實時熒光定量PCR

數據分析及常見問題分析實時熒光定量PCR

數據分析及常見問題分析1一、數據分析定量PCR擴增曲線的各種概念一、數據分析定量PCR擴增曲線的各種概念2一、數據分析什么是基線基線是擴增曲線的水平部分。一、數據分析什么是基線3一、數據分析基線扣除一、數據分析基線扣除4一、數據分析什么是閾值閾值是一個熒光強度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線。一、數據分析什么是閾值5一、數據分析什么是Ct值Ct值是閾值線與擴增曲線的交點對應在X軸上的值。一、數據分析什么是Ct值6一、數據分析基線一、數據分析基線7一、數據分析基線一、數據分析基線8一、數據分析基線一、數據分析基線9一、數據分析基線一、數據分析基線10一、數據分析閾值線一、數據分析閾值線11一、數據分析閾值線一、數據分析閾值線12實時熒光定量PCR數據分析及常見問題分析課件13二、常見問題分析1、PCR擴增抑制（以Bio-CFX96為例）擴增曲線熒光強度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在擴增抑制；解決方法：將樣本稀釋后進行擴增。（抑制物的影響可通過稀釋樣本消除）二、常見問題分析1、PCR擴增抑制（以Bio-CFX96為例14二、常見問題分析PCR抑制物黑色素多糖類血紅蛋白尿素其他乙醇

蛋白酶K胍鹽苯酚二、常見問題分析PCR抑制物15二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機制及對策抑制物作用原理對策肝素可結合于DNA和RNA上；對反轉錄酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化鋰血紅蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。1）DNA-瓊漿糖凝膠珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH處理。乳鐵蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。同上免疫球蛋白IgG與單鏈DNA相互作用同上亞鐵血紅素與DNA、RNA結合，后續的提取過程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，結合亞鐵血紅素二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機制及對策抑制物作用16二、常見問題分析檢查樣本質量用分光光度計測量樣本260/280比值DNA純度：OD260/OD280=1.8RNA純度：OD260/OD280=2.0二、常見問題分析檢查樣本質量17二、常見問題分析2、自動基線有問題二、常見問題分析2、自動基線有問題18二、常見問題分析手動設置基線點擊右鍵，選擇BaselineThreshold二、常見問題分析手動設置基線19二、常見問題分析手動設置基線將BaselineEnd設置為“擴增信號出現的前一個循環”即，原始為26，將其設置為20，點擊OK二、常見問題分析手動設置基線20二、常見問題分析手動設置基線設置完成后問題曲線恢復正常二、常見問題分析手動設置基線21二、常見問題分析3、重復性1個樣本4個復孔重復性好二、常見問題分析3、重復性22二、常見問題分析3、重復性1個樣本4個復孔重復性差二、常見問題分析3、重復性23二、常見問題分析造成重復性差的原因基線、閾值的設置加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻低拷貝的樣本→泊松分布沒有使用ROX校準（ABI7500）二、常見問題分析造成重復性差的原因24二、常見問題分析基線、閾值的設置根據曲線的具體情況進行設置：閾值：大部分曲線熒光強度/20基線：開始→2/3（根據儀器和試劑）

