分離方法氣相色譜法gaschromatography,

GC氣相色譜與質譜聯用GC-MS高效液相色譜

highperformanceliquidchromatography,

HPLC分離分析中的新技術毛細管電泳capillaryelectrophoresis,CE色譜法分離原理概述及分類有關的術語色譜法的基本理論分離度定性和定量分析色譜法chromatography與蒸餾，重結晶，溶劑萃取，化學沉積及電解沉積法一樣，也是一種分離技術。特別適宜分離多組分的試樣，是各種分離技術中效率最高和應用最廣的一種方法。最早創立色譜法的是俄國植物學家茨維特Tsweet將填入玻璃柱內靜止不動的一相固相或液相稱為固定相自上而下運動的一相一般是氣體，液體或超臨界流體稱為流動相裝有固定相的柱子玻璃或不銹鋼稱為色譜柱概述及分類分離植物色素實驗色譜法是一種物理、化學的分離、分析方法。利用混合物各組分在互相接觸的固定相和流動相中有不同的分配比（或不同的吸附能力），當兩相作相對運動時，這些組分在兩相中進行多次反復分配平衡（或吸附或解吸），從而使各組分得到分離，然后按順序被檢測。色譜的分類按照分離過程中相系統的形式和特征

柱色譜法

平板色譜法填充柱色譜法毛細管色譜法

紙色譜法

薄層色譜法1依據色譜過程中流動相和固定相的物理狀態氣相色譜法液相色譜法超臨界流體色譜法氣固色譜法氣液色譜法液固色譜法液液色譜法2流動相固定相按色譜動力學過程迎頭色譜頂替色譜洗脫色譜

線性洗脫色譜

非線性洗脫色譜34按所利用的物理化學原理吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠滲透色譜形成絡合物色譜色譜流出曲線及有關術語基線是柱中僅有流動相通過時，檢測器響應信號的記錄值。峰高:色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示。保留值:1死時間tM，不被固定相吸附或溶解的物質

2保留時間tR，試樣從進入開始到柱后出現峰極大值3調整保留時間t'R=tR

－tM

4分配比k，也稱容量因子。為組分在固定相和流動相中分配量之比,k=p/q=t'R

/tM

。（5）保留體積VR：組分從進樣開始到柱后出現濃度最大值時所通過的載氣體積（ml）。

VR=tR*FCFC為校正到柱溫、柱壓下，載氣在柱內的平均流速死體積VM：色譜柱內除了填充固定相以外的空隙體積。

VM=tM*FC

調整保留體積VM′：扣除死體積后的保留體積。

VR′=tR′*FC=VR―VM（6）相對保留值（r2?1）：組分２的調整保留值與組分１的調整保留值之比。

r2?1可用來表示色譜柱即固定相的選擇性，又稱選擇因子。r2?1值越大，兩組分的tR′相差越大，分離越好，r2?1=1時，兩組分不能分離。相對保留值的特點：r2?1只與柱溫及固定相的性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相無關。因此，它是GC中廣泛使用的定性依據。（7）區域寬度:是組分在色譜柱中譜帶擴張的函數，反映了色譜操作條件的動力學因素。度量法有:標準偏差；半峰寬W1/2；基線寬度Y。標準偏差：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半；半峰寬W1/2：峰高一半處對應的峰寬度；

W1/2=2.354基線寬度W:色譜峰兩側拐點上的切線在基線上的截距。

W=4（8）分配系數K樣品組分在固定相和流動相之間發生的反復多次的吸附、脫附和溶解、揮發的過程，叫做分配過程。分配系數K：在一定溫度下，組分在兩相之間分配達到平衡時的濃度比，是色譜分離的依據

