第二單元原料預處理技術/第二單元原料預處理技術/學習目標1.發酵液預處理的目的和主要方法及其原理。2.常用的細胞破碎方法及原理。3.生物分離常用的離心、過濾方法。/學習目標1.發酵液預處理的目的和主要方法及其原理。/2第一節概述微生物發酵或動植物細胞培養結束后，發酵液(或培養液)中除含有所需的生物活性物質外，還存在大量的菌體、細胞、胞內外代謝產物及剩余的培養基成分等。/第一節概述微生物發酵或動植物細胞培養結束后，發酵液(或培養3常規處理方法先將菌體或細胞、固態培養基等固體懸浮顆粒與可溶性組分分離(即固-液分離)，然后再進行后續的分離純化操作單元。對于胞內產物來說，應先經細胞破碎，使生物活性物質轉移到液相后，再經固-液分離除去細胞碎片等固體雜質。/常規處理方法先將菌體或細胞、固態培養基等固體懸浮顆粒與可溶性4常用的固-液分離方法主要是：過濾和離心。但是不同來源的培養液和發酵液其固-液分離速度差異很大，取決于該介質的理化性狀，主要是細胞或菌體的大小和介質的黏度。細胞絮凝技術是近年來發展很快的一種行之有效的方法。/常用的固-液分離方法主要是：過濾和離心。/5發酵液中雜質很多，對后續分離影響最大的是高價無機離子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和雜蛋白等。在預處理時，應盡量出去這些物質。/發酵液中雜質很多，對后續分離影響最大的是高價無機離子(Ca26第二節預處理的目的和方法一、預處理的目的⑴改變發酵液的物理性質，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率。⑵盡可能使產物轉入便于后處理的某一相中(多數是液相)。⑶去除發酵液中部分雜質，以利于后續各步操作。/第二節預處理的目的和方法一、預處理的目的/7二、預處理方法1.加熱法此法的關鍵取決于產品的熱穩定性。是最簡單廉價的預處理方法，加熱可降低懸浮液的強度，加速聚集作用，去除某些蛋白質雜質，破壞凝膠狀結構，增加濾餅孔隙度，使固液分離變容易。/二、預處理方法1.加熱法/82.調節懸浮液的pH值這個方法也很簡便。全細胞的聚集作用取決于pH值的大小，恰當的pH能夠促進聚集作用，一般用草酸或無機酸或堿來調節。/2.調節懸浮液的pH值/93.凝聚和絮凝都是懸浮液預處理的重要方法。都是將化學藥劑預先投入懸浮液，改變細胞、菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態，破壞其穩定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。/3.凝聚和絮凝/10凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提高濾餅的滲透性或在深層過濾時產生較好的顆粒保留作用。深層過濾：顆粒尺寸比介質的孔道直徑小得多，但孔道彎曲細長，顆粒進入之后很容易被截住，更由于流體流過時所引起的擠壓和沖撞作用，顆粒緊附在孔道的壁面上，這種過濾是在介質內部進行的，介質表面無濾餅形成。/凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提11凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學物質(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的鹽類或石灰等)作用下，膠體脫穩并使粒子相互聚集成1mm大小的塊狀凝聚體的過程。凝聚劑的作用：對粒子表面電荷的中和；消除雙電荷層而脫穩；通過氫鍵或其他復雜的形式與粒子結合發生凝聚。/凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學物質(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的12凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質量聚電解質)將膠體粒子交聯成網，形成10mm大小絮凝團的過程。絮凝劑的作用：橋架作用。/凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質量聚電13絮凝過程

/絮凝過程

14絮凝劑相對凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細優化。最佳的絮凝劑使用劑量為：一般為大概一半的粒子表面被聚合物覆蓋時所使用的絮凝劑劑量。/絮凝劑相對凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細優化15凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無機類電解質，大多為陽離子型，分無機鹽類、金屬氫氧化物類和聚合無機鹽類等。絮凝劑：其官能團分為陰離子、陽離子和非離子三大類型。/凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無機類電解質，大多為陽離子164.去除雜蛋白質的其他方法⑴等電沉淀法蛋白質在等電點時溶解度最小，能沉淀除去。很多蛋白質的等電點在酸性范圍內(pH為4.0-5.5)。有些蛋白質在等電點時仍有溶解度，可結合其他方法。/4.去除雜蛋白質的其他方法⑴等電沉淀法/17⑵變性沉淀蛋白質從有規則的排列變成不規則結構的過程稱變性，變性蛋白質在水中的溶解度較小而產生沉淀。方法：加熱、大幅改變pH、加有機溶劑(丙酮、乙醇等)、加重金屬離子(Ag+,Cu2+,Pb2+等)、加有機酸(三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過氯酸等)及表面活性劑。/⑵變性沉淀/18⑶吸附吸附作用常能有效除去雜蛋白質。在發酵液中加入一些反應劑，它們相互反應生成的沉淀物對蛋白質具吸附作用而使其凝固。/⑶吸附/195.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時，發酵液黏度增大，固液分離困難，采用酶將其轉化為單糖以提高過濾速度。如在蛋白酶發酵液中加入淀粉酶，能將培養基中多余的淀粉水解成單糖，降低發酵液黏度，提高濾速。/5.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時，發酵液黏度增大，固液分206.高價金屬離子的去除對成品質量影響較大的無機雜質主要有：Ca2+,Mg2+,Fe3+等高價金屬離子，預處理中應將它們除去。/6.高價金屬離子的去除對成品質量影響較大的無機雜質主要有：C21