結束→擴增信號出現的前一個循環如果基線、閾值設置無問題，則是其它原因造成重復性差。二、常見問題分析基線、閾值的設置25二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻有時候在制備PCR反應混合液時（包括Goldstar/PCRMix反應液、引物探針、樣本、水），在分裝入反應板（管）前沒有充分混勻。結果加入到每個孔中的試劑成分就有所不同。解決方法：在分裝反應混合液前，要將其充分混勻（振蕩、吹打）離心。同時上機之前，要將PCR反應板（管）離心，使所有液體都在反應管底部。二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）26二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布泊松分布：是一種統計與概率學里常見到的離散機率分布（discreteprobabilitydistribution）。在30ul中有9個模板，每個反應管均勻的分配到3個模板的幾率有多高？如果30ul中有9000個模板呢，又會怎么樣？二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布27二、常見問題分析ROX校準：參比熒光（ABI7500）二、常見問題分析ROX校準：參比熒光（ABI7500）28二、常見問題分析ROX設置ABI7500儀器軟件自動進行ROX校準。ROX校準為可選步驟，如果使用的PCR試劑沒有添加ROX參比熒光，或者ROX添加濃度不適合，請將ROX校準關閉（None）。二、常見問題分析ROX設置29二、常見問題分析4、“可疑的”擴增曲線（以ABI7500為例）由于PCR擴增形成的真正的擴增曲線通常很容易確認。有特征的形狀：首先有背景信號（基線期），然后是三個增長階段（指數增長期、線性增長期和平臺期）二、常見問題分析4、“可疑的”擴增曲線（以ABI7500為30二、常見問題分析指數增長期內擴增曲線具有高度重復性二、常見問題分析指數增長期內擴增曲線具有高度重復性31二、常見問題分析是什么原因造成平臺期很低呢？可能是目標樣本的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低，反應體系中會形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴增曲線的平臺期很低。二、常見問題分析是什么原因造成平臺期很低呢？32二、常見問題分析引物和模板比例二、常見問題分析引物和模板比例33二、常見問題分析是否可以調整引物和模板的比例？YES。低引物濃度會導致高Ct值（靈敏度低）。所以對于低濃度的樣本，反應體系中引物的濃度卻不能太低。二、常見問題分析是否可以調整引物和模板的比例？34二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？首先看對數圖譜，和同一反應中的其它曲線相比，這些曲線的形狀不相同。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？35二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？同時這些曲線沒有明顯的指數增長期。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？36二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？最后看線性圖譜。曲線一直沒有上升的趨勢，提示不存在擴增。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？37二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？案例：

先看對數圖譜

右側的曲線形狀和擴增曲線很相似，但曲線不光滑。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？38二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？案例：

再看下線性圖譜，可以看到曲線有一定的上升。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？39二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？案例：分析：形成這類曲線的原因可能是模板可能是模板的質量差（PCR抑制物；模板濃度低），也有可能是引物探針有問題。試劑原因：如果使用的試劑背景信號太強，熒光的增長將會很小，導致擴增曲線的指數增長期會變得很短，或者沒有。熒光信號差的試劑也會有同樣的問題。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴增？40二、常見問題分析總結對PCR原理的了解是基礎，一切從原理出發。常見問題歸類：抑制物：稀釋樣本消除抑制重復性差：基線/閾值設置、加樣/混勻、泊松分布、參比熒光可疑的擴增：綜合各種圖譜分析二、常見問題分析總結41實時熒光定量PCR

數據分析及常見問題分析實時熒光定量PCR

數據分析及常見問題分析42一、數據分析定量PCR擴增曲線的各種概念一、數據分析定量PCR擴增曲線的各種概念43一、數據分析什么是基線基線是擴增曲線的水平部分。一、數據分析什么是基線44一、數據分析基線扣除一、數據分析基線扣除45一、數據分析什么是閾值閾值是一個熒光強度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線。一、數據分析什么是閾值46一、數據分析什么是Ct值Ct值是閾值線與擴增曲線的交點對應在X軸上的值。一、數據分析什么是Ct值47一、數據分析基線一、數據分析基線48一、數據分析基線一、數據分析基線49一、數據分析基線一、數據分析基線50一、數據分析基線一、數據分析基線51一、數據分析閾值線一、數據分析閾值線52一、數據分析閾值線一、數據分析閾值線53實時熒光定量PCR數據分析及常見問題分析課件54二、常見問題分析1、PCR擴增抑制（以Bio-CFX96為例）擴增曲線熒光強度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在擴增抑制；解決方法：將樣本稀釋后進行擴增。（抑制物的影響可通過稀釋樣本消除）二、常見問題分析1、PCR擴增抑制（以Bio-CFX96為例55二、常見問題分析PCR抑制物黑色素多糖類血紅蛋白尿素其他乙醇

