谷氨酰胺的發酵控制

WEIBO.COM/JDPPT發酵條件控制代謝途徑調控412右圖是谷氨酰胺發酵工藝圖L-谷氨酰胺是在谷氨酸發酵工藝基礎上，在谷氨酰胺合成酶作用下生產L-谷氨酰胺。谷氨酰胺采用谷氨酸生產菌,可以實現谷氨酸發酵轉向谷氨酰胺發酵。發酵轉換的條件是:一、發酵培養基中有高濃度的銨鹽存在,其含氮量比谷氮酸發酵時所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成酶的催化下,由谷氨酸進一步合成為谷氨酸胺；二、菌體增殖進入平衡期后,發酵pH值必須調整到6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被分解成谷氨酸。谷氨酰胺合成機理發酵條件的變更，谷氨酸產生菌中的谷氨酰胺合成酶活力增加，而谷氨酸合酶活力受到抑制Textinhere谷氨酸谷氨酰胺積累谷氨酰胺由于細胞環境的影響，谷氨酰胺易從細胞中分泌出來積累在發酵液中，而谷氨酸滲透性減小(滯留在細胞內)1發酵條件控制L-谷氨酰胺生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)催化下進行的，所以發酵法生產L-Gln的關鍵在于調控GS酶活性。NH4+濃度谷氨酸脫氫酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸合酶GOGATTesch在谷氨酸棒桿菌(CorynebaCteriumglutamicum)中研究了NH4+濃度對GDH、GS、GOGAT活性的影響，結果如下：NH4+濃度增加時，GDH活性基本沒有發生變化；NH4+濃度大于10mmol／L時，GS、GoGAT活性小于1mmol／L的10％，即分別低于110U／mg蛋白、42U／mg蛋白；發現谷氨酸脫氫酶酶促反應是谷氨酸棒桿菌攝取NH4+的第一步反應。此研究結果為梯度補氮生產L-Gln提供了理論基礎。GS的表達易受到高濃度銨鹽的阻遏，氮源的一次性補加也容易導致谷氨酰胺合成酶活性急劇下降；在銨鹽不足時，GS表達量就會增加，所以氮饑餓處理可以提高中GS的表達量，梯度補加氮源也可以盡量減少GS活力的快速喪失。1.1氮源氮饑餓處理李春等為了解決高濃度銨鹽阻遏谷氨酰胺合成酶表達與谷氨酰胺合成需要過量銨之間的矛盾，提出了原位氮饑餓與銨鹽梯度補加協同調控策略，提高了谷氨酰胺的產量，最高可達2.19%，比原位氮饑餓工藝提高了近72%，比未經過氮饑餓處理的舊工藝提高了近200%。陳奎發等設計了在線氮饑餓處理的發酵過程；在限制初始氮源濃度的條件下，菌體在生長后期自然進入氮饑餓狀態，GS酶表達量增加，此后再提供充足的銨鹽，提高L-Gln的合成能力，結果使L-Gln的產量提高了69％，達到11.5g／L，菌體內谷氨酰胺合成酶活性提高了2倍以上。1.2金屬離子為了提高谷氨酰胺的產量，金屬離子特別是Zn2+、Mg2+和Mn2+的供給是必要的。Zn2+對谷氨酰胺合成酶具有刺激作用，同時Zn2+還可增強NH4Cl對谷氨酰胺酶的抑制作用，使其不能分解谷氨酰胺。1.3pH對谷氨酰胺發酵的影響pH主要影響酶的活性和菌的代謝

在中性和微堿性條件下（PH7.0-8.0）積累谷氨酸，在酸性條件下積累谷氨酰胺發酵前期應控制pH值在偏堿性環境，以促進菌體生長，并激活谷氨酸合成酶的活性，保證谷氨酰胺合成前體谷氨酸的合成；發酵后期應控制pH值在偏酸性環境，以增加谷氨酰胺合成酶的活性，同時抑制谷氨酰胺酶的活性，使谷氨酰胺大量積累生成，而減少谷氨酸的生成量。1.4供氧對谷氨酰胺發酵的影響氨基酸發酵過程中，供氧不足會積累乳酸等副產物，菌體減少。通過通氣攪拌增加溶氧量。生產谷氨酰胺條件影響細胞膜通透性二代謝途徑調控天津短桿菌株合成谷氨酰胺的主流代謝中，有幾個關鍵酶控制其強度，這幾個酶分別受不同代謝物的反饋調節，活化這些酶有利于L-GLn的生物合成。（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它受天冬氨酸的反饋抑制；（2）丙酮酸激酶，它是一個別構酶，受乙酰CoA、丙氨酸、ATP的反饋抑制；（3）丙酮酸脫氫酶系，該酶是催化不可逆反應的酶，受乙酰CoA、NADH、GTP的反饋抑制；（4）異檸檬酸脫氫酶，ADP和NADH抑制此酶的活性；（5）Glu脫氫酶和（6）GLn合成酶，此二酶是保證α-酮戊二酸向GLu而不是向草酰乙酸的三羧酸循環方向的關鍵。同時在此循環中還存在著向天冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸的分枝代謝，我們設法減弱分枝代謝而強化主流代謝，主要的方法是減弱催化這些分枝代謝的酶。

生物合成途徑中關鍵酶的調控陳國強等人重組了一株含有透顫菌血紅蛋白基因vgb和谷氨酰胺合成酶突變基因glnA’的野生谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC14067，可以實現在較低溶氧量水平，較低成本下，生產較高產量的谷氨酰胺。vgb是編碼細菌中血紅素蛋白(VHb)的基因，VHb是以氧合態參與和氧有關的代謝，通過將氧傳遞給呼吸鏈，而調節末端氧化酶的活性，改變氧化磷酸化的效率，進而改變低氧條件下的代謝途徑，從分子水平上提高重組菌對氧氣的利用能力，為解決谷氨酰胺大規模生產過程中要求高溶氧的問題提供了一個想法。谷氨酰胺合成酶突變基因谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合酶(GS／GOGAT)體系是由銨離子濃度調節的，在較低銨離子濃度下發揮作用，在高銨離子濃度條件下受抑制。谷氨酰胺合成酶的調節開關是在其肽鏈405位置的酪氨酸被定點突變為苯丙氨酸，從而失去了這種調節機制，使得谷氨酰胺合成酶可以在高銨離子條件下發揮催化功能，將谷氨酸轉化為谷氨酰胺。中村純等人通過敲除細菌染色體上的谷氨酸合酶基因的方法降低細胞內谷氨酸合酶活性,來減少谷氨酰胺的分解;通過增加編碼谷氨酰胺合成酶基因的拷貝數和修飾編碼谷氨酰胺合成酶基因的翻譯控制區,來增強谷氨酰胺合成酶基因的表達,促使菌體內積累更多的谷氨酰胺。鄭強等進行glnA基因的克隆與過量表達，利用谷氨酸棒桿菌發酵過程產生的谷氨酸為底物，在glnA基因表達的GS酶的催化下，誘導后的重組茵發酵液中的L-谷氨酰胺產量提高了1.8倍，培養基質中的銨鹽反應生成L-谷氨酰胺，理論上可以節