1、概念

細胞破碎是用物理、化學、酶或機械的方法來破壞細胞壁或細胞膜的方法。

細胞破碎技術是指利用外力破壞細

胞膜和細胞壁，使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術。

2、目的

破壞細胞外圍，使細胞內容物釋放出來。第三節細胞破碎技術

/

1、概念

細胞破碎是用物理、化學、酶或機械的方法223.原理⑴細胞的結構細胞壁的破碎最關鍵。動物細胞無細胞壁，易于破碎。植物和微生物細胞的細胞壁堅固，破碎困難。/3.原理/23①細菌革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖層組成，細胞壁厚，為15-50nm。革蘭氏陰性菌的細胞壁在肽聚糖外側還有脂蛋白和脂多糖及磷脂構成的兩層外壁層，肽聚糖層1.5-2nm，外壁層8-10nm。因此革蘭氏陽性菌的細胞壁比革蘭氏陰性菌堅固，較難破碎。/①細菌/24細胞壁的結構及組成圖3.1

細胞外層結構

/細胞壁的結構及組成圖3.1細胞外層結構/25②真菌和酵母細胞壁呈絲狀，比革蘭氏陽性菌的細胞壁厚，約60nm，更難破碎。③霉菌細胞壁較厚，為100-250nm。④哺乳類細胞、嗜鹽菌和支原體哺乳類細胞和嗜鹽菌缺乏堅硬的細胞壁，支原體沒有細胞壁，易破碎。/②真菌和酵母/26⑤藻類細胞壁較復雜，其主要成分是纖維狀的多糖類物質。/⑤藻類/27細胞壁的結構及組成微生物革蘭式陽性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（nm）20～8010～25100～300層單層多層多層主要組成肽聚糖(40~90%)肽聚糖(5~10%)葡聚糖(30~40%)多糖脂蛋白甘露聚糖（30％）胞壁酸脂多糖蛋白質磷脂蛋白質脂多糖蛋白質脂類破碎難易程度難相對易最難各種微生物細胞壁的結構及組成/細胞壁的結構及組成微生物革蘭式陽性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（n28⑵細胞破碎和產物釋放原理細胞破碎主要采用各種機械破碎法和化學破碎法，或二者的結合。機械破碎中細胞所受的機械作用力主要有壓縮力和剪切力。化學破碎又稱化學滲透，利用化學或生化試劑(酶)改變細胞壁或細胞膜結構，增大胞內物質溶解速率；或完全溶解細胞壁，形成原生質體后，在滲透壓的作用下使細胞膜破裂而釋放胞內物質。/⑵細胞破碎和產物釋放原理細胞破碎主要采用各種機械破碎法和化學29破碎方法細胞破碎機理/破碎方法細胞破碎機理/30二、細胞破碎法破碎方式機械法非機械法液體剪切作用固體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法壓榨高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學法物理法細胞破碎方法分類/二、細胞破碎法破碎方式機械法非機械法液體剪固體剪干燥溶胞珠磨31細胞壁的破碎破碎方法的選擇：

破碎目的待破碎生物體的類型破碎目的：獲取產品，考慮破碎收率和能耗；研究胞內產物在體內的功能，宜采用軟處理。待破碎生物體的類型：不同生物體對破碎有不同的敏感度/細胞壁的破碎破碎方法的選擇：破碎目的/32細胞壁的破碎

細胞對破碎的敏感度細胞聲波攪拌減壓冷凍壓力動物細胞7777革蘭式陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭式陽性芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5革蘭式陽性球菌3.5（2）325孢子2（1）21菌絲16（1）5

生物體的大小，形態，齡期，品系，生長條件，細胞壁結構，pH，溫度以及細胞的變化也影響對破碎的敏感度。/細胞壁的破碎細胞對破碎的敏感度細胞聲波攪拌減壓冷凍331.機械破碎方法HC23-高壓細胞破碎機⑴高壓勻漿法DY89-1型電動玻璃勻漿機/1.機械破碎方法HC23-高壓細胞破碎機⑴高壓勻漿法DY834作用機理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環隙高速(可達到450m／s)噴出后撞擊到碰撞環上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50～70MPa。

