2023/2/11第一章蛋白質的結構與功能

(Chapter1:StructureandFunctionofproteins)教學內容第一節蛋白質的分子組成一、蛋白質的元素組成二、蛋白質的結構單位三、蛋白質的輔基四、肽鍵和肽（一）肽鍵與肽鍵平面（二）肽（三）生物活性肽第二節

蛋白質的分子結構一、一級結構二、二級結構三、三級結構四、四級結構五、維持蛋白質結構的化學鍵第三節蛋白質結構與功能的關系一、蛋白質一級結構與功能的關系二、蛋白質構象與功能的關系第四節蛋白質的理化性質一、一般性質二、大分子性質第五節

蛋白質的分離、純化與結構分析蛋白質化學與中藥2023/2/122023/2/13蛋白質(Protein)是生命的物質基礎，是生物體的基本組成成分，幾乎所有的細胞和組織都含蛋白質。蛋白質是組織細胞的結構成分，并參與幾乎所有的生命活動。蛋白質在物質轉運、物質代謝、遺傳信息控制、損傷修復、信號轉導、免疫防御等以及高等動物的識別與記憶、感覺與思維等方面都起著重要的作用。第一節蛋白質的分子組成2023/2/14一、蛋白質的元素組成蛋白質主要由C、H、O、N四種元素組成，還含有少量的S。N元素是蛋白質的特征元素，在蛋白質分子中的含量比較恒定，約占16%。因此，可通過測定樣品中的含N量來計算出蛋白質的含量。樣品蛋白質含量=樣品含氮量×6.252023/2/15二、蛋白質的結構單位（一）氨基酸的結構合成天然的蛋白質的氨基酸共有20種，稱為標準氨基酸，它們具有相應的遺傳密碼。20種標準氨基酸中，脯氨酸是α-亞氨基酸，其余都是α-氨基酸。20種標準氨基酸中，除甘氨酸以外，其余19種氨基酸的α-碳原子都是手性碳原子，均為L-α-氨基酸。氨基酸的結構2023/2/162023/2/17（二）氨基酸的分類分類依據分類R基結構與性質非極性脂肪族R基氨基酸、極性不帶電荷R基氨基酸、芳香族R基氨基酸、帶正電荷R基氨基酸、帶負電荷R基氨基酸R基酸堿性酸性氨基酸、堿性氨基酸、中性氨基酸人體內能否自己合成必需氨基酸、非必需氨基酸分解產物進一步轉化生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨基酸1.非極性脂肪族R基氨基酸2023/2/18習慣名稱符號分子量（Da）pK1pK2pKR等電點甘氨酸GlyG752.349.605.97丙氨酸AlaA892.349.696.01脯氨酸ProP1151.9910.966.48纈氨酸ValV1172.329.625.97亮氨酸LeuL1312.369.605.98異亮氨酸IleI1312.369.686.02甲硫氨酸MetM1492.289.215.742.極性脂肪族不帶電荷R基氨基酸2023/2/19習慣名稱符號分子量（Da）pK1pK2pKR等電點絲氨酸SerS1052.219.155.68蘇氨酸ThrT1192.119.625.87半胱氨酸CysC1211.9610.288.185.07天冬酰胺AsnN1322.028.805.41谷氨酰胺GlnQ1462.179.135.653.芳香族R基氨基酸2023/2/110其中酪氨酸的R基含酚羥基，具有極性。苯丙氨酸（R基為苯環）、色氨酸（R基為吲哚基）為非極性氨基酸。習慣名稱符號分子量（Da）pK1pK2pKR等電點苯丙氨酸PheF1651.839.135.48酪氨酸TyrY1812.209.1110.075.66色氨酸TrpW2042.389.395.894.帶正電荷R基氨基酸2023/2/111習慣名稱符號分子量（Da）pK1pK2pKR等電點賴氨酸LysK1462.188.9510.539.74組氨酸HisH1559.176.007.597.59精氨酸ArgR1742.179.0412.4810.765.帶負電荷R基氨基酸2023/2/112習慣名稱符號分子量（Da）pK1pK2pKR等電點天冬氨酸AspD1331.889.603.652.77谷氨酸GluE1472.199.674.253.22（三）氨基酸的性質1.紫外吸收特征色氨酸和酪氨酸對280nm的紫外線有一吸收峰，由于大多蛋白質含色氨酸和酪氨酸，測定樣品溶液280nm的吸光度，用于蛋白質定量分析。2023/2/1132023/2/1142.茚三酮反應α-氨基酸可與茚三酮水合物發生氧化還原反應，生成藍紫色化合物。該化合物在570nm處有一個吸收峰，可用于氨基酸的定量分析。2023/2/1153.兩性電離和等電點氨基酸含有呈酸式電離的羧基和呈堿式電離的氨基，因此氨基酸是兩性電解質，電離以后可以既帶正電荷又帶負電荷，稱為兼性離子。在某一pH條件下，氨基酸解離成陽離子和陰離子的傾向相等，溶液中的氨基酸以兼性離子形式存在，且凈電荷為零，此時溶液的pH值稱為氨基酸的等電點（isoelectricpoint,pI）。氨基酸的兩性電離2023/2/116三、蛋白質的輔基2023/2/117分類輔基舉例糖蛋白糖類免疫球蛋白、凝集素、干擾素、人絨毛膜促性腺激素磷蛋白磷酸基酪蛋白核糖核蛋白核酸核糖體、端粒酶、信號識別顆粒血紅素蛋白血紅素血紅蛋白黃素蛋白黃素核苷酸琥珀酸脫氫酶金屬蛋白鐵鐵蛋白鋅醇脫氫酶、碳酸酐酶鈣鈣調蛋白鉬固氮酶銅銅藍蛋白2023/2/118（一）肽鍵與肽鍵平面

