PCR抑制劑和增強劑PCR抑制劑和增強劑PCR抑制劑SDS苯酚乙醇異丙醇乙酸鈉氯化鈉EDTA血紅素（heme）hemin（氯高鐵血紅素）tannicacids（丹寧酸）肝素尿素二甲苯胺溴酚蘭腐殖質植物多糖聚苯乙烯、聚丙烯鐵離子bilirubin（膽紅素）膽酸鹽PCR抑制劑SDS肝素抑制劑來源抑制劑來源膽酸鹽糞便復雜多糖糞便，植物材料膠原質組織血紅素（heme）血液腐植酸土壤，植物材料，自然界水黑色素頭發，皮膚尿素尿血色素hemoglobin血液靛青染料粗斜紋棉布聚苯乙烯，聚丙烯紫外線照射塑料管蛋白酶牛奶鈣離子牛奶，骨頭抑制劑來源抑制劑來源膽酸鹽糞便復雜多糖糞便，植物材料膠原質組抑制劑的作用濃度SDS離子去污劑，蛋白變性，0.01%即可完全抑制PCR反應，0.005%可顯著降低產量苯酚蛋白變性，0.5%即可完全抑制PCR反應，0.2%可顯著降低產量乙醇大于1%的濃度可抑制PCR反應，但在某些系統中可增加產量。異丙醇抑制作用比乙醇稍強乙酸鈉大于5mM時抑制PCR反應氯化鈉大于25mM時抑制PCR反應EDTA0.5mM可使PCR產物減少，1mM完全沒有PCR產物。血色素1mg/ml肝素0.15I.U./ml尿素20mM（相當于10μlPCR體系中含0.6μl尿液）氯高鐵血紅素0.1ng/μl丹寧酸0.1ng/μl抑制劑的作用濃度SDS離子去污劑，蛋白變性，0.01%即可例1：操作時溫度不同產生的抑制劑Shames等人（1995）使用PVP（polyvinylpyrollidone）在4℃分離糞便中的細菌DNA，然后用Chelex100處理。盡管用PVP在室溫也可以分離DNA，但得到的DNA用于PCR擴增效果不夠好，也許因為在更高的溫度釋放出了更多的PCR抑制劑。例1：操作時溫度不同產生的抑制劑Shames等人（1995）例2：間接產生的抑制劑YoshiiT等人1992年，用單根頭發提取DNA擴增線粒體DNA一段333bp的非編碼區。所有實驗均截取5cm長的毛干后研究表明染色劑中的過氧化氫可以使不溶于水的黑色素變成水溶性的。頭發種類截取毛干區域擴增成功率自然黑發離根部11cm內100%離根部11cm外部分成功離根部16cm外幾乎不成功白頭發離根部31cm外可成功染成深咖啡色的黑頭發完全失敗染成深咖啡色的白頭發可成功擴增例2：間接產生的抑制劑YoshiiT等人1992年，用單根PCR增強劑

PCR增強劑可以增加所需PCR產物的產量或減少非特異性產物。有許多的PCR增強劑，原理各不相同，這些試劑不可能對所有的PCR反應都起作用。根據其作用和原理，可以大致分為三類：1.用于擴增高GC含量或形成復雜二級結構的模板（共溶劑）2.用于保護DNA聚合酶的活性和穩定性3.用于優化引物和模板的結合PCR增強劑PCR增強劑可以增加所需PCR產物的產量或減少1.用于擴增高GC含量或形成復雜二級結構的模板的增強劑甜菜堿（betaine），二甲基亞砜（DMSO）和甲酰胺（formamide），甘油，適合于擴增高GC含量和形成復雜二級結構的模板。甜菜堿1M、DMSO1-10％（5%？）、甲酰胺1-5％、甘油1％-10％對某些反應可以顯著提高產量，但過量的這些試劑會抑制PCR反應。1.用于擴增高GC含量或形成復雜二級結構的模板的增強劑甜菜堿在高濃度時，許多添加劑和共溶劑都可以抑制PCR，對不同濃度的引物和模板DNA的組合都應該通過經驗來確定其最適濃度。根據我們的觀點，當PCR出現問題時首先考慮的不應該是使用這些增強劑，而應該是對反應體系的控制成分進行優化，尤其是鎂離子和鉀離子的濃度。這個普遍規律的一個例外是GC-Melt（Clontech公司）的應用，我們發現它常常能夠克服和解決對富含G+C的模板進行擴增時效率低下的問題。