⑴高壓勻漿法/作用機理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環隙高速(可351.機械破碎方法影響細胞破碎的因素：溫度壓力循環操作次數細胞濃度閥座形式⑴高壓勻漿法/1.機械破碎方法影響細胞破碎的因素：⑴高壓勻漿法/36影響破碎效率的因素溫度：破碎率隨溫度的增加而增加例如：操作溫度由5℃增加到30℃，破碎率約提高1.5倍。高溫對破碎有利，但應考慮熱變性壓力每增加10MPa，溫度2℃。適用于酵母和細菌細胞的破碎。高壓勻漿法/影響破碎效率的因素溫度：高壓勻漿法/371.機械破碎方法珠磨機簡圖⑵

珠磨法生產廠商:

瑞士WAB公司德國西門子機械公司形式：立式臥式（效率高）/1.機械破碎方法珠磨機簡圖⑵珠磨法生產廠商:/38原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球和微球之間以及微球和細胞之間發生沖擊和研磨，使懸浮液中的細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產熱由夾套帶走。珠磨法/原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球和微球之間以及微39珠磨機主體：立式和臥式圓筒型腔體一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：因為立式機中向上流動的液體在某種程度上會使研磨珠流態化，從而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度為2.5g／cm3)或氧化鋯(密度為6.0g／cm3)微球(粒徑約0.1～10mm)，填充率為80％～85％。/珠磨機主體：立式和臥式圓筒型腔體/401.機械破碎方法動力學方程：遵循一級動力學方程珠磨法R：t時間內釋放的蛋白質數量（mg/g）Rm：能釋放的蛋白質最大數量，即100％破碎k：破碎速率常數，與珠粒大小、填充率、細胞濃度等有關其中：S＝R/Rm，破碎率/1.機械破碎方法動力學方程：遵循一級動力學方程珠磨法R：t411.機械破碎方法影響破碎效率的因素：轉盤外緣速度細胞濃度珠粒大小及裝載量溫度流速珠磨法/1.機械破碎方法影響破碎效率的因素：珠磨法/421.機械破碎方法珠磨法破碎過程產生大量熱能，設計時需考慮換熱問題。適用于絕大多數真菌菌絲和藻類等微生物細胞的破碎。影響破碎率的操作參數較多，操作過程優化設計較復雜。珠磨法/1.機械破碎方法珠磨法/431.機械破碎方法原理：細胞是彈性體，比一般剛性固體粒子難于破碎。將彈性細胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎難度，撞擊破碎正是基于這樣的原理。操作：細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(凍結速度為每分鐘數千攝氏度)，形成粒徑小于50um的微粒子。高速載氣(如氮氣，氣流約為300m/s)將凍結的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結的細胞發生破碎。⑶撞擊破碎法/1.機械破碎方法原理：⑶撞擊破碎法/441.機械破碎方法特點：細胞破碎僅發生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細胞破碎均勻，可避免反復受力發生過度破碎的現象。細胞破碎程度可通過無級調節載氣壓力(流速)控制，避免細胞內部結構的破壞，主要用于細胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于微生物細胞和植物細胞的破碎。⑶撞擊破碎法/1.機械破碎方法特點：⑶撞擊破碎法/451.機械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機⑷超聲波法/1.機械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機⑷超聲波法461.機械破碎方法作用機理：

在超聲波作用下，液體發生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和閉合產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關。超聲波法/1.機械破碎方法作用機理：超聲波法/471.機械破碎方法超聲波的負面影響：1、溫度上升：懸浮液預冷，夾套冷卻短期冷卻與短期破碎交替。2、超聲處理會引起諸如游離基這樣的化學效應，破壞目的產物，可加入游離基清除劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。3.影響因素：聲強、聲頻、溫度、時間、離子強度、pH、細胞類型。超聲波法/1.機械破碎方法超聲波的負面影響：超聲波法/481.機械破碎方法機械法破碎細胞的優缺點：優點：內含物全部釋放時間短，效率高，成本低通用性強，適于實驗室和工業生產缺點：需要高的能量產生高溫，高剪切力，引起產品變性失活非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難/1.機械破碎方法機械法破碎細胞的優缺點：/492.化學和生物化學滲透法(非機械法)作用機理：用化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分處理方法：酸堿處理；化學試劑；表面活性劑；有機溶劑EDTA螯合劑；變性劑化學滲透法/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)作用機理：化學滲透法/502.化學和生物化學滲透法(非機械法)⑴酸堿處理調節pH，改變蛋白質的荷電性質，提高產物的溶解度。⑵化學試劑處理用表面活性劑或有機溶劑(甲苯)處理細胞，增大細胞壁的通透性，降低胞內產物的相互作用，使之容易釋放。/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)⑴酸堿處理/512.化學和生物化學滲透法(非機械法)優點：產物釋放有一定的選擇性不需要特殊設備細胞外形保持完整，細胞碎片少，漿液粘度低，利于后續分離化學滲透法缺點：通用性差時間長，效率低某些化學試劑有毒/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)優點：化學滲透法缺點：/522.化學和生物化學滲透法(非機械法)應用：檢測胞內酶活性釋放胞內物質研究化學滲透法/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)應用：化學滲透法/532.化學和生物化學滲透法

