第十章外源基因的表達生物科學與技術學院原核表達系統正確表達的基本條件常用的大腸桿菌表達載體的元件外援蛋白質表達部位提高外源基因表達效率的方法表達產物的檢測大腸桿菌表達外源基因的優勢和劣勢優勢：全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統成熟完善繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物劣勢：缺乏對真核生物蛋白質的復性功能缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質內含有種類繁多的內毒素正確表達的基本條件外源基因不能帶有間隔序列（內含子），不能用基因組DNA，要用cDNA或者合成的人工DNA。必須利用原核細胞的強啟動子和SD序列等調控元件控制外源基因的表達。外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放式閱讀框架。通過表達載體將外源基因導入宿主菌，并指導宿主菌的酶系統合成外源蛋白。利用宿主菌的調控系統，調節外源基因的表達，防止外源基因的表達產物對宿主菌的毒害。表達載體的組成啟動子轉錄終止子翻譯起始序列翻譯增強子啟動子啟動子(promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調控序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。原核生物的啟動子是由兩段彼此分開且高度保守的核苷酸序列組成。■-35區（TTGACA）：位于轉錄起始位點上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始識別和結合位點?！?10區（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶結合于此處導致DNA雙鏈形成單鏈。原核表達系統中通常使用的可調控的強啟動子有lac（乳糖啟動子）、trp（色氨酸啟動子）、PL及PR（λ噬菌體左向和右向啟動子）、tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子）等。啟動子-35區序列-10區序列PlacTTTACATATAATPtrp

TTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraA

TAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAATLac表達系統以大腸桿菌lac

操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統。轉錄調控機理具有多順反子結構，基因排列次序為：阻遏基因（lacI）-啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結構基因（lacZ-lacY-lacA）正調節因子CAP（活化蛋白）負調節因子

lac

I（阻遏蛋白）

lacI

Plac

lacO

lacZ

lacY

lacA高效轉錄cAMPCAP

lacI

Plac

lacO

lacZ

lacY

lacARNA聚合酶基底水平轉錄RNA聚合酶基因工程中使用的lac

啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代謝cAMP濃度降低cAMPCAPCAPlac

UV5突變體Plac

UV5突變體能夠在沒有CAP（活化蛋白）

存在的情形下非常有效的起始轉錄，受它控制的基因在轉錄水平上只受lacI

的調控，因此用它構建的表達載體在使用時比野生型Plac

更易操作。負調節因子lacI在無誘導物情形下，lacI

基因產物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。

lacI

Plac

lacO

lacZ

lacY

lacARNA聚合酶基底水平轉錄

lacI

Plac

lacO

lacZ

lacY

lacA高效轉錄RNA聚合酶IPTGmRNATac

表達系統tac

啟動子是由trp

的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的雜合啟動子。調控模式與lacUV5相似，但mRNA轉錄水平更高于trp

和lacUV5啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有較高基因表達水平的情況下，選用tac

啟動子比用lacUV5啟動子更優越。lac、tac

啟動子對宿主菌的要求在普通大腸桿菌中，LacI

阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上lac

操縱子轉錄調控的需要。當多拷貝的

lacO

隨著帶有lacUV5、tac

啟動子的表達質粒轉化進入大腸桿菌后，LacI

阻遏蛋白與lacO

的比例顯著下降，無法保證每一個lacO

都能獲得足夠的LacI

阻遏蛋白參與轉錄調控。表現為在無誘導物存在的情形下，lacUV5、tac

啟動子有較高的本底轉錄。為了使以Lac、Tac

表達系統具有嚴緊調控外源基因轉錄的能力，一種能產生過量的LacI

阻遏蛋白的lacI

基因的突變體lacIq

被應用于表達系統。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacIq

，常被選用為Lac、Tac表達系統的宿主菌。但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現嚴緊調控，在使用高拷貝復制子構建表達載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉錄。需在表達載體中插入lacIq