《分子克隆實驗指南》Frackmanetal.(1998)havedemonstrated(usingNMRanalysis)thatthePCRadditiveprovidedbyQIAGENintheirPCRcorekit(Q-Solution)andthatprovidedbyCLONTECHintheAdvantage-GCcDNAPCRkitisinfactBetainewhichisavailableatafractionofthecostasa5MsolutionfromSigma-Aldrich(cat.#B0300)

在高濃度時，許多添加劑和共溶劑都可以抑制PCR，對不同濃度的2.用于保護聚合酶的活性和穩定性的增強劑有的反應中，0.1mg/ml的BSA、0.1-10％的明膠（gelatin）或非離子型的去污劑，可以解決一些擴增失敗的問題，這類試劑可以增加聚合酶的穩定性，減少試劑在管壁上的吸附。BSA可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用.非離子去污劑，例如Tween?-20,NP-40和Triton?X-100等，可以抵抗痕量的強離子去污劑的抑制作用，比如0.01%的SDS。2.用于保護聚合酶的活性和穩定性的增強劑有的反應中，0.1m3.用于優化引物和模板的結合

銨離子的添加，可以減少引物和模板的錯配，提高反應的特異性，可以讓PCR對反應條件的要求更低，所以很多PCR試劑都包含了10-20mM的硫酸銨。氯化四甲胺tetramethylammoniumchloride（TMAC）（15-100mM）也起到類似的作用3.用于優化引物和模板的結合

銨離子的添加，可以減少引物和模4.其它增強劑PEG亞精胺單鏈DNA結合蛋白4.其它增強劑PEG例：ReliefofAmplificationInhibitioninPCRwithBovineSerumAlbuminorT4Gene32Protein已知抑制劑：EDTA,SDS,TritonX-100，hemin（氯高鐵血紅素），bilirubin（膽紅素），sodiumglycocholate(甘膽酸鈉)，sodiumcholateplusdeoxycholate（脫氧膽酸鈉），sodiumtaurocholate,（牛黃膽酸鈉），tannicacids（丹寧酸），humicacid(腐植酸)，氯化鐵，氯化鈉，采自泥炭和Suwannee河的腐植酸和fulvicacid(棕黃酸)例：ReliefofAmplificationInhiPCR反應：擴增Bacteroidesdistasonis基因組消除腐植酸抑制作用的最優BSA濃度是200-400ng/μl，最優gp32濃度是100-150ng/μl因此，所有已知的抑制劑在檢測時，都同時做了不含BSA和gp32的檢測和含有400ng/μlBSA或150ng/μlgp32的檢測。抑制水平的定義：通過瓊脂糖電泳觀察，能夠可重復性的降低PCR產量的最低抑制劑濃度。PCR抑制劑和增強劑課件不添加任何增強劑不添加任何增強劑PCR體系中加入400ng/μlBSAPCR體系中加入400ng/μlBSAPCR體系中加入150ng/μlgp32PCR體系中加入150ng/μlgp32加和不加增強劑的比較加和不加增強劑的比較結果1抑制劑不加增強劑時的抑制水平加入增強劑后的抑制水平增強劑效果EDTA1mM1mM無效FeCl31mM10μM100倍bilirubin（膽紅素）

