、miRNA生物合成與功能（一）miRNA生物合成

上一頁下一頁2miRNA在基因組分布

獨立表達的miRNAs

成簇表達的miRNAs

位于內含子的miRNAs

返回第一節概述二、miRNA生物合成與功能（二）miRNA

生物學功能1.miRNA調控基因表達機制上一頁下一頁miRNA調控基因表達兩種機制miRNA調控蛋白翻譯

miRNA調控mRNA降解返回第一節概述

二、miRNA生物合成與功能（二）miRNA

生物學功能

2.miRNA調控基因表達的特征與優點（1）miRNA調控基因表達的特點

1）交叉調節;2）自我調節;3）可逆性調節.（2）miRNA調控基因表達的優點

1）與蛋白水平的調節相比，更加節省能量

2）與轉錄水平調節相比，miRNA

調節更迅速，而且是可逆的

3）內含子所編碼的miRNA

是一種對基因組資源的高效利用上一頁下一頁返回第一節概述三．miRNA應用（一）基因功能的分析（二）miRNA

功能和效應的評價（三）新型基因治療方案的設計和發展（四）抗病毒疫苗的設計和研制（五）功能缺失轉基因動物的建立上一頁下一頁返回第二節miRNA檢測與定量方法一、理想的miRNA檢測與定量方法miRNA檢測

1.具有足夠的靈敏性檢測到少量的miRNA；

2.具有足夠的特異性足以分辨一個堿基差異的

miRNA；

3.能夠進行miRNA表達的定量分析；

4.進行多樣本平行檢測；檢測過程簡便、經濟。上一頁下一頁返回第二節miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（一）基因芯片技術

miRNAmicroarray可以檢測組織特異的miRNA,并且實驗結果可重復率高。這種微芯片不僅可以檢測miRNA的類型,還可以對其進行定量。它可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達;通過設計適當的寡核苷酸探針,同時檢測成熟的miRNA及其前體分子;miRNAmicroarray可以用于高通量的篩選miRNA,并且可以用于臨床病例的篩選。

上一頁下一頁返回第二節miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（一）基因芯片技術上一頁下一頁基因芯片技術檢測miRNA表達的基本原理返回第二節miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（二）熒光定量技術實時定量逆轉錄PCR可用于檢測miRNA的表達水平。Step-loop實時定量是一項高特異度、敏感度的檢測miRNA表達的實驗技術，包括設計具有莖環（stemloop）結構的反轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針進行實時PCR2個關鍵步驟。該技術有以下優點：高度特異性，特異的step-loop反轉錄引物和探針確保反應不受其前體及基因組DNA污染等因素的干擾，對序列高度同源的miRNA也可精確區分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度，從幾個拷貝到幾萬個拷貝，定量線性范圍跨越7個數量級

上一頁下一頁返回第二節miRNA檢測與定量方法Step-loop反轉錄PCR檢測miRNA基本原理上一頁下一頁返回第二節miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法（三）克隆測序技術大多數現有的miRNA是通過cDNA克隆識別和鑒定出來的,這是發現miRNA的重要方法。構建miRNA的cDNA文庫通常有兩種方法,

一種是將所有的RNA通過變性聚丙烯酰氨凝膠電泳分離回收25nt以下的小片段RNA,隨后在RNA3′和5′端連上接頭,逆轉錄后與對應引物進行PCR擴增,再將片段克隆至載體,最后對每個克隆進行測序。第二種方法是分離出小片段RNA后,用poly(A)聚合酶在3′端進行多聚腺苷酸化反應,逆轉錄后,再在cDNA3′端進行鳥苷酸化反應,隨后進行擴增和測序,最后通過PAGE/Northernblot等予以驗證。

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上一頁下一頁克隆測序技術進行miRNA檢測的基本原理返回第二節miRNA檢測與定量方法二、幾種常用miRNA檢測與定量的方法

（四）原位雜交技術原位雜交(Insituhybridization)檢測miRNAs逐漸發展起來,它可以檢測候選miRNAs的短暫表達。應用原位雜交技術可進行石蠟包埋、福爾馬林固定的組織內的miRNA檢測，同時可以不再分離miRNA情況下，進行多細胞之間miRNA表達的檢測。