1.肽鍵：一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基縮合失去一分子水形成。2023/2/1192.肽鍵平面肽鍵屬于單鍵，但具有部分雙鍵剛性的性質，不能自由旋轉。與肽鍵相連的原子始終處在同一個平面，稱為“肽鍵平面”（amideplane）。肽鍵平面肽鍵平面肽鍵2023/2/120肽鍵平面（二）肽1.肽是氨基酸的鏈狀縮合物多個氨基酸通過肽鍵連接起來的分子稱為肽。2-10個稱寡肽（oligopeptide），10個以上稱多肽（polypeptide）。2.蛋白質是大分子肽在蛋白質分子中，當很多氨基酸通過肽鍵連接起來成為一條很長的鏈狀結構時，稱為多肽鏈（polypeptidechain）。2023/2/121一些蛋白質的分子量2023/2/122蛋白質來源分子量（Da）氨基酸數肽鏈數細胞色素c人130001041核糖核酸酶A牛胰137001241溶菌酶C雞蛋清139301291肌紅蛋白人170531531糜蛋白酶A牛胰216002413糜蛋白酶原A牛胰220002451血紅蛋白人645005744白蛋白人685006091己糖激酶酵母1020009722RNA聚合酶大腸桿菌45000041585載脂蛋白B人51300045361谷氨酰胺合成酶大腸桿菌6190005628122023/2/123多肽鏈的結構