>10μg/μl<100μg/μl<10倍，不明顯Humicacid，Hemin，tannicacid0.1ng/μl10ng/μl100倍fulvicacid1ng/μl100ng/μl100倍結果1抑制劑不加增強劑時的抑制水平加入增強劑后的抑制水平增強結果21.BSA和gp32都不能減少最小濃度的下列抑制劑的抑制作用：0.1M氯化鈉，0.1MSDS，10%TritonX-100，1-10μg/μl任何一種膽酸鹽，EDTA。2.hemin的抑制作用可以被BSA或gp32明顯減輕（1000倍），但其降解產物bilirubin卻不能（小于10倍）。3.氯化鐵在含BSA或gp32時，抑制水平降低100倍（1mMVS0.01mM），在氯化鐵濃度大于1mM時，因為形成難溶的氫氧化物，釋放氫離子，PCR反應體系的pH隨著氯化鐵濃度的增大迅速降低。沒有其它抑制劑影響pH值，即使是在很高的濃度。結果21.BSA和gp32都不能減少最小濃度的下列抑制劑的4.從雞、奶牛，豬，馬，綿羊糞便中提取的細菌片段，從Ohio河、大西洋、Delaware灣、一片沼澤地、一條淡水河、一條運河的過濾物中的提取物都能抑制PCR，但加入BSA或gp32后，PCR體系的容納能力都可以提高10-1000倍。PCR抑制劑和增強劑課件

謝謝PCR抑制劑和增強劑課件PCR抑制劑和增強劑PCR抑制劑和增強劑PCR抑制劑SDS苯酚乙醇異丙醇乙酸鈉氯化鈉EDTA血紅素（heme）hemin（氯高鐵血紅素）tannicacids（丹寧酸）肝素尿素二甲苯胺溴酚蘭腐殖質植物多糖聚苯乙烯、聚丙烯鐵離子bilirubin（膽紅素）膽酸鹽PCR抑制劑SDS肝素抑制劑來源抑制劑來源膽酸鹽糞便復雜多糖糞便，植物材料膠原質組織血紅素（heme）血液腐植酸土壤，植物材料，自然界水黑色素頭發，皮膚尿素尿血色素hemoglobin血液靛青染料粗斜紋棉布聚苯乙烯，聚丙烯紫外線照射塑料管蛋白酶牛奶鈣離子牛奶，骨頭抑制劑來源抑制劑來源膽酸鹽糞便復雜多糖糞便，植物材料膠原質組抑制劑的作用濃度SDS離子去污劑，蛋白變性，0.01%即可完全抑制PCR反應，0.005%可顯著降低產量苯酚蛋白變性，0.5%即可完全抑制PCR反應，0.2%可顯著降低產量乙醇大于1%的濃度可抑制PCR反應，但在某些系統中可增加產量。異丙醇抑制作用比乙醇稍強乙酸鈉大于5mM時抑制PCR反應氯化鈉大于25mM時抑制PCR反應EDTA0.5mM可使PCR產物減少，1mM完全沒有PCR產物。血色素1mg/ml肝素0.15I.U./ml尿素20mM（相當于10μlPCR體系中含0.6μl尿液）氯高鐵血紅素0.1ng/μl丹寧酸0.1ng/μl抑制劑的作用濃度SDS離子去污劑，蛋白變性，0.01%即可例1：操作時溫度不同產生的抑制劑Shames等人（1995）使用PVP（polyvinylpyrollidone）在4℃分離糞便中的細菌DNA，然后用Chelex100處理。盡管用PVP在室溫也可以分離DNA，但得到的DNA用于PCR擴增效果不夠好，也許因為在更高的溫度釋放出了更多的PCR抑制劑。例1：操作時溫度不同產生的抑制劑Shames等人（1995）例2：間接產生的抑制劑YoshiiT等人1992年，用單根頭發提取DNA擴增線粒體DNA一段333bp的非編碼區。所有實驗均截取5cm長的毛干后研究表明染色劑中的過氧化氫可以使不溶于水的黑色素變成水溶性的。頭發種類截取毛干區域擴增成功率自然黑發離根部11cm內100%離根部11cm外部分成功離根部16cm外幾乎不成功白頭發離根部31cm外可成功染成深咖啡色的黑頭發完全失敗染成深咖啡色的白頭發可成功擴增例2：間接產生的抑制劑YoshiiT等人1992年，用單根PCR增強劑