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RNA印跡即Northernblot是最經典的檢測真核生物RNA的量和大小及估計其豐度的實驗方法,可以從大量的RNA樣本中同時獲得這些信息,主要包括:①完整的RNA的分離;②根據RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離;③將RNA轉移到固相支持物上,在轉移過程中,要保持RNA在凝膠中的相對分布;④將RNA固定到固體支持物上;⑤固相RNA與探針分子雜交;⑥除去非特異結合到固相支持物上的探針分子;⑦對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。

上一頁下一頁返回第二節miRNA檢測與定量方法上一頁下一頁Northern雜交技術進行miRNA檢測的基本原理圖返回第三節miRNA檢測的臨床應用上一頁下一頁一、miRNA檢測在腫瘤診斷中的應用

最近的研究發現，miRNA表達與多種癌癥相關，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點（fragilesite）。這說明miRNAs在腫瘤發生過程中起至關重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人員將miRNA命名為“ONCOMIRs”。對患者進行的有關oncomiR的大型高通量研究，可以對癌癥進行新的分類，并對患者預后做出更為準確的預測。

返回第三節miRNA檢測的臨床應用上一頁下一頁一、miRNA檢測在腫瘤診斷中的應用（一）microRNA與癌癥產生

MicroRNAs誘發腫瘤的機制返回第三節miRNA檢測的臨床應用上一頁下一頁一、miRNA檢測在腫瘤診斷中的應用（二）oncoMIR的表達情況與人類多種惡性腫瘤的發生、發展、診斷、預后相關研究

miRNA

表達水平的變化,導致了腫瘤基因或抑癌基因轉錄后的異常調控,從而導致腫瘤的發生。通過尋找具有癌基因和抑癌基因性質的miRNA,可以為腫瘤的診斷和生物治療提供新的靶標。返回第三節miRNA檢測的臨床應用上一頁下一頁各種腫瘤組織內miRNA表達以及與預后的相關性

腫瘤類型miRNAS表達情況檢測方法與預后的關系腦腫瘤miR-21升高Northern雜交不清楚miR-221，miR-10b升高芯片雜交Northern雜交miR-128，miR-181a降低芯片雜交Northern雜交乳腺癌miR-21升高芯片雜交Northern雜交miR-21與miR-145表達水平與腫瘤增殖指數具有相關性miR-125b,miR-145降低芯片雜交Northern雜交結直腸腫瘤miR-143，miR-145miR-133b降低Northern雜交miR-31表達水平與腫瘤的分期有關miR-31,miR-95,miR-135b,miR-183升高定量PCR檢測返回第三節miRNA檢測的臨床應用上一頁下一頁各種腫瘤組織內miRNA表達以及與預后的相關性

腫瘤類型miRNAS表達情況檢測方法與預后的關系非小細胞肺癌let7降低芯片雜交定量PCR檢測Let7的低表達與miR-155高表達預示預后不佳miR-126降低芯片雜交定量PCR檢測miR-21，miR-205，miR-155升高芯片雜交定量PCR檢測肝細胞腫瘤miR-18，miR-224升高芯片雜交Northern雜交miR-18表達水平與腫瘤分化成負相關miR-199a,miR-195,miR-200a,miR-125a降低芯片雜交Northern雜交甲狀腺濾泡癌miR-197,miR-346升高芯片雜交定量PCR檢測生殖細胞腫瘤miR-372,miR-373升高原位雜交返回第三節miRNA檢測的臨床應用上一頁下一頁二、miRNA檢測在心血管系統疾病診斷中應用

目前有關miRNA在心臟病理生理過程的調節作用的研究已經取得一些進展。在心臟的發生發育與分化的調節方面，小分子RNA能幫助精確調節與心臟肌肉初期發育有關的關鍵蛋白的生產；如miR-1能夠靶向Hand2基因的mRNA，而Hand2基因是心臟形成的一種關鍵調節因子。小分子RNA適時地關閉Hand2蛋白的生成以促使心肌正常發育。同時，miR-1也是肌細胞的分化調節因子的直接作用靶點。研究發現，在心臟的肥大過程中，miR-19