蛋白酶K胍鹽苯酚二、常見問題分析PCR抑制物56二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機制及對策抑制物作用原理對策肝素可結合于DNA和RNA上；對反轉錄酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化鋰血紅蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。1）DNA-瓊漿糖凝膠珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH處理。乳鐵蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。同上免疫球蛋白IgG與單鏈DNA相互作用同上亞鐵血紅素與DNA、RNA結合，后續的提取過程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，結合亞鐵血紅素二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機制及對策抑制物作用57二、常見問題分析檢查樣本質量用分光光度計測量樣本260/280比值DNA純度：OD260/OD280=1.8RNA純度：OD260/OD280=2.0二、常見問題分析檢查樣本質量58二、常見問題分析2、自動基線有問題二、常見問題分析2、自動基線有問題59二、常見問題分析手動設置基線點擊右鍵，選擇BaselineThreshold二、常見問題分析手動設置基線60二、常見問題分析手動設置基線將BaselineEnd設置為“擴增信號出現的前一個循環”即，原始為26，將其設置為20，點擊OK二、常見問題分析手動設置基線61二、常見問題分析手動設置基線設置完成后問題曲線恢復正常二、常見問題分析手動設置基線62二、常見問題分析3、重復性1個樣本4個復孔重復性好二、常見問題分析3、重復性63二、常見問題分析3、重復性1個樣本4個復孔重復性差二、常見問題分析3、重復性64二、常見問題分析造成重復性差的原因基線、閾值的設置加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻低拷貝的樣本→泊松分布沒有使用ROX校準（ABI7500）二、常見問題分析造成重復性差的原因65二、常見問題分析基線、閾值的設置根據曲線的具體情況進行設置：閾值：大部分曲線熒光強度/20基線：開始→2/3（根據儀器和試劑）

結束→擴增信號出現的前一個循環如果基線、閾值設置無問題，則是其它原因造成重復性差。二、常見問題分析基線、閾值的設置66二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻有時候在制備PCR反應混合液時（包括Goldstar/PCRMix反應液、引物探針、樣本、水），在分裝入反應板（管）前沒有充分混勻。結果加入到每個孔中的試劑成分就有所不同。解決方法：在分裝反應混合液前，要將其充分混勻（振蕩、吹打）離心。同時上機之前，要將PCR反應板（管）離心，使所有液體都在反應管底部。二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）67二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布泊松分布：是一種統計與概率學里常見到的離散機率分布（discreteprobabilitydistribution）。在30ul中有9個模板，每個反應管均勻的分配到3個模板的幾率有多高？如果30ul中有9000個模板呢，又會怎么樣？二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布68二、常見問題分析ROX校準：參比熒光（ABI7500）二、常見問題分析ROX校準：參比熒光（ABI7500）69二、常見問題分析ROX設置ABI7500儀器軟件自動進行ROX校準。ROX校準為可選步驟，如果使用的PCR試劑沒有添加ROX參比熒光，或者ROX添加濃度不適合，請將ROX校準關閉（None）。二、常見問題分析ROX設置70二、常見問題分析4、“可疑的”擴增曲線（以ABI7500為例）由于PCR擴增形成的真正的擴增曲線通常很容易確認。有特征的形狀：首先有背景信號（基線期），然后是三個增長階段（指數增長期、線性增長期和平臺期）二、常見問題分析4、“可疑的”擴增曲線（以ABI7500為71二、常見問題分析指數增長期內擴增曲線具有高度重復性二、常見問題分析指數增長期內擴增曲線具有高度重復性72二、常見問題分析是什么原因造成平臺期很低呢？可能是目標樣本的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低，反應體系中會形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴增曲線的平臺期很低。二、常見問題分析是什么原因造成平臺期很低呢？73二、常見問題分析引物和模板比例二、常見問題分析引物和模板比例74二、常見問題分析是否可以調整引物和模板的比例？YES。低引物濃度會導致高Ct值（靈敏度低）。所以對于低濃度的樣本，反應體系中引物的濃度卻不能太低。二、常見問題分析是否可以調整引物和模板的比例？