PCR增強劑可以增加所需PCR產物的產量或減少非特異性產物。有許多的PCR增強劑，原理各不相同，這些試劑不可能對所有的PCR反應都起作用。根據其作用和原理，可以大致分為三類：1.用于擴增高GC含量或形成復雜二級結構的模板（共溶劑）2.用于保護DNA聚合酶的活性和穩定性3.用于優化引物和模板的結合PCR增強劑PCR增強劑可以增加所需PCR產物的產量或減少1.用于擴增高GC含量或形成復雜二級結構的模板的增強劑甜菜堿（betaine），二甲基亞砜（DMSO）和甲酰胺（formamide），甘油，適合于擴增高GC含量和形成復雜二級結構的模板。甜菜堿1M、DMSO1-10％（5%？）、甲酰胺1-5％、甘油1％-10％對某些反應可以顯著提高產量，但過量的這些試劑會抑制PCR反應。1.用于擴增高GC含量或形成復雜二級結構的模板的增強劑甜菜堿在高濃度時，許多添加劑和共溶劑都可以抑制PCR，對不同濃度的引物和模板DNA的組合都應該通過經驗來確定其最適濃度。根據我們的觀點，當PCR出現問題時首先考慮的不應該是使用這些增強劑，而應該是對反應體系的控制成分進行優化，尤其是鎂離子和鉀離子的濃度。這個普遍規律的一個例外是GC-Melt（Clontech公司）的應用，我們發現它常常能夠克服和解決對富含G+C的模板進行擴增時效率低下的問題。

《分子克隆實驗指南》Frackmanetal.(1998)havedemonstrated(usingNMRanalysis)thatthePCRadditiveprovidedbyQIAGENintheirPCRcorekit(Q-Solution)andthatprovidedbyCLONTECHintheAdvantage-GCcDNAPCRkitisinfactBetainewhichisavailableatafractionofthecostasa5MsolutionfromSigma-Aldrich(cat.#B0300)

在高濃度時，許多添加劑和共溶劑都可以抑制PCR，對不同濃度的2.用于保護聚合酶的活性和穩定性的增強劑有的反應中，0.1mg/ml的BSA、0.1-10％的明膠（gelatin）或非離子型的去污劑，可以解決一些擴增失敗的問題，這類試劑可以增加聚合酶的穩定性，減少試劑在管壁上的吸附。BSA可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用.非離子去污劑，例如Tween?-20,NP-40和Triton?X-100等，可以抵抗痕量的強離子去污劑的抑制作用，比如0.01%的SDS。2.用于保護聚合酶的活性和穩定性的增強劑有的反應中，0.1m3.用于優化引物和模板的結合

銨離子的添加，可以減少引物和模板的錯配，提高反應的特異性，可以讓PCR對反應條件的要求更低，所以很多PCR試劑都包含了10-20mM的硫酸銨。氯化四甲胺tetramethylammoniumchloride（TMAC）（15-100mM）也起到類似的作用3.用于優化引物和模板的結合

銨離子的添加，可以減少引物和模4.其它增強劑PEG亞精胺單鏈DNA結合蛋白4.其它增強劑PEG例：ReliefofAmplificationInhibitioninPCRwithBovineSerumAlbuminorT4Gene32Protein已知抑制劑：EDTA,SDS,TritonX-100，hemin（氯高鐵血紅素），bilirubin（膽紅素），sodiumglycocholate(甘膽酸鈉)，sodiumcholateplusdeoxycholate（脫氧膽酸鈉），sodiumtaurocholate,（牛黃膽酸鈉），tannicacids（丹寧酸），humicacid(腐植酸)，氯化鐵，氯化鈉，采自泥炭和Suwannee河的腐植酸和fulvicacid(棕黃酸)例：ReliefofAmplificationInhiPCR反應：擴增Bacteroidesdistasonis基因組消除腐植酸抑制作用的最優BSA濃度是200-400ng/μl，最優gp32濃度是100-150ng/μl因此，所有已知的抑制劑在檢測時，都同時做了不含BSA和gp32的檢測和含有400ng/μlBSA或150ng/μlgp32的檢測。抑制水平的定義：通過瓊脂糖電泳觀察，能夠可重復性的降低PCR產量的最低抑制劑濃度。PCR抑制劑和增強劑課件不添加任何增強劑不添加任何增強劑PCR體系中加入400ng/μlBSAPCR體系中加入400ng