動物細胞培養基本技術與原理第一頁，共六十九頁，2022年，8月28日細胞與組織培養（體外培養）(cellandtissueculture)：

從機體中取出組織或細胞，模擬體內生理條件在體外進行培養，使之生存和生長。包括三個層面：器官培養、組織培養、細胞培養分別代表細胞水平、組織水平或器官水平的培養第二頁，共六十九頁，2022年，8月28日動物細胞培養的主要領域及意義動物細胞的培養特性動物細胞培養的生存條件主要講3方面問題：第三頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、動物細胞培養的主要領域及意義

單克隆抗體與現代醫學動物胚胎孵育與畜牧業動物細胞培養與現代醫藥業動物克隆的廣泛應用第四頁，共六十九頁，2022年，8月28日1.單克隆抗體技術與現代醫學單克隆抗體技術步驟：*骨髓瘤細胞(myelomacell)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合

雜交瘤細胞(hybridomacell)。第五頁，共六十九頁，2022年，8月28日雜交瘤細胞的特性：*既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology)。

第六頁，共六十九頁，2022年，8月28日單克隆抗體的特性：*具有高度的特異性、靈敏性與準確性應用：臨床醫學的疾病診斷。生產各種免疫疫苗。用于某些腫瘤的治療。用于各種基礎醫學研究。

第七頁，共六十九頁，2022年，8月28日2.胚胎孵育與畜牧業農畜動物胚胎移植：利用胚胎技術大批量生產優質胚胎，從而可以降低胚胎成本，擴大移植胚的來源。體外受精：加快農畜良種化。利用體外受精技術進行核移植、性別控制和基因導入，工廠化生產遺傳性狀穩定、生產性能優良的家畜。第八頁，共六十九頁，2022年，8月28日類型動物細胞培養的產物

人疫苗小兒麻痹癥、狂犬、風疹、腦炎、乙肝表面抗原、皰疹、某些癌癥動物疫苗口蹄疫、雞瘟病、豬霍亂、馬腦炎、牛痢疾、犬瘟、草魚出血病酶

尿激酶、細胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原激活劑、膠原酶、酪氨酸脫羧酶激素

促紅細胞生成素、促間質細胞激素、絨毛膜促性腺激素、促黃體激素、促濾泡激素、生長激素免疫調節因子白細胞活化因子、轉移抑制因子、胸腺素、白細胞介素、干擾素、血清胸腺因子、巨噬細胞毒力因子、β-細胞生長因子

3.動物細胞規模化培養與現代醫藥治療性抗體抗體藥物第九頁，共六十九頁，2022年，8月28日4.動物克隆技術有益應用動物克隆技術的應用前景：（1）保存優良的動物品種（2）拯救瀕臨滅絕的珍惜動物（3）利用克隆動物工廠生產蛋白質藥物（4）利用克隆技術生產人體器官第十頁，共六十九頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、動物細胞特性動物細胞在活體內的特性培養條件下動物細胞生長特性培養條件下動物細胞生理特性第十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日1.動物細胞在活體內的特性在活體內，動物細胞:分化的動物細胞在功能上具有明確的分工，并具有明顯的形態學特征。

如肌肉細胞為紡錘形，以便于行使收縮伸展功能；神經細胞具有很長的分支，很多的纖維，以便接受和傳遞刺激；紅細胞呈園盤狀，有利于和周圍環境交換氣體和在血管內流動；上皮細胞由于它要覆蓋于表面，常常相互擠壓成不規則形狀。增殖分化第十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日活體內的動物細胞按照分裂能力可以分為三大類：第一類是能保持繼續分裂能力的細胞，可以繼續不斷地分裂，如骨髓干細胞、各類前體細胞；第二類細胞群是永久失去分裂能力的細胞，如各類高度特化的細胞；第三類是靜止細胞群，即所謂的G0細胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，則重新進入細胞分裂。如人的肝臟細胞等。第一類和第三類細胞在適當條件下可進行離體培養。第十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2.培養條件下動物細胞的生長特性離體培養的動物細胞可分為：

貼壁依賴型(anchorage-dependent)非貼壁依賴型(anchorage-independent)兼性貼壁細胞第十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日1）貼壁依賴型簡稱為貼壁細胞，包括成纖維細胞型、上皮細胞型、游走細胞型、多形性細胞型。

