聚合酶鏈式反應

(PolymeraseChainReaction,PCR)

目的了解DNA特異性片段體外擴增的基本原理，掌握聚合酶鏈式反應的基本操作方法。基本原理在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴增位于兩段已知序列之間的DNA區段的酶促合成反應。基本步驟

1.變性：加熱使雙鏈DNA變為單鏈

2.退火：降溫使引物和互補模板在局部形成雜交鏈

3.延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應加熱或在堿性條件下可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為DNA變性。去掉變性條件后，單鏈DNA可以重新結合，再形成雙鏈，稱之為DNA復性，又叫退火。PCR反應中退火指引物與模板的結合。退火溫度太高,不能很好地復性太低,產生非特異性復性退火溫度通常比理論熔解溫度低3-5℃DNA雙鏈解離一半時的溫度稱為熔解溫度(Tm)。PCR引物的設計

1.引物設計的原則

2.引物設計的方法

（一）PCR引物設計原則1、引物長度一般為15~30個核苷酸。引物過短會使PCR的特異性降低，過長會提高相應的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度74℃,亦會影響產物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的堿基盡可能隨機分布，避免出現嘌呤，嘧啶的堆積現象。尤其是引物的3′端不應有連續3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區錯誤配對。引物中G+C的含量在45~55%左右。設計引物時要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。3、引物自身內部不應存在互補序列以避免折疊成發夾結構。按經驗，引物自身存在的連續互補序列，一般不超過3bp。4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其應避免3′端的互補重疊。5、引物的堿基序列不應與非擴增區域有同源性。尤其是引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。6、引物3′端堿基是引發延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因為它們形成的堿基配對比較穩定。7、引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點。

Primer5Oligo6（二）引物設計的方法PCR反應五要素1模板2引物3酶4dNTP5bufferPCR反應成分1.PCR反應的緩沖液：①10~50mmol/LTris-Cl

緩沖液，72℃時pH7.2,調節反應體系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用環境維持偏堿性。②50mmol/L的KCl可促進引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。③鎂離子濃度：1.5mmol/L

TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+

濃度過低，會顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。2.dNTPs

濃度：20~200μmol/L

dNTP濃度高可加快反應速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本。反之，低濃度的dNTP會導致反應速度的下降，但可提高反應的特異性及實驗的精確性。3.耐熱DNA聚合酶：0.5~5u

在PCR反應中，DNA聚合酶是最關鍵的因素之一。PCR發明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它們因對熱的穩定性差而未得到廣泛應用。直到耐熱的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)應用于PCR反應，才使這一技術得到迅速發展和廣泛應用。4.引物：0.1~0.5μmol/L

PCR反應引物濃度為0.1~0.5μmol/L。如此過量的引物才能確保模板DNA一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產物擴增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴增效率。但如果該比例太低，PCR效率也會降低。

5.模板在一定范圍內PCR產量隨模板濃度的升高而顯著升高，但模