氨基酸殘基的R基構成多肽鏈的側鏈（sidechain），參與形成肽鍵的原子與α-碳原子一起構成其主鏈骨架（backbone），保留了完整的α-羧基的末端稱羧基端或C端（C-terminus）；保留了完整的α-氨基的末端稱氨基端或N端（N-terminus）。側鏈N端C端主鏈骨架HOH（三）生物活性肽2023/2/124分類舉例（氨基酸數）功能（1）血液活性肽①血管緊張素Ⅱ（8）增大外周阻力，升高動脈血壓②緩激肽（9）抑制組織炎癥③胰高血糖素（29）促進肝糖原分解（2）腦組織活性肽①促甲狀腺激素釋放激素（3）刺激垂體前葉促甲狀腺激素分泌②促性腺激素釋放激素（10）促進黃體生成素和促卵泡激素分泌③生長激素釋放抑制激素（14）抑制生長激素等分泌④促腎上腺皮質激素釋放激素（41）促進促腎上腺皮質激素分泌⑤促腎上腺皮質激素（39）刺激腎上腺皮質激素分泌⑥抗利尿激素（9）增強腎臟鈉水重吸收，刺激血管收縮⑦催產素（9）刺激子宮收縮⑧促黑激素（18）調節黑素細胞代謝（3）神經肽腦啡肽（5）神經傳導，痛覺抑制（4）腸道活性肽①胃泌素14、17、34（14、17、34）②胰泌素（27）調節消化道運動、消化腺分泌調節消化道運動、消化腺分泌（5）其他組織活性肽①心鈉素（28）促進腎臟排鈉排水，降低動脈血壓②降鈣素（32）防止血鈣血磷過高2023/2/125谷胱甘肽2023/2/126第二節蛋白質的分子結構2023/2/127一、一級結構蛋白質的一級結構（primarystructure）是指多肽鏈中氨基酸組成與排列順序。一級結構決定蛋白質的高級結構，它包括氨基酸所有的共價連接，尤其是肽鍵和二硫鍵。氨基酸的排列順序是由遺傳密碼決定的，通過肽鍵連接起來，故肽鍵是蛋白質結構中的主鍵。2023/2/128胰島素的一級結構2023/2/129二、二級結構蛋白質的生物學活性和理化性質主要由其空間結構的完整性決定，空間結構是指蛋白質的二、三、四級結構，又稱為高級結構。蛋白質的二級結構（secondarystructure）是指蛋白質分子中由于主鏈原子肽鍵平面的相對旋轉，構成的有規則的局部空間構象，如α螺旋、β折疊、β轉角等。蛋白質多肽鏈在二級結構的基礎上進一步聚集、折疊形成超二級結構。2023/2/1301.α-螺旋α-螺旋（α-helix）是指肽鍵平面通過α-碳原子的旋轉，主鏈原子盤繞成右手螺旋結構。螺旋上升一圈大約需要3.6個氨基酸殘基，螺距為0.54nm，螺旋直徑為0.50nm，R基分布在螺旋的外側。相鄰兩個螺旋之間肽鍵的C=O與H–N形成氫鍵，從而使α-螺旋能夠穩定。2023/2/131α-螺旋（α-helix）結構示意圖0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側鏈2023/2/1322.β-折疊β-折疊（β-pleatedsheet）是蛋白質分子中肽鏈相對伸展的一種結構形式，其主鏈通過肽鍵平面折疊成鋸齒狀。一個折疊單位含兩個氨基酸，R基交替排列在β-折疊兩側。同一條肽鏈內的若干肽段或不同肽鏈之間所形成的數段β-折疊可以平行結合，形成裙褶樣結構。相鄰β-折疊主鏈骨架的C=O和H–N之間形成氫鍵，使其構象穩定。數段結合的β-折疊可以是同相平行，也可以是反向平行。2023/2/133β-折疊（β-pleatedsheet）結構示意圖2023/2/1343.β-轉角β-轉角（β-turn）是指蛋白質分子中，肽鏈形成180°的回折，構成一個轉角。一個β-轉角由4個氨基酸構成，其中第1個氨基酸殘基的C=O與第4個氨基酸殘基的H–N之間形成氫鍵，使構象穩定。第2個氨基酸常為脯氨酸。2023/2/135β-轉角（β-turn）結構示意圖

4.無規卷曲無規卷曲（randomcoil）是指蛋白質分子中的某些肽段，其走向沒有規律可循，肽鏈的肽鍵平面不規則排列，形成較為松散的二級空間結構。2023/2/1362023/2/1375.超二級結構超二級結構（supersecondarystructure）又叫模體（motif）或基序，是指二級結構單元進一步聚集和結合形成的特定構象單元，如αα、βαβ、βββ等。超二級結構是蛋白質從二級結構延伸到三級結構的一個新的結構層次，如螺旋-環-螺旋（HLH）、亮氨酸拉鏈和鋅指結構。超二級結構2023/2/1382023/2/139亮氨酸拉鏈亮氨酸疏水R基DNA2023/2/140鋅指結構HisHisCysCysZnB

