..項目名稱：重要病毒跨種間感染與傳播致病的分子機制研究首席科學家：高福中國科學院微生物研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部門：中國科學院二、預期目標總體目標本項目根據國家新發人類傳染病防治上的戰略需求,聚焦國際上病毒病研究的前沿,立足于我國重要病毒性傳染病發生與流行的現狀,選擇新型冠狀病毒、乙腦病毒、登革病毒、狂犬病毒和流感病毒等對我國具有嚴重危害或潛在危害的代表性病毒為主要研究對象,運用病毒學、分子生物學、細胞生物學和結構生物學等現代生命科學技術手段,揭示重要病毒尤其是新型病毒在動物宿主中的生態分布特征；解析病毒基因變異和進化規律,闡明病毒跨種間感染與致病的分子基礎,在病毒跨種間傳播研究基礎理論方面有突破,進一步推動我國在該領域的研究達到國際先進水平,為我國新發傳染病的防治提供科學支撐。通過該項目的實施,將不僅培養一批在病毒學研究領域國際創新型拔尖人才和學術骨干,形成具有國際競爭力的團隊,而且將建立分子病毒學、分子免疫學和病毒生態學研究等科研基地,為我國新發人傳染病的預防與控制水平的持續提升奠定穩固的科學基礎。五年預期目標１．建立自然貯存宿主重要病毒病原生態學研究平臺從野生動物中分離新型冠狀病毒、尼帕或類似副粘病毒、漢坦病毒、流感病毒；弄清楚SARS病毒直接動物溯源和生態傳播鏈；闡明我國境內蝙蝠體內感染和攜帶的幾種已知人類重要病毒的種類、分布和病毒在蝙蝠等重要貯存動物貯存和傳播的分子機理,揭示乙腦病毒在不同動物宿主之間的傳播機制與傳播關系；明確高致病性禽流感病毒主要疫源地〔XX湖流域、洞庭湖生態的分布、儲存方式、生存及消長規律,以及流感病毒在家禽和哺乳動物的生態分布,建立自然宿主動物病毒資源庫。２．闡明重要病毒分子變異和進化的規律以及生物學特性通過對新型冠狀病毒、乙腦病毒、尼帕或類似副粘病毒、流感病毒等進行病毒的全基因組序列測定,揭示功能基因組的遺傳變異特征；通過基因組信息學特征分析,揭示病毒基因組進化規律。確定登革病毒在蚊子細胞中復制所必須的5’UTR和3’UTR順勢作用元件,鑒定出在登革病毒復制過程中起重要作用的種屬特異順勢作用元件和細胞因子。闡明重要病毒尤其是新型病毒的生物學特性,包括病毒的致病性、傳播性和感染性,揭示病毒基因變異對病毒致病性與傳播性的影響等,奠定病毒種間傳播研究的分子基礎。3、揭示跨種間傳播中病毒配體與受體的作用機制用現代分子生物學技術和反向遺傳操作技術構建系列假病毒及嵌合病毒,結合蛋白質生物大分子相互作用研究,闡明病毒配體與不同物種宿主細胞受體的相互作用機制,病毒侵入宿主細胞過程的囊膜蛋白－受體結合與融合機制；揭示部分新型冠狀病毒的受體類型及性質,奠定型冠狀病毒跨物種感染研究的基礎；通過體外真核表達病毒識別宿主細胞受體蛋白,弄清基因重要結構位點的改變,對其受體結合功能和侵入細胞功能的影響,以及與病毒高致病力的關系；應用細胞轉染等現代技術,在不操作活病毒的基礎上,找尋黃病毒受體。4、解析重要病毒在不同宿主細胞中的復制機制利用現代生命組學等技術解析新型冠狀病毒、乙型腦炎病毒等基因組復制、轉錄、表達以及組裝的機理,弄清病毒蛋白在不同宿主細胞復制過程中的作用基礎；解析病毒在不同宿主細胞復制過程中病毒及宿主細胞MicroRNA表達譜改變,以及MicroRNA表達譜對不同病毒復制轉錄的影響與結構基礎,探討病毒感染的種屬與組織嗜性及復制的共性與特性；鑒定出和登革熱病毒的蚊子細胞蛋白因子,確定它們在病毒RNA復制過程中的作用。解析流感病毒聚合酶基因突變、插入、缺失等對病毒復制和致病性的影響。５、揭示宿主限制性因子在病毒跨種間傳播中的作用機制篩選鑒定出與流感病毒、漢坦病毒、狂犬病毒和逆轉錄病毒蛋白互作的宿主細胞限制性因子；通過研究不同種屬的宿主限制性因子對病毒感染性的影響,闡明宿主限制性因子在病毒感染、致病及跨種屬感染中的分子機制。