植物遺傳轉化的策略與方法楊清植物轉基因研究概況遺傳轉化的策略遺傳轉化的主要方法植物轉基因現狀1983年比利時根特大學Montagu實驗室、孟山都公司Fraley領導的研究小組、華盛頓大學Chilton的研究室首次將外源基因轉入煙草、胡蘿卜。到1993年，世界上轉基因成功的植物就已突破60種，至今已有35科120多種植物轉基因獲得成功。從1986年首批轉基因植物被批準進入田間試驗，至今國際上已有30個國家批準數千例轉基因植物進入田間試驗，涉及的植物種類有40多種。主要包括延熟番茄,抗除草劑的玉米、棉花、大豆和油菜,抗蟲的馬鈴薯、棉花和玉米,抗病毒的西葫蘆、南瓜和番木瓜,雄性不育的玉米和萵苣,以及改變油脂特性的油菜和大豆等。1987年我國首次獲得轉Ｂt基因的煙草和番茄以來，相繼獲得了轉Ｂt基因的棉花、水稻、玉米等。我國目前正在研究的轉基因植物有47個種，涉及的各類基因103個。遺傳轉化的策略按目的基因數量單基因轉化雙基因轉化多基因轉化(同源重組構建多基因雙元載體)Multiple-roundinvivosite-specificassemblyMultiRoundGateway多聚蛋白酶解法依賴歸巢酶的pRCS/pAUX和

pSAT載體系統Cre/loxP位點特異重組系統MultiSiteGateway(常規的)酶連重組法BiBAC/TAC大分子量DNA轉化法多基因轉化方法連續再轉化法轉基因植物雜交聚合法多載體共轉化法多基因載體轉化法

多重同源重組法:一種基于同源重組構建多基因雙元載體的方法(張興國)按目的基因導入位置細胞核葉綠體按啟動子的類型組成型啟動子特異性啟動子遺傳轉化的主要方法農桿菌介導的遺傳轉化基因槍法電擊法注射法化學藥劑誘導轉化花粉管通道法根癌農桿菌Ti質粒轉化系統外植體+農桿菌共培養芽誘導抗生素篩選生根培養,植株再生分子檢測,轉基因植株獲得技術特點：轉化拷貝數低攜帶目的基因片段大整合后外源基因結構變異小操作簡便等優點該技術已成為轉化成功最多的一種轉化方法基因槍法(particlegun)又稱微彈轟擊法(microprojectilebombardment或particlebombardment)。該法借助高速運動的金屬粒子將附著于其表面的核酸分子引入受體細胞，外源基因進入受體細胞核后整合到染色體組，然后通過組織培養再生出完整個體(植株)。優點：受體材料來源廣泛靶受體類型廣泛縮短了轉基因周期、轉基因植株變異率低及通常具有正常的育性缺點：轉化效率不高多拷貝插入費用較高電擊法又稱電穿孔法(electroporation)。在高壓電脈沖作用下，使新鮮分離的原生質體質膜形成可逆性瞬間通道，外源DNA穿過通道進入細胞，并整合到染色體組。

優點：不受宿主限制操作簡便對植物細胞不產生毒性轉化效率較高，特別適于瞬間表達缺點：易造成原生質體的損傷存在原生質體再生困難注射法開始用于動物卵細胞，后來被用于植物。用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中產生高的壓力及卵細胞的吸收，使外源DNA進入受精的卵細胞中，從而獲得轉基因植株。對于子房大、多胚珠的作物，可以說是一種簡便可行的轉化途徑。化學藥劑誘導轉化

常用的化學誘導劑：聚乙二醇(PEG)多聚鳥氨酸(PLO)聚乙烯醇(PVA)PEG是一種細胞融合劑。PEG法是最常用的化學基因轉化方法,它是將Ti質粒與原生質體共同培養在含有PEG和Ca2+的溶液中，在高pH值條件下,原生質體攝取外源DNA分子,然后經再生獲得轉基因植株。優點：不受宿主范圍的限制操作簡便成本底缺點：一般只適用于原生質體的轉化，而原生質體再生植株并不容易，轉化效率低;再生植株常不可育或形態異常、多拷貝插入等現象。花粉管通道法利用開花植物授粉后形成的花粉管通道，直接將外源目的基因導入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞，實現目的基因的轉化。步驟：１）去除花冠;２）用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約１／４處，再退回２毫米左右;３）注入含外源目的基因的緩沖液;４）正常管理，收獲種子,經篩選獲得轉基因植株。技術特點：直接、簡便易行;不需要組織培養的繼代，從而排除了植株再生的障礙；但轉化效率較低；適合于花器官較大的植物。小結

雖然有不同轉基因方法，但使用最為廣泛的方法仍是農桿菌法和基因槍法兩種方法。轉化方法的選擇，取決于植物種類和實驗室自身具備的條件。遺傳轉化實例類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶

3GT基因馬鈴薯塊莖中的特異表達受體材料:

馬鈴薯品種Desiree目標基因