腫瘤患者在接受放射線和化療藥物治療時,射線和藥物對機體的免疫系統有抑制作用,致使機體的免疫功能進一步下降,影響了治療效果,并可導致一些不良反應。同時研究發現，腫瘤患者免疫功能下降常伴隨一些細胞因子水平的變化,如IL-2、IL-12、IFN、TNF等[4]。所以,解決腫瘤患者免疫功能低下問題成為治療腫瘤非常關鍵的環節。

最近,國內外學者提出生物反應調節(BRM)的概念,強調在腫瘤放化療及手術治療的同時應用BRM不但能提高患者的免疫功能,還可減輕上述治療對免疫系統及造血系統的損害,從而提高治療效果。在我國,中藥取自天然,來源廣泛,容易獲得,不良反應小。為此,本實驗試圖對枸杞多糖免疫調節作用進行研究,研究其對外周血淋巴細胞增殖及功能的影響。摘要為研究枸杞多糖(LBP)對正常人外周血淋巴細胞免疫調節功能的影響，通過無菌分離人外周血淋巴細胞,加入植物凝集素(PHA)和不同質量濃度LBP,MTT法檢測其對淋巴細胞增殖的影響;ELISA法檢測LBP作用后淋巴細胞培養上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達情況，來研究枸杞多糖對外周血淋巴細胞增殖及功能的影響。關鍵詞枸杞多糖;外周血;淋巴細胞;增殖;抗腫瘤;免疫功能一.實驗原理枸杞多糖(LBP)是傳統中藥材枸杞的主要成分之一,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成。而實驗證明多糖成分(如云菇多糖、靈芝多糖等)可通過激活機體的免疫系統來達到抗腫瘤的目的[1-2],目前對于枸杞多糖抑制腫瘤的免疫調節作用及免疫機制尚不十分清楚。PHA是T細胞非特異性有絲分裂原,能與T細胞表面CD3/TCR復合體結合,導致包括CD3+、CD4+、CD8+以及LAF-1等細胞表面分子磷酸化,通過激活PKC途徑引起細胞活化。TNF-α能夠直接殺死病毒和腫瘤,在CD8+T的成熟階段發揮著重要的信號作用,TNF-α缺乏時會導致效應性CD8+T細胞產生下降,影響其轉化為記憶性T細胞。可見,TNF-α除了對腫瘤細胞具有直接毒性和生長抑制作用外,還可以通過增強CD8+T細胞的細胞毒作用抵抗腫瘤的生長。本實驗主要是以枸杞多糖為材料來研究其對人外周血淋巴細胞免疫調節作用,為進一步開發增強免疫力的抗腫瘤藥物提供參考。二、實驗材料與分組

1.材料健康人外周血采自20～30歲健康志愿者。枸杞多糖由本校實驗中心從優質枸杞子中分離提取,純度為99%。RPMI-1640為Gibco公司產品。植物凝集素（PHA)、MTT試劑均為Sigma公司產品。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、ELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。淋巴細胞分離液為上海生化試劑二廠產品。胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產品。2.

分組據實驗孔中加入枸杞多糖質量濃度的不同以及加入或不加PHA將實驗分為對照組、PHA組、枸杞多糖組、PHA＋枸杞多糖組。三、實驗方法

1.

人外周血淋巴細胞的分離和增殖反應取健康人外周血約5mL,肝素抗凝,加入等體積PBS混勻,用淋巴細胞分離液經密度梯度離心法分離外周血單核細胞(PBMC)取白細胞層用PBS洗滌2次,加入含10%FBS的RPMI-1640培養基,置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養2h。未貼壁細胞為淋巴細胞,將其重懸于培養液中,2%臺盼藍試驗證實細胞存活率>95%,調整濃度為2×109L-1。加入96孔板中,每孔100μL,實驗孔加入不同質量濃度的枸杞多糖,加入或不加PHA,枸杞多糖終質量濃度分別為100,80,60,50μg/L,每組均設4個復孔。常規培養72h,各孔加入MTT(5g/L)20μL,培養過夜,離心棄去培養上清,每孔加入DMSO150μL,混勻后以測定波長570nm、參考波長620nm檢測各孔吸光度(A)值,并計算增殖指數。增殖指數=實驗組A值/對照組A值×100%。將所測及計算結果記錄于表一。

表一各組外周血淋巴細胞增殖情況比較（x±s,n=4）

組別濃度/（㎎/L）A值增值指數對照組－

PHA組0.050

枸杞多糖組50

60

80

100PHA＋枸杞多糖組50+0.050

60+0.050

80+0.050

100+0.0502.TNF-α的測定按1項方法培養淋巴細胞,所得到的培養上清用ELISA法測定TNF-α水平,在酶標測試儀上測定570nm處A值。根據標準曲線計算出培養上清液中細胞因子的量。將所測及計算結果記錄于表二。表二各組外周血淋巴細胞產生TNF-α情況比較組別濃度/（㎎/L）TNF-α（μg/L）對照組－

PHA組0.050

枸杞多糖組50

60

80

100（x±s,n=4）

3.

統計學處理采用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析和LSD,實驗結果用x±s表示。四、結果預測

1.枸杞多糖對人外周血淋巴細胞增殖的影響采用MTT法檢測發現，在50~100mg/L質量濃度下,枸杞多糖可單獨誘導淋巴細胞活化和增殖,并且在PHA的作用下枸杞多糖可顯著促進PHA活化的淋巴細胞增殖(P<0.01)。2.枸杞多糖對人外周血淋巴細胞TNF-α產生的影響采用ELISA法檢測發現，PHA對淋巴細胞產生TNF-α沒有明顯影響(P>0.05),經枸杞多糖作用后,淋巴細胞產生的TNF-α水平顯著升高(P<0.01),且有明顯的量效關系。五、結果分析1.枸杞多糖與PHA協同作用使得淋巴細胞顯著增殖，可能是因為枸杞多糖強化了PHA活化作用,促進淋巴細胞進入增殖周期而發生增殖。2.如果實驗結果與此不同或相反，可能與以下原因有關：人體的個體差異使得其免疫功能不同，從而影響實驗結果；實驗操作手法及過程也可能對實驗結果產生影響。參考文獻[1]何燕,吳雄志.中藥多糖的免疫調節作用[J].四川中醫,2001,19(2):1