并通過研究病毒蛋白與宿主細胞內蛋白的相互作用,篩選與病毒相關蛋白發生相互作用的細胞內靶蛋白,探討相關新蛋白與靶蛋白之間的相互作用對病毒機能的影響,并為將來研制小分子藥物奠定理論基礎。6、建立新型病毒感染動物模型建立不同生理和免疫狀態下流感病毒或新型冠狀病毒等病毒感染動物模型,揭示實驗動物病毒感染、復制、傳播能力、機體免疫應答水平變化、機體病變和進程等,結合感染前生理和免疫狀態的本底情況,揭示免疫應答水平的不同與病毒致病能力的關系,解析不同免疫狀態導致病毒不同致病能力的分子作用機制。建立人MHC轉基因小鼠感染模型；揭示CD8+T和CD4+T淋巴細胞比例及分布規律、細胞因子釋放情況等免疫反應變化規律,闡明MHC限制性在病毒跨種間傳播中的作用；建立新型病毒體內分布實時監測小鼠模型。7、人才培養與基地建設培養一批在病毒學研究領域國際創新型拔尖人才和學術骨干,形成具有國際競爭力的團隊,造就一支跨學科、跨領域、精誠合作、團結奮進的科研隊伍,而且將建立分子病毒學、分子免疫學和病毒生態學研究等科研基地,在新型病毒生態學、病毒生理與病理學、病毒結構學、病毒基因組學等研究領域取得重大突破,發表百篇以上具有國際前沿水平的科研論文,為我國重要傳染病的防治提供理論和科學支撐。三、研究方案學術思路:本項目立足于我國重要病毒傳染病產生與跨種間傳播的現狀與國家在傳染病防控方面的重大需求,綜合現代病毒生態學、分子病毒學、分子生物學、生物信息學、細胞生物學和生物化學等,以解析病毒跨種間傳播機理為目標,以新型冠狀病毒、黃病毒、狂犬病毒、流感病毒等為重點研究對象,利用學科交叉,發揮多學科優勢,從病毒的生態分布、遺傳變異與進化、病毒與宿主細胞相互作用等層面揭示重要病毒跨種間傳播與致病的分子機制〔見圖1。通過本項目實施,造就一支在病毒跨種間傳播研究領域具有國際競爭力的優秀團隊,在新發傳染病發生機制研究方面取得重大突破,為國家應對突發公共衛生事件、構筑公共安全體系、保障人民健康提供理論依據和技術支撐。技術路線：詳見流程圖〔圖1。本研究將系統地研究新型冠狀病毒、乙腦病毒、狂犬病毒、流感病毒等重要病毒的生態分布、變異進化規律、病毒與受體的識別、病毒在細胞內的復制機制、宿主限制性因子對病毒復制的影響等,圍繞病毒跨種間感染傳播與致病的分子機制開展研究工作。四、年度計劃研究內容預期目標第一年在全國各地大量采集蝙蝠、嚙齒類動物、食蟲目動物的血清、咽拭子和肛拭子樣品；采集不同地區,不同動物,包括野生動物、動物園動物和特種養殖經濟動物、以及包括雞、豬和犬等家畜和家禽的棉拭子、組織和血液樣品.進行流感病毒、新型冠狀病毒、乙腦病毒等的分離和病毒流行病學調查研究,研究病毒的宿主特征,對分離鑒定的病毒進行全基因組測定與分析；觀察新型病毒的生物學特征,重點是對動物的致病性和傳播性流感病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；利用原核或真核細胞表達乙型腦炎病毒、登革病毒、流感病毒囊膜蛋白；利用分子篩層析、離子交換等技術分離純化蛋白；病毒囊膜蛋白的晶體篩選；建立自噬途徑研究細胞模型。冠狀病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；登革病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；病毒在不同組織中復制的miRNA表達譜對病毒復制的調控及分子機制；以成熟的病毒蛋白與宿主因子互作平臺為基礎,尋找流感病毒的宿主限制性因子;篩選與漢坦病毒主蛋白〔核蛋白為主相互作用的宿主細胞因子;通過蛋白質互作手段,找出種間毒株差異的宿主相關蛋白,并獲得不同毒力狂犬病毒株感染的潛伏期早期和感染中、晚期免疫相關細胞和中樞神經組織材料。