(非機械法)作用機理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大腦內產物的遇透性。溶菌酶適用于革蘭氏陽性菌細胞壁的分解，應用于革蘭氏陰性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶。酵母細胞的酶溶需用Zymo1yase(幾種細菌酶的混合物)、-1,6—葡聚糖酶(或甘露糖酶）；破壞植物細胞壁需用纖維素酶。酶法胞溶/2.化學和生物化學滲透法

(非機械法)作用機理：酶溶法(En542.化學和生物化學滲透法

(非機械法)優點：產品釋放選擇性高抽提速率和收率高產品破壞少pH、溫度外界條件要求低不殘留細胞碎片酶法胞溶缺點：費用高通用性差存在產品抑制不適于工業生產/2.化學和生物化學滲透法

(非機械法)優點：酶法胞溶缺點：/552.化學和生物化學滲透法

(非機械法)應用：原生質體融合釋放出克隆出的胞內蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物與機械法破碎細胞協同使用從細胞內不同的位置選擇性的釋放蛋白酶法胞溶/2.化學和生物化學滲透法

(非機械法)應用：酶法胞溶/563.物理滲透法滲透壓沖擊法：

將細胞置于高滲透壓的介質中，使之脫水收縮，達到平衡后，將介質突然稀釋或將細胞轉置于低滲透壓的水或緩沖液中，在滲透壓的作用下，外界的水向細胞內滲透，使細胞變得腫脹，膨脹到一定程度，細胞破裂，它的內含物隨即釋放到溶液中。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/573.物理滲透法滲透壓沖擊法：

滲透壓沖擊(Osmoticshock)是在各種細胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細咆，如動物細胞和革蘭氏陰性菌。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/583.物理滲透法凍融法：

將細胞急劇凍結后在室溫緩慢融化，此凍結融化操作反復進行多次，使細胞受到破壞。凍結的作用是破壞細胞膜的疏水鍵結構，增加其親水性和通透性。另一方面，出于胞內水結晶使胞內外產生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細胞膨脹而破裂。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/593.物理滲透法凍融法：操作：將細胞急劇凍結至-20～-15℃，使之凝固，然后在室溫緩慢融化，此凍結融化操作反復進行多次，使細胞受到破壞。缺點：反復凍融使蛋白質變性，影響活性蛋白質的回收率。凍融法適用于比較脆弱的菌體。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/603.物理滲透法干燥法：

將細胞用不同的方法干燥（真空、冷凍、噴霧和氣流等），細胞膜結合水喪失，滲透性發生變化而破裂缺點：條件變化劇烈，易引起生物物質變性物理法/3.物理滲透法干燥法：物理法/61機械破碎法和非機械破碎法的比較比較項目機械法非機械法比較項目機械法非機械法破碎機理切碎細胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片細小碎片較大設備需專用設備不需專用設備內含物釋放全部部分通用性強差粘度高（核酸多）低（核酸少）經濟成本低成本高時間時間短時間長應用范圍實驗室、工業范圍實驗室范圍/機械破碎法和非機械破碎法的比較比較項目機械法非機械法比較項目62破碎技術的選擇原則：目的產物在細胞質中，需機械破碎法目的產物在細胞膜附近，可采用非機械破碎法目的產物與細胞膜或細胞壁結合，可采用兩種方法結合/破碎技術的選擇原則：/63破碎技術的研究發展方向：多種破碎方法結合與上游過程結合1、培養過程控制2、寄主細胞選擇3、克隆噬菌體溶解基因4、耐高溫產品的基因表達與下游結合從后分離過程考察細胞破碎技術/破碎技術的研究發展方向：/64第四節離心沉降與過濾分離技術一、離心沉降㈠沉降基本原理重力沉降：適用于分離較大的顆粒。重力沉降過程中固體顆粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用。當浮力、摩擦阻力和重力達到平衡時，球形固體顆粒勻速沉降。/第四節離心沉降與過濾分離技術一、離心沉降/65㈠沉降基本原理沉降速度：式中：dp—球形粒子直徑，m

ρs—粒子的密度，kg/m3

ρL—介質的密度，kg/m3g—重力加速度，m/s2μL

—流體介質的黏度，Pa·s/㈠沉降基本原理沉降速度：/66離心沉降離心沉降：

依靠慣性離心力的作用而實現的沉降過程。

適于分離兩相密度差較小，顆粒粒度較細的非均相物系。氣固物系：旋風分離器；液固物系：旋液分離器或沉降離心機。/離心沉降離心沉降：67離心沉降離心沉降速度：式中：N—轉鼓轉速，r/minr—球形粒子半徑，mS—沉降系數