成纖維細胞型

細胞形態與體內成纖維細胞形態相似，胞內呈梭形或不規則三角形，中央有園形核，胞質向外伸出2～3個長短不同的突起。細胞群常連接成網，生長時呈放射狀或火焰狀。除真正的成纖維細胞外，心肌、平滑肌、成骨細胞培養時均屬這一類型。第十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日游走細胞型

在支持物上分散生長，不連接成片，細胞胞質常伸出偽足或突起，呈活躍的游走和變形運動，速度快而方向不規則。在一定條件下，可轉變為成纖維細胞型。多形性細胞型

某些組織和細胞，如神經細胞，難以確定它們的穩定形態，可統歸于多形細胞型。nervecell第十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日第十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日2）非貼壁依賴型

也稱懸浮型，這類細胞培養時不貼附于支持物上，可在培養液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞等均屬于此類，細胞一般呈圓形。

3）兼性貼壁細胞

動物細胞培養中，有些細胞呈現雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養，如中國地鼠卵巢細胞、小鼠L929細胞等。

第十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日4.培養條件下動物細胞的生理特點1）動物細胞的分裂周期長動物細胞分裂周期一般為12～48小時，它不僅隨細胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細胞所需的時間也不同。此外，培養條件如溫度、pH、培養基的成分等，也會影響分裂周期的長短。第二十頁，共六十九頁，2022年，8月28日第二十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日2）接觸抑制(contactinhibition)現象除少數懸浮培養細胞外，大多數正常二倍體細胞的生長都需要在一定的基質（如玻璃、塑料等）上貼附，伸展后才能增殖。當細胞在基質上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個細胞與其周圍的細胞相互接觸時，細胞就停止增殖，即細胞密度不再增加，這一現象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現象。第二十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日3）有限細胞系和永久細胞系動物細胞離體培養起始物--原代培養（primaryculture）經繼代培養后即成為有限細胞系(finitecellline)。有限細胞系即使培養條件均能滿足細胞繁殖生長，它們也只能在有限的時間內生存，一般經過30~50世代后細胞將逐漸死亡。第二十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日“代”：繼代次數和存活時間的長短因細胞來源的年齡和種族不同而有差異。年齡越大繼代次數越少。人胚成纖維細胞約可以培養50代，而成年人的成纖維細胞則不能繼代50次，同樣是成纖維細胞，取自雞胚的成纖維細胞可繼代培養30代，而小鼠的只能培養8代。

第二十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日大多數細胞系在有限的代數內以不變的形式增殖，當超過有限世代后，它們可能有兩種情況：一是衰老死亡，二是發育成永久細胞系或稱連續細胞系。有限細胞系轉換成永久細胞系的過度期稱為轉換期(crisis)，其轉換過程在動物細胞培養中稱為體外轉化(invitrotransformation)。永久細胞系有如下特征：細胞形態變化，如細胞變小，黏附性減少，具有較高的核質比；生長速率增加，倍增時間縮短；對血清的依賴性減小；貼壁依賴性降低；細胞異倍體和非整倍體增加，細胞接種到體內后，生癌率上升。永久細胞系的建立是動物細胞規模化培養的前體。

第二十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日4）動物細胞的環境敏感性動物細胞與微生物和植物細胞相比，其培養難度要大一些，其主要原因是動物細胞只有細胞膜，而沒有細胞壁的保護。動物相比對培養環境十分敏感，一切影響細胞膜變形的因素都會影響動物細胞存活。動物細胞培養對營養條件的要求也十分復雜。

第二十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日三、動物細胞的環境要求第二十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日1.動物細胞培養的環境要求1）無污染環境2）溫度

昆蟲細胞培養溫度一般是25～28℃哺乳動物細胞的培養溫度一般是37℃。

總體上講，動物細胞忍受低溫的能力比忍受高溫的能力強。如哺乳動物細胞在45℃下只能存活1小時，但在25℃條件下仍然能慢速生長，并維持長時間不死，甚至在4℃下數小時后，再置于適宜溫度下細胞仍然可以正常生長。液氮凍存。第二十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日3）pH

動物細胞培養適宜的pH一般在，低于6.8或高于7.6都不利于細胞生長，嚴重時會導致細胞死亡。培養細胞對pH的要求因培養時間長短有關，一般原代細胞要求較嚴格，而永久細胞系對pH具有較強的忍耐性。