A

2023/2/141三、三級結構

三級結構（tertiarystructure）是指在二級結構基礎上，多肽鏈中相距較遠的側鏈R基通過相互作用進一步盤繞成特定的、不規則的空間構象，其包括了主鏈和側鏈所有原子的空間排布。維系三級結構的化學鍵主要有疏水鍵、氫鍵、離子鍵和范德華力等非共價鍵及二硫鍵等少量共價鍵。蛋白質的多肽鏈在形成三級結構時，其非極性的疏水側鏈形成疏水核，而大多數極性基團則分布在分子的表面，形成親水區。1.部分蛋白質的三級結構人肌紅蛋白：153個氨基酸構成，包括8段α-螺旋（78%）及無規卷曲和β-折疊。整個分子呈球形，內部幾乎都是疏水基團，極性基團位于表面。分子結構有一凹陷的口袋區，結合有一個血紅素輔基。牛胰核糖核酸酶：124個氨基酸構成，4個二硫鍵，3段較短α-螺旋和3段較長β-折疊。2023/2/142肌紅蛋白2023/2/143牛胰核糖核酸酶2023/2/1442.結構域許多較大蛋白質的三級結構中存在一個或多個穩定的、相對緊密的且在構象上常明顯可區分的球狀區域，這種結構稱為結構域（domain）。結構域與結構域之間常由無規卷曲的松散肽段相連，可通過適當酶切與分子其他部分分開。一個結構域常常由一個外顯子編碼，可有幾十個至幾百個氨基酸殘基組成。同一蛋白質分子中的各結構域相對獨立，并且具有不同的生理功能。2023/2/1452023/2/146Src結構域（為蛋白酪氨酸激酶）2023/2/147四、四級結構

由兩條或更多的多肽鏈構成的蛋白質分子，還要具備四級結構（quaternarystructre）才具有活性。在四級結構中，每一條肽鏈都有特定且相對獨立的三級結構，稱為該蛋白質的一個亞基。多個亞基之間按照特定的方式以非共價鍵結合，形成特定的空間結構，稱為蛋白質的四級結構。在四級結構中，亞基與亞基之間通過疏水鍵、氫鍵、離子鍵和范德華力等非共價鍵相互作用而聚合在一起。2023/2/148血紅蛋白四級結構示意圖血紅蛋白由4個亞基構成的異四聚體，包括兩個α-亞基，兩個β-亞基。2023/2/149

蛋白質一、二、三、四級結構示意圖（B）二級結構（α-螺旋）（A）一級結構（C）三級結構（B）二級結構（β-折疊）（D）四級結構血紅素輔基2023/2/150五、維持蛋白質分子空間構象的主要化學鍵

1.氫鍵氫鍵（hydrogenbond）是蛋白質分子中最多的非共價鍵。是指當氫原子與電負性很強的原子相連時，會帶上部分正電荷，與另一帶部分負電荷的原子產生靜電引力。2.離子鍵離子鍵（ionicinteractionorionicbond）又稱鹽鍵（saltbridge），是帶正電荷的基團與帶負電荷的基團之間所產生的靜電引力。

2023/2/151五、維持蛋白質分子空間構象的主要化學鍵

3.疏水鍵疏水鍵（hydrophobicinteraction）是指兩個疏水基團為了避開水相而相互聚集在一起的作用力。4.范德華力范德華力（VanderWaalsinteractions）是指任何兩個原子間的距離保持范德華半徑時的一種靜電引力。5.二硫鍵二硫鍵（disulfidebondordisulfidebridge）由蛋白質分子中兩個半胱氨酸殘基側鏈上的巰基（—SH）氧化脫氫產生。2023/2/152二硫鍵胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸2023/2/153蛋白質分子中的主要次級鍵

離子鍵疏水鍵二硫鍵

氫鍵范德華力2023/2/154第三節蛋白質結構與功能的關系蛋白質的一級結構和空間結構與功能均有密切的關系。蛋白質的一級結構決定其高級結構，一級結構含有其空間構象的全部信息，而蛋白質的空間構象決定蛋白質的生物學功能。通過對蛋白質結構與功能關系研究發現：①功能不同蛋白質其氨基酸序列一定不同；②已經闡明的數千種遺傳病都存在蛋白質一級結構異常；③不同物種具有相似功能的蛋白質其一級結構和構象也相似。2023/2/155一、一級結構與功能的關系