基因以保證有較多的LacI

阻遏蛋白產生。Trp

表達系統以大腸桿菌trp

操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統。轉錄調控機理色氨酸啟動子Ptrp

受色氨酸-阻遏蛋白復合物的阻遏，轉錄呈基底狀態。在培養系統中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細菌培養體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp

介導的目的基因表達。

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平轉錄高效轉錄mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效轉錄mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶T7表達系統大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統稱為T7表達系統。T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉錄。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。轉錄調控的機理T7噬菌體啟動子的轉錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉錄調控模式就決定了表達系統的調控方式?；瘜W誘導型溫度誘導型雙質粒系統T7RNA

聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因化學誘導型噬菌體DE3是

l噬菌體的衍生株，一段含有lacI、lacUV5

啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其

int

基因中用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調控方式為化學誘導型，類似于Lac表達系統。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli

（DE3）T7啟動子目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導溫度誘導型PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導方式激發T7噬菌體啟動子的轉錄。這種方式可以使本底轉錄降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質。

T7RNA聚合酶基因PL

啟動子E.Coli

（CE6）T7啟動子目的基因T7RNA

聚合酶熱誘導cI857雙質粒系統一個質粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質粒帶有T7啟動子和目的基因兩個質粒的復制子和抗性標記不能相同調控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調控類型T7RNA

聚合酶熱誘導T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

ci857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpRci857

阻遏蛋白

PL

啟動子T7RNA聚合酶T7啟動子目的基因PL

和PR

表達系統以l噬菌體早期轉錄啟動子PL和PR

為核心構建的表達系統，在野生型l噬菌體中，PL和PR

啟動子轉錄與否決定了l

噬菌體進入裂解循環還是溶源循環。轉錄調控的機理：由

l噬菌體PE

啟動子控制的cI

基因的產物是PL和PR啟動子轉錄的阻遏物。cI

基因的產物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于宿主與噬菌體之間的錯綜復雜的平衡關系。由于通過細胞因子來控制cI

基因產物的產生和消失是相當困難的。因此PL和PR

表達系統都選用溫度敏感突變體cI

857(ts)的基因產物來調控PL和PR

啟動子的轉錄。在較低溫度（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃）時失活脫落宿主菌中沒有cI

基因產物，PL、PR啟動子的高強度直接轉錄，帶有PL或

PR啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當不穩定。轉錄終止子外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發生轉錄過頭現象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續轉錄質粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉錄物的產生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉錄產物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質粒的不穩定性；過長的mRNA往往會產生大量無用的蛋白質，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產物的翻譯效率。強終止子的選擇與使用目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA

操縱子上的rrnT1T2

以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止作用。翻譯起始序列外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）。核糖體結合位點大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區5’端若干密碼子的堿基序列。SD序列的影響一般來說，mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16SrRNA

的堿基互補性，其中以GGAG

四個堿基序列尤為重要。對多數基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低。

SD序列與起始密碼子之間的序列的影響SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達水平低20倍SD序列與起始密碼子之間的距離的影響SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導致翻譯起始效率不同程度的降低。起始密碼子及其后續若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA

分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區形成莖環結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位。目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最佳的。生物體對密碼子的偏愛性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體φX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多細胞內tRNA

的含量基因突變基因突變是指由于DNA堿基對的置換、增添或缺乏而引起的基因結構的變化，從而引起表型的改變?；蛲蛔兊奶卣麟S機性：突變可發生在生物個體的任何時期和生物體的任何細胞多向性：同一基因座上的基因可獨立發生多次不同的突變而形成復等位基因可逆性：突變的方向可逆,可以是正突變，也可以是回復突變有害性：突變會導致許多疾病的發生稀有性：在自然狀態下發生突變的頻率很低

可重復性：對于任何一個基因位點，基因可以一定頻率反復發生點突變(pointmutation)