第二十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日4）氣體環境及溶氧一般細胞在培養初期要求較低的溶氧水平，而在對數生長期或培養后期，對溶氧水平要求增加，如果供氧不足，將導致細胞缺氧而死亡。除了氧氣供應外，還應注意培養基的氧氣和CO2的平衡。第三十頁，共六十九頁，2022年，8月28日5）滲透壓動物細胞培養滲透壓包括兩個方面的問題：培養基的滲透壓維持細胞體內的滲透壓維持

大多數動物細胞對滲透壓的忍耐程度較強，只要培養基的滲透壓變化不是很劇烈，一般對培養物不會造成致命傷害。動物細胞滲透壓的維持一般采用平衡鹽溶液。

第三十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日四、動物細胞培養第三十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日基本概念和基本步驟:取材分離和組織消化細胞計數常用培養法細胞的常規檢查細胞系與克隆動物細胞的大規模培養細胞的凍存與復蘇第三十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、基本概念（generalconcept）：細胞培養（cellculture）：將動物組織或細胞分散成單個細胞，在模擬機體內的生長環境條件下，使其在體外環境繼續生長增殖的過程。原代（初代）培養：指將機體取出的組織或細胞進行初次培養的過程。原代培養的細胞大約增殖10代左右，稱為原代細胞。傳代（繼代）培養：從原代培養的細胞繼續轉接培養，稱為傳代培養。傳代培養的細胞稱為傳代細胞。第三十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、取材、分離和組織消化(todrawthematerialsfromtissue，separation，digestion)（一）取材——獲取組織原則上各種動物組織都可進行體外培養，而實際上幼齡組織（尤其是胚胎組織）比老齡組織容易培養、分化程度低的比分化程度高的容易培養、腫瘤組織比正常組織容易培養。取材前要對所取組織的各種情況進行詳細記錄；所用器皿用前嚴格消毒滅菌，取材時嚴格無菌操作。第三十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日取材方法:

處死動物→取出組織塊，放入小燒杯中→用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎塊，補加3~5mlHanks液，用吸管輕輕吹打；→低速離心，棄去上清液，留下組織塊。（也可用手術刀片將組織塊切碎，優點：對細胞損傷較小，缺點是操作時間長，容易污染）→對某些軟組織碎組織塊，可放入注射器玻璃管中或1mm不銹鋼/尼龍網篩擠壓分離。第三十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）組織消化(tissuedigestion)

用生物化學的方法將剪碎的組織塊分散成細胞團或單細胞。1、常用消化液適用范圍（1）胰蛋白酶：適用于細胞間質較少的軟組織，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、腎、傳代細胞等。（2）膠原酶：適用于纖維組織、上皮組織、癌組織等。（3）其他酶：鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等，根據酶的作用特點及組織成分不同適當選用（4）EDTA：最適于消化傳代細胞時，常與胰蛋白酶配合使用。 第三十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、組織消化操作方法(tissuedigestionmethodofoperation)（1）胰蛋白酶消化(trypsindigestion)①將剪碎的組織塊放入有玻璃珠的三角燒瓶中，加入30~50倍體積的0.25%胰蛋白酶；②37℃水浴內消化30~60min，每5~10min搖動一次。根據效果可中間更換消化液。（靜止10min，吸去2/3上清液，補加新鮮胰蛋白酶）③Hanks液漂洗兩次，每次2~3min；④800r/min離心5min，棄上清液，加入營養液。如有大塊，可用紗網過濾。如消化傳代細胞，可與EDTA混用。第三十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）膠原酶消化(collagenaseenzymaticdigestion)①培養瓶中放入1~5mm3大小的碎組織塊，加5ml2000u/ml的膠原酶溶液，使終濃度為200u/ml，pH6.5；②36.5℃水浴24~48h，視情況可適當延長，無需搖動。期間可更換酶液一次；③見組織塊已變軟，分散于瓶底時，輕微震蕩使散成細胞團或單細胞。小心倒出培養液，瓶底可能附著一些巨噬細胞，借此可將其分開（單獨培養或棄之不用）；④800r/min離心5min，棄上清液，重懸于BSS液中，再重復離心一次；⑤加入培養液制成細胞懸液，用于接種。第三十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日三、細胞計數(cellcounting) ——計數懸浮液中細胞的形態及濃度，以判斷消化或稀釋程度（亦用于培養液中細胞濃度的檢查）①染色：在干凈的離心管中加入9滴細胞懸液，再加入1滴0.4%臺盼藍，混勻，靜置2~3min；②充池：在計數板蓋片邊緣加入1~2滴染色的細胞懸液，使之完全充滿計數板與蓋玻片間的空間（無氣泡或溢出）第四十頁，共六十九頁，2022年，8月28日第四十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日③計數：在顯微鏡下記錄計數板四角四個大方格中的活細胞（不染色細胞）總數。一團細胞按一個細胞計數。壓線細胞，數上不數下，數左不數右。④計算：