分配系數是由組分和兩相的熱力學性質決定的。在一定溫度下，各物質在兩相之間的分配系數是不同的。具有小的分配系數的組分，每次分配后，在氣相中的濃度較大，較早地流出色譜柱；而分配系數大的組分，由于每次分配后，在氣相中的濃度較小，較晚流出色譜柱。當分配次數足夠多時，就能將不同的組分分離開來。相比，反映各種色譜柱柱型的特點分配比也決定于組分及固定相熱力學性質，不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關。對兩組分的選擇因子，兩組分具有不同的分配系數是色譜分離的先決條件。⑴分配系數是組分在兩相中的濃度比，分配比則是組分在兩相中分配總量之比。它們都與組分及固定相的熱力學性質有關，并隨柱溫、柱壓的變化而變化。⑵分配系數只決定于組分和兩相性質，與兩相體積無關。分配比不僅決定于組分和兩相性質，且與相比有關。⑶對于一給定色譜體系，組分的分離最終決定于組分在兩相中的相對量，而不是相對濃度，因此，分配比是衡量色譜柱對組分保留能力的重要參數，k值越大，保留時間越長。色譜流出曲線可以得到的重要信息根據色譜峰的個數，可以判斷試樣中所含組分的最少個數。根據色譜峰的保留值或位置，可以進行定性分析。根據色譜峰下的面積或峰高，可以進行定量分析。色譜峰的保留值及其區域寬度，是評價色譜柱分離效能的依據。色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相和流動選擇是否合適的依據。塔板理論塔板理論假設：⑴在每塊塔板上，兩相間的分配平衡是瞬間建立的，因此定義達到分配平衡的一小段柱長稱為理論塔板高度H，因而理論塔板數n=L/H⑵載氣進入色譜柱，不是連續的，而是脈動的，每次進氣量為一個板體積△V。⑶試樣開始時所有組分都加在第0號塔板上，且試樣在色譜柱方向的擴散可忽略不計。⑷分配系數在各塔板上是常數，與組分的量無關。為簡單起見，設色譜柱為5塊塔板（n=5）組成，并以r表示塔板編號r=0、1、2、3、4，某組分在兩相間的分配系數K=1，設該組分進樣量為1000μɡ，根據上述假設，在色譜分離過程中該組分在各塔板上的分配如下：單一組分在色譜柱內的分配過程。若試樣為多組分混合物，則經過很多次的分配平衡后，如果各組分的分配系數有差異，則在柱出口處出現最大濃度時所需的載氣板體積數亦將不同。由于色譜柱的塔板數相當多，因此，分配系數有微小差別，仍可獲得好的分離效果。

塔板理論導出理論塔板數的公式：峰越窄，n越多，H越小，此時柱效能越高，因而n或H可作為描述柱效能的一個指標。消除了死時間的影響

優點：（1）描述了溶質在色譜柱內的分配平衡和分離過程（2）解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，提出評價柱效的方法缺點：（1）該假設不符合柱內實際發生的分離過程（2）無法解釋譜帶擴寬的原因和影響板高的因素（3）不能解釋不同流速具有不同的塔板高度總結速率理論吸收了塔板理論中板高的概念，并同時考慮影響板高的動力學因素，指出:填充柱的柱效受渦流擴散，分子擴散，傳質阻力，流動相的流速等因素的控制，從而較好地解釋了影響板高的各種因素。vanDeemter

速率理論方程指出了色譜柱填充的均勻程度，填料粒度的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度對柱效的影響。板高渦流擴散項系數分子擴散項系數傳質阻力項系數流速⑴渦流擴散項（A）

A=2λdp式中dp為填充物的平均直徑，λ為填充不規則因子。因此，A與流動相的性質及線速度無關。結論：①使用粒度細及顆粒均勻的填料。②均勻填充。⑵分子擴散項（B）式中Dg為組分在氣相中的擴散系數，它除與組分的性質有關外，還與組分在柱中的停留時間、載氣的性質、柱溫等因素有關。γ指填充柱內氣體擴散路徑彎曲的因素（彎曲因子）。結論：①采用較高的載氣流速。②控制較低的柱溫。③使用相對分子量較大的載氣，如因N2為分子量大，縱向擴散小⑶傳質阻力相C傳質阻力系數C=氣相傳質阻力Cg+液相傳質阻力Cl結論：①采用粒度小的填充物。②采用相對分子量小的氣體作載氣，可減小Cg，提高柱效。結論：①降低固定相的含量，以降低液膜厚度。②采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度。③控制適當的柱溫。范第姆特方程式對選擇色譜分離條件具有指導意義。它指出了色譜柱填充的均勻程度、填料粒度的大小、流動相的種類及流速、固定相的液膜厚度等對柱效的影響。液膜厚度（4）載氣流速對板高的影響由范第姆特方程H=A+B/U+CU繪制的H——U曲線，曲線的最低點對應的塔板高度最小，該點的流速為流動相的最佳流速。