ω—轉鼓的旋轉角速度，rad/s/離心沉降離心沉降速度：/68離心沉降從該式可以看出：①當ρs＞ρL，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當ρs=ρL，則S=0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρs＜ρL，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。蛋白質離心沉降時，蛋白質的相對分子質量越大，沉降系數越大，離心沉降速度越大。/離心沉降從該式可以看出：/69㈡離心分離法1.差速離心分離法原理：利用不同粒子在離心力場中沉降的差別(大而重的顆粒沉降最快，最先到達底部)，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分級沉淀。/㈡離心分離法1.差速離心分離法/70操作：一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。優點：操作最簡便，使用最廣泛。缺點：分辨率不高，沉淀系數在同一數量級內的各種粒子不容易分開，常用于粗制品提取。/操作：/712.區帶離心分離法根據操作條件不同，分為差速區帶離心和平衡區帶離心。3.差速區帶離心分離法在離心前將密度梯度介質(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)裝入離心管內，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部，同梯度液一起離心。/2.區帶離心分離法/72差速區帶離心分離法離心后在近旋轉軸(r1)處的介質密度最小，離旋轉軸最遠(r2)處介質的密度最大，但最大介質密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρs＞ρL。梯度液在離心過程中和離心完畢后，取樣時起著支持介質和穩定劑的作用，避免分層粒子的再混和。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。/差速區帶離心分離法離心后在近旋轉軸(r1)處的介質密度最小，734.等密度離心分離法在離心前預先配制介質的密度梯度，密度梯度液包含被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，梯度液形成底濃頂稀的密度梯度，原來分布均勻的粒子也發生重新分布。/4.等密度離心分離法/74在管頂處粒子密度大于介質密度，粒子沉降；當管底介質的密度大于粒子密度，粒子上浮；粒子進入它本身的密度位置，粒子不再移動。只要轉速、溫度不變，延長離心時間也不改變粒子的成帶位置。此法應用于物質的大小相近，密度差異較大時。/在管頂處粒子密度大于介質密度，粒子沉降；當管底介質的密度大于75

㈢

Centrifuges離心分離設備/

㈢Centrifuges離心分離設備/76//77

常用的離心機：a、Tubularbowl:管式離心機最簡單，可提供較大離心力；管狀離心機可以冷卻，在蛋白質生產中很有利；懸浮液由管底進，澄清液由管口流出。//78沉降離心機類型

管式離心機特點是轉鼓(管)直徑小、長度大、轉速高、分離效率很高，可以處理顆粒粒徑為0.01mm的懸浮液和難分離的乳濁液。可連續操作，懸浮液或乳濁液由轉鼓下端加入，被轉鼓內的縱向肋板帶動迅速達到與轉鼓同角速度旋轉。在離心力作用下，顆粒或重液層甩向鼓壁由重液出口引出，輕液則從轉鼓中心部位溢出。離心分離因數可達65,000，工業上可用于油水分離，實驗室中可用于分離微生物和蛋白質。管式離心機示意圖/沉降離心機類型管式離心機特點是轉鼓(管)直徑小、長度79Tubularbowl/Tubularbowl/80管壁上沉積物為濃漿*可連續加料至流出物固體損失使離心不能正常進行*須定時拆卸、清洗，這種間斷性操作也是最大的缺點//81SRBA2圓筒式離心機懸浮液沿圓筒的旋轉軸連續加入，通過筒壁上的小孔流出中空柱狀料液的內徑為一常數，不隨料液的加入而改變

濾餅在筒壁上沉積/SRBA2圓筒式離心機懸浮液沿圓筒的旋轉軸連續加入，通過筒82沉降離心機適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細小、密度差不大的體系的分離。離心分離因素達50,000以上的超高速離心機甚至可以使不同分子量的蛋白質分子在具有密度梯度的溶液中分級。沉降離心機工作原理/沉降離心機適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細小、密度差83沉降離心機類型