點突變：DNA鏈中一個或一對堿基發生的改變。兩種形式：堿基置換和移碼突變堿基置換（basesubstitution）：DNA鏈中一種堿基對被另一種堿基對所替代，從而使三聯體密碼意義發生改變而引起的突變。堿基置換分為：轉換和顛換AGTC轉換（嘌呤和嘌呤之間、嘧啶和嘧啶之間替換）顛換（嘌呤和嘧啶之間的替換）堿基置換可引起如下幾種生物學效應：

1、同義突變

2、錯義突變

3、無義突變

4、終止密碼突變同義突變（samesensemutation）：堿基被替換之后，產生了新的密碼子，但新舊密碼子同義，所編碼的氨基酸種類不變，因此同義突變并不產生突變效應。錯義突變（missensemutation）：堿基替換使編碼某種氨基酸的密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發生改變。錯義突變引發疾病——鐮刀狀紅細胞貧血無義突變（non-sensemutation）：堿基替換使編碼氨基酸的密碼變成終止密碼UAA、UAG或UGA。終止密碼突變（terminatorcodonmutation）:DNA分子中的某一個終止密碼突變為編碼氨基酸的密碼，從而使多肽鏈的合成至此仍繼續下去，直至下一個終止密碼為止，形成超長的異常多肽鏈。移碼突變（frame-shiftmutation）：基因組DNA鏈中插入或缺失1個或幾個堿基對，從而使自插入或缺失的那一點以下的三聯體密碼的組合發生改變，進而使其編碼的氨基酸種類和序列發生變化。堿基對插入和（或）缺失的數目和方式不同，對其后的密碼組合的改變的影響程度不同。移碼突變引起的最小變化是在DNA鏈上增加或減少一個遺傳密碼導致合成的多肽鏈多或少一個氨基酸，若大范圍改變密碼組合則會引起的整條多肽鏈的氨基酸種類及序列的變化。移碼突變的后果嚴重，通常是導致一條或幾條多肽鏈喪失活性或根本不能合成，進而嚴重影響細胞或機體的正常生命活動。