人MHC轉基因小鼠構建；高致病性禽流感病毒、西尼羅病毒等新型病毒嗜神經生物學特征鑒定采集蝙蝠樣本500份；家畜樣本500份；獲得流感病毒、新型冠狀病毒、乙腦病毒等的分離毒株和序列；獲得分離毒株的致病性和傳播性特點。獲得不同基因型的乙型腦炎病毒、登革病毒、流感病毒囊膜蛋白；獲得部分囊膜蛋白的晶體結構。對病毒目的基因進行定點突變,觀察病毒突變株和野生株對不同宿主細胞及不同組織來源細胞中復制能力的差別,尋找決定病毒在不同種屬宿主細胞中復制的關鍵位點。篩選出5-10種分別與流感病毒、漢坦病毒及狂犬病病毒蛋白相互作用的宿主細胞因子。獲得人HLA-A2/DR1和HLA-A11/DR1轉基因小鼠。完成5-10株高致病性禽流感病毒、狂犬病毒等新型病毒的生物學特征鑒定,獲得至少4株具有不同神經嗜性新型病毒。發表研究論文10篇以上第二年檢測新型冠狀病毒、新型漢坦病毒、新型副粘病毒新型感病毒在動物中的感染情況；對病毒檢測為陽性樣品進行病毒培養和分離；分析新檢測的病毒序列與已知人類同類病毒的差異和進化關系。繼續進行病毒的分離和調查；研究病毒在經過不同宿主傳播后病毒生物學特性的改變特征和規律；對分離鑒定的病毒進行全基因組測定,利用基因組信息學分析技術,研究病毒的遺傳變異和分子進化規律和特征,并建立病毒的反向遺傳操作技術系統。分離病毒易感細胞膜蛋白,利用GSTpull-down的方式篩選候選受體；質譜鑒定候選受體；研究不同流感病毒HA蛋白與受體的作用特征；在細胞模型上研究自噬影響流感病毒侵入的分子機制。流感病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；冠狀病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；登革病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；病毒在不同組織中復制的miRNA表達譜對病毒復制的調控及分子機制；運用蛋白-蛋白互作以及病毒學方法探索宿主限制性因子在流感病毒復制過程中的調控機制;追蹤宿主限制性因子與病毒核蛋白相互作用后對病毒復制、裝配及成熟釋放的影響和生物學意義;通過色譜質譜技術對外周免疫相關細胞和中樞神經組織進行蛋白質組學分析,發現狂犬病病毒感染前后宿主在蛋白質組水平表現出的差異點；建立病毒體內分布實時監測動物模型,對高致病性禽流感病毒等病毒的感染動力學進行初步探討。獲得10株以上病毒的部分基因組序列；確定新型病毒與人類病毒在在血清學和基因序列上的差異。獲得流感病毒、新型冠狀病毒、乙腦病毒等的分離毒株和全基因組序列；獲得流行毒株的遺傳變異規律和生物學特性；建立病毒的反向遺傳操作系統1套。獲得乙腦病毒、登革病毒細胞候選受體；獲得一些影響流感病毒HA蛋白與唾液酸受體的重要蛋白殘基；初步了解流感病毒如何影響細胞自噬的信號通路。獲得目的重組病毒；建立人冠狀病毒庫；揭示不同突變對病毒RNA翻譯和復制的影響；獲得宿主細胞miRNA與病毒miRNA表達譜。篩選出2-6種分別與流感病毒和漢坦病毒相互作用的宿主限制性因子；闡明部分宿主限制性因子對流感病毒和漢坦病毒復制的影響及其作用機制；獲得狂犬病病毒感染前后宿主在蛋白質水平的差異點明確高致病性禽流感病毒對在HLA-A2/DR1、HLA-A11/DR1轉基因小鼠體內感染特性,初步揭示MHC限制性在高致病性禽流感病毒跨物種感染過程中的作用；完成新型病毒的基因組測序,利用生物信息學方法并發現嗜神經性相關毒力位點,通過反向遺傳學手段進行驗證。