碟式離心機(薄層分離沉降離心機)轉鼓內裝有一疊隨轉鼓旋轉的倒錐形碟片，碟片間隙為0.5～1.5mm，分離因素可達3000~10000。懸浮液由中心管引入轉鼓，分配在碟片之間形成薄層流動。在離心力作用下，顆粒沉降到碟片內側表面并向外滑動。清液則沿碟片外側表面向內流動。碟片擴展了沉降面，縮短了沉降距離，故具有較大的生產能力和較高的分離效率，適于處理粒徑0.1～100mm、固含量小于25%的懸浮液。噴嘴排渣碟式離心機/沉降離心機類型碟式離心機(薄層分離沉降離心機)轉鼓內裝84b、Disctypecentrifuge碟片式離心機/b、Disctypecentrifuge85*這種離心機在生物分離中非常常見，可連續操作但結構復雜，價格較高。*料液由管頂進，清液從加料口附近環行裂口流出和管式離心機最顯著的區別：固體即非間歇式的被移出，也不通過離心機管壁上的孔連續的去除填充固體的性質決定離心機類型微粒在離心力場作用下,將沿碟片底部運動到碟片外邊緣,匯集到濾渣中，再清除掉。/*這種離心機在生物分離中非常常見，可連續操作但結構復雜，價86二、過濾1.過濾基本原理利用多孔性介質截留固液懸浮液中的固體粒子，進行固-液分離的方法。是工業生產中用于分離細胞和不溶性物質的主要方法。對于一定形狀的粗大、堅硬晶體來說，這一操作并不困難，但對于過濾的對象是生物體，發酵液中的微生物細胞均是易變形的柔軟體，一經壓縮就會變形，且發酵液黏度很大，因此過濾困難。/二、過濾1.過濾基本原理/872.影響過濾的因素⑴混合物中懸浮微粒的性質和大小懸浮微粒越大，粒子越堅硬，大小越均勻，固-液分離越容易。發酵液中細菌體積較小，分離較困難。膠體粒子通常懸浮于流體中，須運用凝聚和絮凝技術，增大懸粒子體積，利于固-液分離。/2.影響過濾的因素/88⑵混合液的黏度流體的流動特性對固液分離的影響很大，流體的黏度越大，固液分離越困難。通常黏度與組成和濃度有關，組成越復雜，濃度越高，黏度越大。/⑵混合液的黏度/89⑶操作溫度、pH等的控制也會影響固液分離速率。溫度升高，流體黏度降低；調整pH可改變流體黏度，使固液分離效率提高。⑷助濾劑的使用惰性助濾劑是一種顆粒均勻、質地堅硬、不可壓縮的粒狀物質，用于擴大過濾表面的適用范圍，減輕過濾時的快速擠壓和介質堵塞的現象。/⑶操作/90助濾劑的機理：

助濾劑具有吸附膠體的能力，助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型結構，不可壓縮，濾孔不會全部堵塞，保持滲透性。既能使細小顆粒狀膠態物質截留在格子骨架上，又能使清液有流暢的通道。/助濾劑的機理：/91助濾劑的使用方法：①在濾布上預先涂一層助濾劑，作為過濾介質使用，待濾畢后與濾餅一起除去。②按一定比例均勻混入待濾的懸浮液中，一起進入過濾機，形成較疏松的濾餅，降低其可壓縮性，讓濾液順暢流通。惰性助濾劑的材料：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳渣、重質碳酸鈣或這些材料的混合物。/助濾劑的使用方法：/92選擇和使用助濾劑時應考慮以下因素：①根據目標物的性質選擇助濾劑品種。若目標物存在于液相，應考慮目標物是否會被助濾劑吸附，是否可通過改變pH來減少吸附；若目標物存在于固相，一般使用淀粉、纖維素等不影響產品質量的助濾劑。/選擇和使用助濾劑時應考慮以下因素：/93②根據過濾介質和過濾情況選擇助濾劑品種。當使用粗目濾網時易泄漏，采用石棉粉、纖維素、淀粉等助濾劑可有效防止泄漏。當使用細目濾布時，宜采用細硅藻土，若用粗粒硅藻土，料液中的細微顆粒仍將透過助濾層到達濾布表面，增大過濾阻力。/②根據過濾介質和過濾情況選擇助濾劑品種。/94③粒度選擇。助濾劑的粒度及粒度分布對過濾速率和濾液澄清度影響很大。粒度一定時，過濾速率與澄清度成反比，過濾速率大，澄清度差；過濾速率小，澄清度好。助濾劑的粒度必須與懸浮液中固體粒子的尺寸相適應，如顆粒較小的懸浮液應采用較細的助濾。/③粒度選擇。/95④用量的確定。助濾劑的用量必須適宜。用量過少，助濾作用小；用量過多，不僅浪費，還會因助濾劑成為主要的濾餅阻力而使過濾速率下降。/④用量的確定。/963.過濾方程用數學形式描述過濾操作，可從流體力學的基本觀點出發，即從生物化工原理中可知，過濾的基本方程是達西公式：式中，A—過濾斷面積，m2Rm—介質阻力，m-1

Δp—壓力差，PaRc—濾餅阻力，m-1μL—流體介質的黏度，Pa·s/3.過濾方程用數學形式描述過濾操作，可從流體力學的基本觀點出97過濾的阻力來自于過濾介質和濾餅。通常，Rm是常量，Rc隨著過濾時間的推移，逐漸增大。濾餅阻力與濾餅干基質量m的關系為式中，Rc—濾餅阻力，m-1m—濾餅干重，kg