外源基因在大腸桿菌中的表達目標蛋白在大腸桿菌系統表達的形式有二種：表現為不溶性的包涵體顆粒：包涵體：在一定條件下，外源基因的表達產物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結構，這種結構稱為包涵體。存在部位：細胞質、細胞周質。表現為可溶性的蛋白質：可溶性的蛋白通常也叫融合蛋白，是將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達的蛋白稱為融合蛋白。融合蛋白可隨宿主菌的蛋白表達進入細胞質或者跟隨宿主菌的蛋白分泌到胞外。包涵體的組成蛋白質非蛋白質外源基因的表達產物：占大部分，具有正確的氨基酸序列，但空間構相錯誤，因而包涵體蛋白一般沒有生物學活性。受體細胞本身的表達產物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達載體編碼的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。大腸桿菌基因工程菌的蛋白表達策略包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷型表達包涵體型異源蛋白的表達包涵體形成的本質是細胞內蛋白質的不斷聚集。主要包括三個方面：①折疊狀態的蛋白質的聚集作用；②非折疊狀態的蛋白質的聚集作用；③蛋白質折疊中間體的作用。包涵體表達形式的優點和缺點優點：在一定程度上保持表達產物的結構穩定能夠避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產物的分離操作：包涵體的水難溶性及密度大于細胞碎片和細胞成分，經超聲波裂解后，直接通過高速離心可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來。能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。缺點：包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有生物活性的目標蛋白。經過復性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋。復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。包涵體的變性與復性操作包涵體的溶解與變性：包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清洗劑---SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復性和純化促溶劑---鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發形成的氰酸鹽污染，氰酸鹽能與多肽鏈中的氨基反應?；旌先軇?--尿素與醋酸、二甲基砜等聯合使用，溶解力增強極端pH---廉價，但許多蛋白質在極端pH條件下容易失活，并發生修飾反應。包涵體的復性與重折疊（refolding）：1、將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊2、通過次級鍵的形成使蛋白質復性復性操作的方法包括：1、稀釋復性：直接加入水或緩沖液，稀釋變性劑。稀釋法包括一次稀釋、分段稀釋和連續稀釋三種方式。2、透析復性：通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，不適合大規模操作，無法應用到生產規模。3、超濾復性：在生產中較多的使用，規模較大，易于對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。4、柱上復性：是最近研究較多并成功的在生產中應用的一種復性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復性，大致可分成疏水柱復性及凝膠柱復性兩類?！置谛彤愒吹鞍椎谋磉_分泌型異源蛋白在細胞內表現為可溶性的蛋白質。目標蛋白以可溶性蛋白質形式表達雖然可以避免包涵體復性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現為大腸桿菌本身存在于細胞質中的蛋白質往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質大部份被轉運到細胞的其他部位。這是因為大腸桿菌細胞質微環境的氧化還原態勢不利于蛋白質二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構象的目標蛋白在大腸桿菌的細胞質中往往不能正確折疊。蛋白產物N端信號肽序列的存在是蛋白質分泌的前提條件。蛋白質的分泌機制分泌型異源蛋白表達系統的構建大腸桿菌分泌性異源蛋白表達載體的構建策略通常是將大腸桿菌分泌型蛋白信號肽編碼序列拼接到外源基因的5’末端。將細菌素釋放蛋白基因克隆在一個合適的質粒上即可構建完全分泌型的受體細胞。此時，用另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質粒轉化上述完全分泌型受體細胞。分泌表達形式的優點：目的蛋白穩定性高重組人胰島素原若分泌到細胞周質中，其穩定性大約是在細胞質中的10倍。目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。如若將外源基因與大腸桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去。融合型異源蛋白的表達將外源基因與受體菌自身的蛋白質編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進行表達。由這種雜合基因表達出的蛋白質稱為融合蛋白。在融合蛋白結構中，通常受體細菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。人工設計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。外源基因蛋白受體細菌蛋白Cleavage用于融合蛋白構建的受體蛋白：谷胱甘肽轉移酶（GST）維持良好空間構象麥芽糖結合蛋白（MBP）促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構象外膜蛋白（OmpF）

促進分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構象目的蛋白的回收融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構象和生物活性，如果將之注入人體還會導致免疫反應，因此在制備和生產藥用目的蛋白時，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種：化學斷裂法和酶促裂解法。（1）化學斷裂法：溴化氰（CNBr），蛋白位點專一性化學斷裂試劑，它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側鏈的硫醚基反應，生成溴化亞氨內酯而降解?；瘜W斷裂法的優點是回收率高（可達到85%以上），專一性強，而且所產生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中的成熟表達產物較為接近。（2）酶促裂解法：蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高，同時每種蛋白酶均具有相應的斷裂位點決定簇。蛋白內切酶切割位點梭菌蛋白酶