蛋白質的一級結構決定其構象蛋白質的一級結構相似則其功能也一致改變蛋白質的一級結構可以直接影響其功能1.蛋白質的一級結構決定其構象2023/2/1562.蛋白質的一級結構相似則其功能也一致2023/2/157胰島素的來源胰島素的一級結構差異A-8A-9A-10B-30人蘇氨酸絲氨酸異亮氨酸蘇氨酸豬、狗蘇氨酸絲氨酸異亮氨酸丙氨酸牛丙氨酸絲氨酸纈氨酸丙氨酸羊丙氨酸甘氨酸纈氨酸丙氨酸馬蘇氨酸甘氨酸異亮氨酸丙氨酸兔蘇氨酸絲氨酸異亮氨酸絲氨酸3.改變蛋白質的一級結構可以直接影響其功能2023/2/158正常β鏈：H-纈氨酸—組氨酸—亮氨酸—蘇氨酸—脯氨酸—谷氨酸—谷氨酸—異常β鏈：H-纈氨酸—組氨酸—亮氨酸—蘇氨酸—脯氨酸—纈氨酸—谷氨酸—

正常紅細胞鐮狀紅細胞2023/2/159二、空間構象與功能的關系1.構象決定性質和功能蛋白質根據構象可分為纖維狀蛋白質和球狀蛋白質：纖維狀蛋白質多為結構蛋白；球狀蛋白質主要是酶、調節蛋白、轉運蛋白和免疫球蛋白等。2.變構改變活性（1）血紅蛋白變構血紅蛋白的主要功能是對O2和CO2的運輸。當血紅蛋白結合氧之前叫脫氧血紅蛋白，分子構象為緊張態（T態），當血紅蛋白結合氧以后，α1β1與α2β2兩個二聚體彼此滑動15°，其構象由T（tense）態轉變為松弛態（R態），稱為氧合血紅蛋白。T態：亞基之間結合力強，氧合力弱R態：亞基之間結合力弱，氧合力強2023/2/1602023/2/161血紅蛋白結合氧前后構象的變化