α—濾餅的平均比阻，m/kgA—過濾斷面積，m2/過濾的阻力來自于過濾介質和濾餅。通常，Rm是常量，Rc隨著過98不可壓縮濾餅，α是常數；可壓縮濾餅的α是壓力差的函數：α=k·Δpm生物過程中，可壓縮濾餅最常見。可壓縮濾餅的比阻隨壓力差提高而增大，因此，過濾操作中，壓力差是最重要的操作參數，對可壓縮濾餅，一定要緩慢增大操作壓力。/不可壓縮濾餅，α是常數；可壓縮濾餅的α是壓力差的函數：α99過濾時，按照外加壓力和流速的變化，可將過濾操作分為：①恒壓過濾—用壓縮空氣或真空作為推動力；②恒速過濾—用定容泵來輸送料液；③變速—變壓過濾—用離心泵來實現。由于濾餅是影響過濾速度的主要因素，因此在過濾操作前，要對濾液進行絮凝等預處理，降低濾餅的阻力。/過濾時，按照外加壓力和流速的變化，可將過濾操作分為：/1004.過濾設備生物分離常用的過濾設備主要有：加壓葉濾機、板框過濾機、回轉真空過濾機等。板框過濾機使用最為普遍。/4.過濾設備生物分離常用的過濾設備主要有：加壓葉濾機、板框過101(1)板框壓濾機板框壓濾機最為常用，由濾板和濾框組成，兩者間襯以濾布(過濾介質)。濾板起到支撐濾布和分布懸浮液的作用，濾框則起到存放濾餅的作用。這里過濾機可以得到含水量較低的濾餅，但當產生有毒氣體或生物危險物存在的場合，不宜使用。其他三種過濾機則都是封閉式的，可用于存在有毒煙霧或生物危險物的場合。/(1)板框壓濾機/102(2)水平板式過濾機適用于小規模分離操作，濾片的清洗和過濾介質的安裝必須放在機外進行。(3)垂直葉濾機具有較大的比過濾面積。(4)管狀過濾機管狀垂直過濾機內過濾罐系懸掛在管板上，濾餅在管子外表面形成，濾液流動通過沉積在管上的濾餅進入頂蓋并排出，管子可用反沖法清洗。/(2)水平板式過濾機/103(5)回轉真空過濾機教材p24/(5)回轉真空過濾機/104三、包含體的分離和蛋白質復性包含體：是很多利用大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產物，在細胞內凝聚成沒有生物活性的不溶于水的固體顆粒。包含體主要由蛋白質構成，它的一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。/三、包含體的分離和蛋白質復性包含體：是很多利用大腸桿菌為宿主1051.包含體的形成與分離包含體的形成有以下幾種可能性：⑴少量蛋白質產生時是可溶的，其后積聚的量過多，在細胞內超過其溶解度而沉淀，并隨誘導時間延長，不溶部分增加，但細胞裂解，并用適當溶劑稀釋后，可轉為溶解狀態。⑵蛋白質合成太快，肽鏈來不及形成正常的折疊構象，導致分子間疏水基相互作用聚合而不溶，此時即使稀釋也不能溶解，生物活性受到影響。/1.包含體的形成與分離包含體的形成有以下幾種可能性：/106⑶高表達的蛋白質沒有形成分子內正常的二硫鍵連接，這可能是由于肽鍵來不及形成正常的折疊構象而導致錯誤的二硫鍵連接，或是高表達時細胞內氧化還原等條件不同而生成不同的二硫鍵連接。⑷蛋白質的溶解需要與其他成分結合或經其他成分誘導形成適當的和可溶性的構象，當產生的蛋白質量過多，所需其他成分相對不足，蛋白質就不能溶解。/⑶高表達的蛋白質沒有形成分子內正常的二硫鍵連接，這可能是由于107⑸包含體的形成亦與蛋白質自身穩定性有關。因此，工程菌株產生的重組蛋白質的回收應包括以下步驟：①包含體的分離；②用變性劑溶解包含體中的蛋白質；③變性蛋白質的復性和重新氧化(包括除去過剩的變性劑和還原劑)；④以一般純化技術，獲取成品蛋白質。/⑸包含體的形成亦與蛋白質自身穩定性有關。/1082.包含體的溶解包含體常用變性尿素或鹽酸胍，以及去污劑SDS(十二烷基磺酸鈉)來溶解，它們可分別破壞蛋白質的高級結構及肽鏈之間的疏水作用，從而使蛋白質肽鏈相互分離。溶解包含體的變性劑主要用6-8mol/L的鹽酸胍或脲。/2.包含體的溶解包含體常用變性尿素或鹽酸胍，以及去污劑SDS1093.蛋白質復性包含體大多是蛋白質在過量表達過程中不正確折疊形成的，而正確構象的形成需要進行變性和復性，它是一個具有雙重作用的過程：結構上使伸展的肽鍵成為特定的三維結構；功能上使無活性的分子成為具有特定功能的分子。/3.蛋白質復性包含體大多是蛋白質在過量表達過程中不正確折疊形110第二單元原料預處理技術/第二單元原料預處理技術/學習目標1.發酵液預處理的目的和主要方法及其原理。2.常用的細胞破碎方法及原理。3.生物分離常用的離心、過濾方法。/學習目標1.發酵液預處理的目的和主要方法及其原理。/112第一節概述微生物發酵或動植物細胞培養結束后，發酵液(或培養液)中除含有所需的生物活性物質外，還存在大量的菌體、細胞、胞內外代謝產物及剩余的培養基成分等。