發表研究論文20篇以上第三年對檢測為陽病毒性的進行病毒分離培養；開展新分類病毒的細胞和動物敏感性實驗,評價病毒的宿主范圍和對實驗動物的致病能力;繼續進行病毒分子流行病學的調查與研究,分析病毒的進化和變異規律；利用構建的反向遺傳操作技術平臺,研究病毒基因點變異、基因突變、基因重配等對病毒致病性和傳播性的影響,重點探討影響病毒傳播特性尤其是跨種間傳播特性的關鍵因子或因素。在細胞模型上對篩選的乙腦病毒、登革病毒候選受體進行進一步的驗證；流感病毒突變體的表達純化、與唾液酸受體復合體的晶體結構；在細胞模型上研究自噬影響流感病毒侵入的分子機制。流感病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；冠狀病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；登革病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；病毒在不同組織中復制的miRNA表達譜對病毒復制的調控及分子機制；繼續探索宿主限制性因子在流感病毒及漢坦病毒復制過程中的調控機制；探索弱毒誘導的早期抗感染因子〔宿主限制性因子的本質和強毒誘導的早期致病因子對宿主限制性因子的影響；病毒體內分布實時監測動物模型構建；新型病毒嗜神經性相關毒力位點的功能研究。獲得3-5株新分離病毒的全基因組序列；揭示野生動物或家畜冠狀病毒的遺傳變異情況。建立病毒的毒株庫和基因庫；確定影響病毒致病性和傳播性的關鍵基因位點。獲得1-2個乙腦病毒、登革病毒受體或輔助受體；從分子結構水平揭示流感病毒HA蛋白與唾液酸受體相互作用影響流感病毒跨種間傳播的機制；闡明流感病毒表達蛋白如何影響細胞自噬水平。揭示病毒在不同宿主上生長能力的動態變化；獲得人冠狀病毒感染性克??；獲得四種病毒RNA上的細胞蛋白因子。深入闡明宿主限制性因子在流感病毒及漢坦病毒復制過程中的調控機制；篩選出1-2個與狂犬病病毒相互作用的宿主限制性因子。通過轉基因技術獲得流感病毒體內分布實時監測動物模型；通過細胞學和動物學實驗,初步闡明新型病毒嗜神經性相關毒力位點的作用機制發表研究論文20篇以上第四年研究新型病毒的受體及其跨種物種感染的分子機理研究；分析我國漢坦腎出血熱疾病主要疫區疾病流行情況與病毒遺傳變異的關系；檢測犬流感病毒的流行情況。持續進行病毒的分離,密切關注動物臨床和人醫臨床新型病毒的出現和新型病毒的基因組特征；并利用構建的反向遺傳操作技術平臺,研究病毒基因非編碼區的作用和功能,探討病毒基因非編碼區核苷酸的改變對病毒致病性和傳播性重點是跨種間傳播特性的影響。根據前三年研究結果,如果未按原計劃獲得病毒的受體或輔助受體,將采用其他方法進一步篩選；對已篩選到的受體進行體外表達,研究病毒囊膜蛋白與受體的相互作用。流感病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；冠狀病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；登革病毒在不同宿主中的復制及跨種屬傳播機制；病毒在不同組織中復制的miRNA表達譜對病毒復制的調控及分子機制。比較不同種屬的宿主限制性因子對流感病毒感染、致病影響的差異；比較導致HFRS和HPS、重型和輕型HFRS的來源于不同宿主的不同型別的漢坦病毒分別與不同類型宿主細胞的相互作用異同,探討不同種屬宿主細胞限制性因子對病毒感染及致病的分子基礎和調控機制；進一步解析狂犬病病毒結構蛋白中哪種成分在影響宿主限制性因子方面發揮主要作用。新型病毒體內感染動力學研究；新型病毒嗜神經性相關宿主蛋白/MicroRNA的篩選與鑒定。