細胞懸液濃度（細胞個數/ml）=（4大格細胞總數/4）×104×稀釋倍數注意：如細胞團數超過10%，說明消化不充分。細胞接種濃度：3~10×105/ml第四十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日四、常用培養法(generalcultivation)（一）組織塊培養法(tissuepiececultivation)

將組織塊剪切成小塊，直接放入培養瓶中，貼附一段時間后，細胞從組織塊長出，最終形成單層細胞。第四十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日1、懸滴培養法(dropculture)——最簡單、最原始的培養法懸滴培養法缺點：細胞生長空間狹小氣體不足，不能持續長時間生長培養基易液化，需要常更新培養基凹玻片折光，不便于觀察。第四十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、旋轉管培養法(rotatetubeculture)①組織塊或細胞可交替地接觸營養液和空氣，利于細胞生長；②培養管緩慢轉動，使整個管內壁全部長滿細胞，提高了細胞產量，適于較大量的組織培養和各種長期傳代細胞的培養。缺點：不易在顯微鏡下觀察。3、灌注小室培養法(dabblebooth

cultivation)為大規模培養系統提供了參考原理。第四十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日4、卡氏瓶培養法卡氏瓶(carlsberg'sflask)（如下圖）：①將組織塊剪碎，BSS漂洗。②轉移到另一只培養皿，在解剖顯微鏡下去掉不需要的組織如脂肪、壞死組織等。將組織塊切成1mm3小塊。③用預先潤濕的滴管轉移到消毒離心管，靜置使組織小塊下沉，吸去上清。以新鮮BSS漂洗。重復2~3次。第四十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日④轉移到培養瓶（每個25ml的培養瓶可放置20~30塊組織小塊），吸去液體。加入1ml生長培養液，輕斜擺動培養皿，使組織小塊均勻分布。蓋好瓶蓋，36.5℃培養18~24h。⑤待組織塊粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培養液；然后每周更新培養液一次。培養3~5周，細胞不斷增長，肉眼或低倍鏡下觀察可見圍繞組織周圍生長猶如日暈，稱“生長暈”。⑥取出中央組織塊，用預先濕潤的滴管移到另一新的培養瓶。重復④~⑥操作。⑦在原生長暈培養瓶內換入新鮮培養液。待生長暈細胞擴展至約50%培養瓶底表面時，進行細胞培養。第四十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）單層細胞培養法(monolayermethod)

組織塊經胰酶消化分散成較小的細胞團或單個細胞，在合成培養液中附在瓶壁上長成單層，即形成所謂單層細胞培養。

1、原代培養(primaryculture)（初代培養）第四十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日第四十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日2、傳代培養(serialsubcultivation):傳代的理想時期：對數生長期，細胞80~90%或剛剛全部匯合。方法：①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶與EDTA混合液，蓋滿瓶底，作用2~5min；②檢查：如細胞間隙變大，細胞質回縮，則終止消化。③終止消化：吸出消化液；加入Hanks液，輕輕轉動，洗去殘留的消化液。如單用胰蛋白酶，可直接加入培養液。③細胞計數：用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落，制成懸液，計數并記錄其濃度；④重新稀釋接種培養。第五十頁，共六十九頁，2022年，8月28日根據細胞特點，掌握細胞消化時間和選擇消化方法。第五十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日（三）組織塊單層細胞培養法(tissuemonolayermethod)

把組織剪成更小的小塊（0.5~1mm3），由于其體積很小，無需任何粘著劑即能直接附于瓶壁上。細胞自組織塊邊緣向外長出，最后連接成片，形成單層細胞。優點：簡化了原代單層細胞的培養過程。是當前各培養室常用的原代培養法。第五十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日方法：①取一定量組織置于小燒杯中，先用BSS漂洗2~3次去掉血污，然后反復剪成0.5~1mm3的小塊。②加入1~2ml培養液，用吸管輕輕吹打，使組織塊懸浮。③移入培養瓶，并在瓶壁上吹勻。翻轉，使有組織塊的瓶壁朝上，加入培養液，塞緊瓶口，置37℃溫箱培養1~2h；待組織牢固貼于瓶壁，再輕輕翻轉，使培養液浸泡組織小塊，靜止培養。為促進細胞貼壁，也可先在瓶內壁涂一層血清。第五十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日第五十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日（四）懸浮細胞培養法(suspendedcellculture)