Hb(T態)HbO2(R態)α1β1α2β215o（2）血紅蛋白氧解離曲線2023/2/162（3）血紅蛋白運氧能力影響因素PCO2、2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）、體溫升高，pH降低時，血紅蛋白氧合力減弱，氧解離曲線右移。2,3-BPG是糖酵解2,3-BPG支路中間產物，糖酵解加強，其含量增加，使血紅蛋白氧合力減弱，促進氧分子釋放，氧解離曲線右移。CO使血紅蛋白氧合力增強，氧解離曲線左移。2023/2/163（4）變構蛋白與變構效應一些物質能與蛋白質相互作用，稱為蛋白質的配體。蛋白質分子中與配體結合的部位稱為配體結合位點或配體結合域。變構蛋白常有兩個或多個配體結合位點，他們可結合相同或不同的配體。其中能使蛋白質變構的配體叫變構劑，變構劑結合的位點又叫調節部位。變構效應分異促效應（變構劑與配體是不同物質）和同促效應（即協同效應，變構劑與配體是相同物質）；協同效應又分為正協同效應和負協同效應。2023/2/1643.蛋白質構象病2023/2/1652023/2/166一、一般性質1.蛋白質的紫外吸收特征蛋白質分子中的肽鍵吸收220nm紫外線；蛋白質分子中的酪氨酸和色氨酸殘基的吸收280nm紫外線。蛋白質溶液對280nm紫外線的的吸光度與濃度成正比，用于蛋白質定量分析。2023/2/1672.蛋白質的呈色反應蛋白質能與某些試劑產生特殊的顏色反應，可以用于對蛋白質的定量分析。茚三酮反應：蛋白質分子游離氨基與茚三酮反應，呈藍紫色。雙縮脲反應：2分子尿素脫氨縮合成雙縮脲，堿性條件下與Cu2+螯合成紫紅色。蛋白質分子中肽鍵可發生雙縮脲反應。酚試劑反應：含磷鉬酸-磷鎢酸，堿性條件下與蛋白質生成深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物）。米倫試劑反應、考馬斯亮籃顏色反應3.氨基端反應2,4-二硝基氟苯、丹磺酰氯、異硫氰酸苯酯可與肽鏈氨基端的α-氨基反應，水解后得到相應的衍生物，通過層析鑒定。可用于分析蛋白質的一級結構。2023/2/1684.蛋白質的兩性電離和等電點蛋白質分子的α-氨基和α-羧基雖然都參與形成肽鍵，但是在蛋白質的側鏈上仍然存在一些可電離的基團，如天冬氨酸和谷氨酸殘基的β-羧基和γ-羧基，賴氨酸的ε-氨基、精氨酸的胍基和組氨酸的咪唑基等，它們有的呈酸式電離，有的呈堿式電離，因此，蛋白質和氨基酸一樣可以電離成兼性離子。在某一pH條件下，蛋白質的凈電荷為零，則該pH值為蛋白質的等電點（pI）。2023/2/1692023/2/170蛋白質的等電點二、大分子特性1.蛋白質溶液是膠體溶液蛋白質的分子量在一萬到百萬之間，分子的直徑在膠體顆粒的范圍（1~100nm）。因此，當蛋白質溶于水中，可以形成膠體溶液。由于蛋白質表面分布有很多親水的基團，會結合很多水分子，形成水化膜，使蛋白質顆粒不容易聚集起來。另一方面，蛋白質分子在溶液pH值不等于pI時，往往帶有同種電荷而相互排斥。因此，蛋白質溶液是穩定親水膠體溶液。2023/2/1712.沉降與沉降系數在離心力的作用下，蛋白質顆粒發生沉降，對于某一特定蛋白質顆粒，其沉降速度在單位離心力場強度下為一常數，稱為蛋白質的沉降系數，用S（Svedberg，1S=10-13秒）表示。蛋白質的沉降速度與蛋白質的分子質量和分子形狀有關，用沉降系數可以粗略地反映蛋白質分子的大小。2023/2/1723.變性與復性天然蛋白質在某些物理或化學因素作用下，其特定的天然空間構象部分或全部改變，從而導致理化性質改變和生物學活性的喪失，稱之為蛋白質變性(denaturation)。變性蛋白質表現為結晶性喪失、擴散系數減小、溶解度降低、黏度增大、280nm吸光度增加、易被蛋白酶水解。2023/2/1733.變性與復性當蛋白質溶液的pH值接近其等電點，則加熱可以使蛋白質形成較堅固的凝塊，該凝塊不溶于強酸或強堿，稱為蛋白質凝固（coagulation）。有些蛋白質變性是可逆的，當變性程度較輕，去除使其變性的因素，能恢復或部分恢復其原來的空間構象，并恢復其生物學活性，稱為蛋白質復性（renaturation）。2023/2/1742023/2/175核糖核酸酶的變性與復性示意圖8M尿素或β-巰基乙醇透析第五節蛋白質的分離、純化與結構分析一、蛋白質沉淀蛋白質分子相互聚集從溶液中析出的現象稱為蛋白質沉淀(precipitation)。使蛋白質溶液穩定的因素主要有兩個：同種電荷和水化膜。如果破壞使蛋白質溶液穩定的兩個因素（如調節溶液pH值至等電點或加入脫水劑），蛋白質則會相互聚集而從溶液中析出沉淀。2023/2/1762023/2/177蛋白質的沉淀示意圖1.鹽析法鹽析法（saltingout）是指向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽破壞蛋白質的膠體穩定性（中和電荷、破壞水化膜），從而使蛋白質從溶液中析出沉淀的方法。常用的中性鹽：(NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4等。沉淀下來的蛋白質，一般不變性。2023/2/1782.有機溶劑沉淀蛋白質有機溶劑（如乙醇、丙酮等）沉淀蛋白質，是利用它們的強親水性破壞水化膜，由于它們不能中和蛋白質所帶電荷，因此，需要在等電點附近沉淀蛋白質。在常溫下一般會發生變性，但是在低溫條件下，變性則發生得緩慢。2023/2/1793.重金屬離子沉淀蛋白質帶負電荷的蛋白質可與重金屬離子（如鉛、汞、銅、銀等）結合形成不溶性鹽而沉淀。需調節溶液的pH>pI。沉淀下來的蛋白質一般發生了變性。2023/2/1804.生物堿試劑及某些酸類沉淀蛋白質帶正電荷的蛋白質也可以與生物堿試劑（苦味酸、鞣酸、鎢酸）或某