塔板高度與載氣線速度的關系為了縮短分析時間，往往使流速稍高于最佳流速思考題：1、對某一組分來說，在一定的柱長下，色譜峰的寬與窄主要取決于組分在色譜柱中的（1）保留值（2）擴散速度（3）分配比（4）理論塔板數2、使用填充柱，當固定液含量較高、載氣線速中等時，其塔板高度的主要控制因素是什么？3、固定相填充的均勻程度主要影響（1）渦流擴散（2）分子擴散（3）氣相傳質阻力（4）液相傳質阻力分離度柱效和選擇性理論塔板數n(n有效)是衡量柱效的指標，反映了色譜分離過程動力學性質。選擇性反映色譜分離的熱力學過程。常用色譜圖上兩峰間的距離衡量色譜柱的選擇性，其距離越大說明柱子的選擇性越好。柱子的選擇性主要取決于組分在固定相上的熱力學性質。(α)分離度也稱分辨率(resolution,Rs)。既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，稱為總分離效能指標，用相鄰兩色譜峰保留值之差與兩峰底寬平均值之比表示當Rs<1時，兩峰總有部分重疊；當Rs=1時，兩峰能明顯分離；當Rs=1.5時，分離程度可達99.7%，兩峰已完全分離。當然，更大的值分離效果會更好，但會延長分析時間。值越大，相鄰兩組份分離越好分離度受柱效n,選擇因子和容量因子k的控制第一項稱熱力學因素，第二項稱動力學因素，第三項稱容量因素基本色譜分離方程式1.的大小與兩組分的性質有關一般可以用如下的方法來調節:

改變流動相的組成，包括改變pH

改變固定相的組成改變柱溫采用特殊的化學效應2.增加塔板數，可以增加分離度3.容量因子k取決于組分和色譜柱兩者的性質

加大容量因子可以增加分離度，但是會延長分析時間，甚至造成譜帶檢測困難。常常通過改變柱溫或流動相的組成，將k控制在15之間。影響因素例1：有一根1米長的柱子，分離組分1和2，得到色譜圖。若欲得到R=1.2的分離度，有效塔板數應為多少？色譜柱要加到多長？1、用3米長的柱子分離A、B、C三個組分，A是不被保留組分，它們的保留時間分別是1.0分、16.4分、17.0分，B、C組分的峰底寬為1.0分，求該柱的分離度。2、在一根已知有8100塊理論塔板的色譜柱上，異辛烷和正辛烷的調整保留時間為800s和815s，設(1+k)/k≈1，試問（1）如果一個含有上述兩組分的樣品通過這根柱子，所得到的分離度為多少？（2）假定調整保留時間不變，當使分離達到1.0時，所需的塔板數為多少？3、當色譜柱溫為150℃時，其vanDeemter方程中的常數A=0.08cm，B=0.15cm2/s，C=0.03s，這根柱子的最佳流速為多少？所對應的最小塔板高度為多少？練習：4、在某色譜分析中得到下列數據：保留時間tR為5.0min，死時間t0為1.0min，液相體積為2.0ml，柱出口載氣流速F0為50ml/min。計算：（1）死體積；