利用旋轉、振搖或攪拌的方法不讓細胞貼壁，使其在培養液中呈懸浮狀態生長。適用細胞：淋巴細胞、腫瘤細胞、傳代細胞系培養基：合成培養基＋5~10%血清＋0.1%甲基纖維素培養細胞密度：5~7×105cell/ml.特點：細胞增殖快，產量高，培養過程簡單，是動物細胞大規模培養的理想模式。第五十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（五）微載體培養法(microcarrierculture)載體：DEAE-交聯葡聚糖微粒、DEAE-纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無機玻璃基質微載體等微載體培養系統培養細胞步驟：1、選擇合適的微載體類型——獲得最大量的細胞，以微載體能全部懸浮在培養液內為最好2、浸泡水化及消毒 用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液浸泡3h以上3、接種（根據細胞類型決定接種濃度）4、培養觀察與細胞計數5、消化6、分離細胞或傳代培養第五十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（六）多孔載體培養(porositycarrierculture)優點：增加細胞固定化穩定性，比表面積大，保證細胞充分的生長空間，細胞生長在載體內部，免受機械損傷。多孔載體被證明是用于大規模高密度細胞培養的優秀細胞生長支持物，具有逐步取代傳統的實心微載體的趨勢。（七）中空纖維細胞培養法(hollowfibercellculture)

模擬細胞在體內生長的三維狀態，利用人工的“毛細血管”——中空纖維來供給細胞生長的營養等條件細胞向三維空間生長繁殖，形成類似組織的多層細胞群體，細胞密度可達109個/ml。適用于細胞代謝產物和分泌物的生產。第五十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日五、細胞系與克隆株（celllineandclone）1、細胞系的建立

原代培養的培養物中所含的細胞類型多而復雜，培養初期，生長的細胞類型多種多樣隨培養時間延長：一些細胞退化、死亡；另一些細胞適應環境而生長繁殖培養物逐步變均勻。傳代培養意義：不僅在于維持細胞不斷地生長，而且使培養物逐步演變為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養細胞，即細胞系。細胞系：*指從原代培養物經傳代培養后得來的一群特征專一、類型均勻的細胞，可以長期連續傳代。第五十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）限定細胞系（有限細胞系） 壽命有限，一般為20~80代（2）連續培養細胞系（無限細胞系） 細胞發生轉化，可連續培養和生長，壽命變為“無限”2、克隆株（細胞株） 分離單一細胞并使其繁殖形成的細胞群稱為細胞株。單個細胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養措施適應和同化過程：在細胞接種到新培養液的初期，細胞既從培養液中攝取營養，也要向培養液排出一定物質，其結果使得培養液更易被吸收和利用。

第五十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日適應培養液

制備：選擇生長狀態良好的對數生長期細胞，無死細胞和碎片，所用細胞的種類應與要克隆的細胞相同。吸出培養液，用G6濾器過濾貯于冰箱中備用。 制備適應性培養基時注意：選用成分齊全的合成培養基，可不加抗生素。第六十頁，共六十九頁，2022年，8月28日細胞株的制備方法（3種）：（1）集落形成分離法平皿中接種稀釋細胞細胞貼壁繁殖成許多小群選擇一個最好的細胞群做標記機械法刮除所有其他細胞群培養保留下來的細胞群.第六十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日克隆成功的關鍵：①接種細胞數量要合適、細胞要分散得好。太多則使細胞操作不便，以每個平皿50~100個細胞為宜。②選擇細胞克隆時，應逐日觀察，能證明被選留的細胞群確系來自于單個細胞。刮除和洗滌一定要徹底。第六十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（2）瓊脂分離法（agarSeparation）瓊脂培養基的制備：

選擇質量好的瓊脂，用三蒸水配成3%的溶液，分裝，滅菌。培養方法：向瓊脂平皿中接種稀釋細胞懸液（適應培養基），培養后，標記出保留細胞，在顯微鏡下切下保留細胞處瓊脂小塊，在BSS中輕輕漂洗后，用適應培養基繼續培養。第六十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（3）多孔塑料板分離法（foamedplasticsSeparation） 將1ml含有7~8個細胞的懸液接種到多孔無毒塑料板中，每一塊板上有數十個圓形小穴。選擇僅有單個細胞的