揭示蝙蝠、嚙齒類動物、食蟲目動物在病毒跨種群傳播的關鍵基因序列；初步弄清楚我國犬流感病毒的可能的來源。豐富病毒毒株庫和基因庫；闡明新型病毒的基因和生物學特點；確定病毒非編碼區的功能位點。獲得重組表達的受體蛋白；闡明病毒囊膜蛋白與受體直接的相互作用能力。揭示病毒在體內不同部位的復制能力的差別；揭示病毒突變株和野生株對不同種屬細胞感染,復制能力的差別；分析影響病毒在宿主中復制能力的結構基礎。闡明不同種屬宿主細胞限制性因子對流感病毒和漢坦病毒感染及致病的分子基礎和調控機制；確定狂犬病病毒結構蛋白中哪種成分在影響宿主限制性因子方面發揮主要作用完成高致病性禽流感病毒在小鼠體內的感染動力學研究,揭示高致病性禽流感病毒在哺乳動物體內的組織嗜性和感染過程；通過蛋白質組學、生物芯片等技術發現與新型病毒嗜神經性相關的宿主蛋白/MicroRNA發表研究論文25篇。第五年新型病毒體內感染動力學研究；新型病毒嗜神經性相關宿主蛋白/MicroRNA的篩選與鑒定。持續進行病毒的分離和病毒基因組信息學研究和病毒生物學特性研究；綜合分析課題組幾年的研究結果,分析病毒基因組的變異在病毒跨種間傳播中的作用；篩選病毒囊膜蛋白與受體復合體的晶體結構；新型病毒嗜神經性相關宿主蛋白/MicroRNA的功能研究對前4年的研究成果進行進一步的補充和完善,進行項目的總結驗收。闡明動物攜帶的新型冠狀病毒、漢坦病毒、流感病毒等與人類疾病的關系。完善病毒毒株庫和基因庫；總結病毒流行規律和影響生物學特性的功能位點。獲得病毒囊膜蛋白與受體復合體的晶體結構,闡明病毒與受體的相互作用機制,揭示病毒跨種間傳播機制。闡明宿主限制性因子在流感病毒感染、致病及跨種屬感染中的作用及分子機制；闡明漢坦病毒感染后大量包涵體形成的分子機制及免疫病理意義；闡明機體中樞神經系統對狂犬病病毒的固有免疫機制和狂犬病病毒對中樞神經系統的致病機制發表論文25篇以上。完成項目驗收。一、研究內容1、重要病毒在自然宿主中的生態分布在前期對我國不同地域、不同時間、不同宿主動物病毒如新型冠狀病毒、乙腦病毒和漢坦病毒研究的調查研究基礎上,進一步擴大地域與宿主調查,確定我國境內蝙蝠體內感染和攜帶的幾種已知人類重要病毒的種類、分布和病毒在蝙蝠等重要貯存動物貯存和傳播的分子機理,研究乙腦病毒在不同動物宿主之間的傳播機制與傳播關系；研究生態環境因素對病毒感染宿主范圍的影響；評價新型病毒對人與動物的潛在危害；調查流感病毒在野禽、家禽和哺乳動物的生態分布,研究侯鳥遷徙與疫病流行的關系,為疫病防控政策的制定提供理論依據；建立病毒在自然宿主的生態分布數據庫,奠定重要病毒跨種間傳播研究與分析的物質基礎。２．重要病毒分子變異、進化規律及其生物學特性在對重要病毒進行生態學和流行病學調查研究的基礎上,以新型冠狀病毒、乙腦病毒、狂犬病毒、流感病毒等重要病毒為研究對象,進行病毒的全基因組序列測定研究,研究功能基因組的變異和進化特征；同時研究重要病毒尤其是新型病毒的生物學特性,包括病毒的致病性、傳播性和感染性,研究病毒基因變異對病毒種間傳播作用的影響等。由于近年來的研究發現病毒非結構蛋白和病毒非編碼區在致病性和傳播性也起到非常重要的作用,因而在全基因組序列研究中,要注重研究病毒非編碼區變異和進化特征,觀察病毒非編碼區變異對病毒生物學特性的影響。3、病毒跨種間傳播中病毒與受體的相互作用以乙型腦炎、流感病毒等為突破口,研究病毒與受體的親和特性以及細胞受體和配體的相互作用機制；用現代分子生物學技術和反向遺傳操作技術構建系列假病毒及嵌合病毒。結合蛋白質生物大分子相互作用研究,研究病毒與不同物種宿主細胞的相互作用；同時利用昆蟲細胞表達病毒表面蛋白及各種突變體蛋白,從結構層面研究受體與配體的作用,以此為基礎,用物理方法〔SPR和生物學檢測手段研究病毒表面蛋白的突變對受體結合能力的影響。并利用反向遺傳學