（2）保留體積（3）分配系數5、在一個3米長的色譜柱上，分離一個樣品的結果如下：組分1的保留時間為14分，組分2的保留時間為17分，死時間和兩組份的峰高都為1分，求（1）兩組份的調整保留時間；（2）用組分2求色譜柱的有效塔板數及有效塔板高度；（3）兩組分的容量因子；（4）相對保留值和分離度；（5）若使兩組份的分離度為1.5，問所需要的最短柱長是多少。1、利用已知純物質的對照法定性在一定的固定相和一定的操作條件下，任何物質都有確定的保留值。將已知純樣品與待測試樣在相同條件下進行色譜分析，用TR、VR作指標（tM、VM固定不變），若二者相同可能是同一物質。保留值相同，而峰形不同，仍然不能認為是同一物質。定性和定量分析色譜定性分析峰高加入法峰高加入法是將已知純樣品加入待測組分后，再進行分析。若某組分峰比不加已知物時增高了。而半峰寬并不相應增加，則證明加入的已知物質與樣品中的某一組分為同一物質。應注意，在同一根色譜柱上用保留值鑒定組分有時不一定可靠。這是因為，不同物質有可能在同一根色譜柱上具有相同的保留值，所以應采用雙柱或多柱法進行定性分析，即采用采用兩根或多根性質不同的色譜柱進行分離，觀察未知物與標準樣品的保留值是否始終重合。2、利用文獻保留數據進行定性相對保留值法如果采用被測物與另一標準物質的相對保留值來定性，則某些操作條件的影響可相互消除。ris僅與柱溫、固定液性質有關，與其它條件無關。具體方法：從文獻上查得有關物質的相對保留值數據，注意這些數據是用什么固定液和在什么柱溫下測定的，然后在相同的固定液和柱溫下實驗，如兩者一致，一般是同一種物質。利用文獻保留指數定性保留指數是指組分的保留行為，用兩個緊密相連的基準物（一般是兩個正構烷烴）來標定。式中：XNi、XNZ、XN(Z+1)分別為待測物、具有Z個碳原子的正構烷烴、具有（Z+1）個碳原子的正構烷烴的調整保留值。要求：XNZ<XNi<XN(Z+1)，即未知峰應在兩峰之間。3、用經驗規律和文獻值進行定性分析碳數規律沸點規律在一定溫度下，同系物的調整保留時間的對數與分子中碳原子數呈線性關系，即：如果知道某一同系物中兩個或更多組分的調整保留值，則可根據上式推知同系物中其他組分的調整保留值。如果知道某一同系物中兩個或更多組分的調整保留值，則可根據上式推知同系物中其他組分的調整保留值。同族具有相同碳數碳鏈的異構體化合物，其調整保留時間的對數與它們的沸點呈線性關系，即：4、與其它方法相結合的定性分析法與質譜、紅外光譜等儀器相結合與化學方法配合進行定性分析較復雜的混合物經色譜柱分離為單組分，再利用質譜、紅外光譜或核磁共振等儀器進行定性鑒定。利用化合物具有的某些官能團的特性，經過特殊試劑處理，發生物理化學或化學反應后，其色譜峰將會消失、提前或移后，比較處理前后色譜峰的差異，可初步辨認官能團的存在。氣相色譜定量分析在一定操作條件下，被分析組分i的重量mi或其在載氣中的濃度是與檢測器的響應信號（峰高hi或峰面積Ai）成正比。色譜定量分析的基礎要想正確進行分析，需要解決三個問題：準確測定峰面積或峰高；準確求出比例系數；選擇合適的定量方法。1、峰面積或峰高的測量對稱形峰——峰高乘半峰寬法不對稱形峰——峰高乘平均峰寬法2、校正因子相對重和相對峰面積表組分真實配制（mi%）TCDFIDAi(cm2)Ai%Ai(cm2)Ai%乙醇501.5557.070苯501.23463.030？？？為了使檢測器產生的響應信號能真實地反映物質的含量，就要對響應值進行校正，引入了“定量校正因子”的概念。絕對校正因子在一定操作條件下，進樣量與響應信號成正比關系，即

mi=fi*Ai

或fi=mi/Ai式中fi稱為絕對校正因子。fi的物理意義：產生單位峰面積所需物質的量，它主要由儀器的靈敏度及操作條件決定。當mi的單位用g/l時，fi稱為絕對重量校正因子。當mi的單位用mol/l時，fi稱為絕對摩爾校正因子。當mi的單位用ml/l時，fi稱為絕對體積校正因子。相對校正因子fis指組分i與基準組分s的絕對校正因子之比當fi為重量校正因子時，當fi為摩爾校正因子時，當fi為體積校正因子時，無因次量，但它的數值與組分所采用的計量單位有關相對響應值檢測器的響應值（靈敏度）指一定量組分mi通過檢測器時所產生的信號大小。相對響應值與校正因子只與試樣、基準物質以及檢測器類型有關，而與操作條件如柱溫、載氣流速、固定液性質等無關。因而它們是一個能通用的常數。相對校正因子的測量方法：①準確稱量被測組分和基準物質，混合后，在實驗條件下分析，通過公式計算求得。熱導池檢測器用苯作基準，氫火焰離子化檢測器用正庚烷作基準。②在定量分析中，也可引用文獻發表的相對校正因子值，但以后的分析時，應盡可能使操作條件與文獻上測定條件一致。③通過相對響應值求得。例：將純苯與某組分A配成混合液，進行氣相色譜分析，苯的樣品量為0.435μg時，峰面積為4.00cm2，組分A的樣品量為0.653μg時的峰面積為0.50cm2，求組分A以苯為標準時的相對校正因子。3、定量方法歸一化法條件：當樣品中各組分都能流出色譜柱，并在色譜圖上能一一出峰，且各峰分離清晰，這樣可把各組分的百分含量之和按100%計算。各組分百分含量：分析同系物時，各組分的fis相近優點：①簡便、準確；②操作條件變化時，對分析結果