Arg-C葡萄球菌蛋白酶

Glu-C假單孢菌蛋白酶

Lys-C豬胰蛋白酶

Arg-CArgCNNC受體蛋白目的蛋白梭菌蛋白酶ArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達親和層析酶解回收啟動子受體基因接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-Arg融合形式表達目的蛋白的優點：目的蛋白穩定性高目的蛋白易于分離利用受體菌蛋白特異的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達率高目的蛋白溶解性好目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。在實際生產中，產品主要的成本往往就在該工段。融合蛋白表達質粒載體的構建原則：受體細胞的結構基因能高效表達，且其表達產物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。外源基因應裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架。常用的表達載體具有一個強的tac（trp-lac）啟動子，這個啟動子是由trp啟動子的-35區、lacUV5啟動子的-10區、操縱基因及S-D序列組成。緊接著tac啟動子的是一個取自pUC8的多位點接頭，使之很容易把目的基因定位在啟動子和S-D序列之后。在多位點下游的一段DNA序列中，還包含一個很強的rrnB核糖體RNA的轉錄終止子。載體的其余部分由pBR322組成。（1）非融合型表達蛋白載體pKK223-3這個載體系統是由pBR322為基礎構建的。帶有大腸桿菌最強的啟動子之一，即Ipp（脂蛋白基因）啟動子。在啟動子的下游裝有lacUV5的啟動子及其操縱基因，并把lac阻遏子的基因（lacI）也克隆到這個質粒上。這樣目的基因的表達就成為可調節的了。在轉錄控制的下游再裝上人工合成的高效翻譯起始序列（S-D序列及ATG）。信號肽序列取自于大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。在編碼序列的下游緊接著一段人工合成的多克隆位點片斷，包括三個單一酶切位點，EcoRI、HindIII、BamHI。（2）分泌型克隆表達載體pINIII系統P191圖10-7載體的組成成分基本上與其它表達載體相似，含有啟動子tac及lac操縱基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。這類載體與其它表達載體不同之處在于S-D序列下游是谷胱甘肽巰基轉移酶基因，而克隆的外源基因則與谷胱甘肽巰基轉移酶基因相連。當進行基因表達時，表達產物為谷胱甘肽巰基轉移酶和目的基因產物的融合蛋白。（3）融合蛋白表達載體pGEX系統外源基因在大腸桿菌中的表達部位

（1）不同表達部位克隆在大腸桿菌中的外源基因，它們的編碼產物蛋白質，有的是在細胞質中表達，有的是在細胞周質中表達，還有的則是以分泌到細胞外的方式表達。■細胞質中表達：大腸桿菌細胞質中表達的外源蛋白，大多是以包含體的形式存在的。包含體是存在于細胞質中的一種由不溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構?！鲋苜|中表達：周質是指在大腸桿菌一類格蘭氏陰性細菌中，位于內膜和外膜之間的細胞結構部分。周質中表達的蛋白需要在信號肽的引導下才能穿越內膜，進入細胞周質?！黾毎獗磉_：表達的外源蛋白分泌到胞外培養基中，同樣需要信號肽序列的引導。（2）不同部位表達外源蛋白的優缺點表達部位優點缺點細胞質1、形成包涵體（a）蛋白質易于以高純度和高濃度的方式分離（b）蛋白質受保護而免受胞內酶的降解作用（c）蛋白質沒有活性，因此不會使寄主細胞受傷害2、蛋白質產量高3、表達的質粒載體構建比較簡單1、形成包涵體（a）蛋白質折疊了，再折疊的蛋白質可能無法恢復其生物學活性（b）蛋白質的終產量偏低（c）蛋白質生產成本比較昂貴2、還原的環境不利于二硫鍵的形成3、由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白質的真實性受到影響4、蛋白質會被降解5、蛋白質種類多，因此純化比較復雜周質1、由于周質中蛋白種類比較少，因此目標蛋白質的純化就比較簡單2、蛋白質降解的程度不甚嚴重3、促進了二硫鍵的形成及蛋白質的折疊作用4、蛋白質的N-末端結構真實1、信號肽并非總是有助于蛋白質的轉運2、有可能形成包涵體胞外1、蛋白質的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白質種類少，因此目標蛋白質容易純化3、增進了蛋白質的折疊作用4、蛋白質的N-末端結構真實1、在大腸桿菌中表達的外源真核蛋白質，通常是不會分泌到胞外培養基中去的2、由于分泌在胞外培養基中的蛋白質相當稀釋，因此目標蛋白質的純化過程比較復雜（1）啟動子結構對表達效率的影響原核生物啟動子有兩種保守序列，即-35區的TTGACA序列和-10區的TATAAT序列。研究發現，啟動子的強度與一致序列的相似程度成正比。進一步的研究表明，-35和-10區的距離也是一個重要因素。如果間隔為17個堿基對，啟動子表現很強，如果大于17個堿基對，啟動子表現較弱。根據這些原理，Amann等克隆了tac啟動子（lac