/第一節概述微生物發酵或動植物細胞培養結束后，發酵液(或培養113常規處理方法先將菌體或細胞、固態培養基等固體懸浮顆粒與可溶性組分分離(即固-液分離)，然后再進行后續的分離純化操作單元。對于胞內產物來說，應先經細胞破碎，使生物活性物質轉移到液相后，再經固-液分離除去細胞碎片等固體雜質。/常規處理方法先將菌體或細胞、固態培養基等固體懸浮顆粒與可溶性114常用的固-液分離方法主要是：過濾和離心。但是不同來源的培養液和發酵液其固-液分離速度差異很大，取決于該介質的理化性狀，主要是細胞或菌體的大小和介質的黏度。細胞絮凝技術是近年來發展很快的一種行之有效的方法。/常用的固-液分離方法主要是：過濾和離心。/115發酵液中雜質很多，對后續分離影響最大的是高價無機離子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和雜蛋白等。在預處理時，應盡量出去這些物質。/發酵液中雜質很多，對后續分離影響最大的是高價無機離子(Ca2116第二節預處理的目的和方法一、預處理的目的⑴改變發酵液的物理性質，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率。⑵盡可能使產物轉入便于后處理的某一相中(多數是液相)。⑶去除發酵液中部分雜質，以利于后續各步操作。/第二節預處理的目的和方法一、預處理的目的/117二、預處理方法1.加熱法此法的關鍵取決于產品的熱穩定性。是最簡單廉價的預處理方法，加熱可降低懸浮液的強度，加速聚集作用，去除某些蛋白質雜質，破壞凝膠狀結構，增加濾餅孔隙度，使固液分離變容易。/二、預處理方法1.加熱法/1182.調節懸浮液的pH值這個方法也很簡便。全細胞的聚集作用取決于pH值的大小，恰當的pH能夠促進聚集作用，一般用草酸或無機酸或堿來調節。/2.調節懸浮液的pH值/1193.凝聚和絮凝都是懸浮液預處理的重要方法。都是將化學藥劑預先投入懸浮液，改變細胞、菌體和蛋白質等膠體粒子的分散狀態，破壞其穩定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。/3.凝聚和絮凝/120凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提高濾餅的滲透性或在深層過濾時產生較好的顆粒保留作用。深層過濾：顆粒尺寸比介質的孔道直徑小得多，但孔道彎曲細長，顆粒進入之后很容易被截住，更由于流體流過時所引起的擠壓和沖撞作用，顆粒緊附在孔道的壁面上，這種過濾是在介質內部進行的，介質表面無濾餅形成。/凝聚和絮凝都能有效增加顆粒尺寸，增大顆粒的沉降或浮選速率，提121凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學物質(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的鹽類或石灰等)作用下，膠體脫穩并使粒子相互聚集成1mm大小的塊狀凝聚體的過程。凝聚劑的作用：對粒子表面電荷的中和；消除雙電荷層而脫穩；通過氫鍵或其他復雜的形式與粒子結合發生凝聚。/凝聚和絮凝凝聚：在投加的化學物質(如：水解的凝聚劑，鋁、鐵的122凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質量聚電解質)將膠體粒子交聯成網，形成10mm大小絮凝團的過程。絮凝劑的作用：橋架作用。/凝聚和絮凝絮凝：使用絮凝劑(通常是天然或合成的大分子質量聚電123絮凝過程

/絮凝過程

124絮凝劑相對凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細優化。最佳的絮凝劑使用劑量為：一般為大概一半的粒子表面被聚合物覆蓋時所使用的絮凝劑劑量。/絮凝劑相對凝聚劑而言更昂貴，其使用劑量必須正確使用并仔細優化125凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無機類電解質，大多為陽離子型，分無機鹽類、金屬氫氧化物類和聚合無機鹽類等。絮凝劑：其官能團分為陰離子、陽離子和非離子三大類型。/凝聚劑和絮凝劑的類型凝聚劑：主要是無機類電解質，大多為陽離子1264.去除雜蛋白質的其他方法⑴等電沉淀法蛋白質在等電點時溶解度最小，能沉淀除去。很多蛋白質的等電點在酸性范圍內(pH為4.0-5.5)。有些蛋白質在等電點時仍有溶解度，可結合其他方法。/4.去除雜蛋白質的其他方法⑴等電沉淀法/127⑵變性沉淀蛋白質從有規則的排列變成不規則結構的過程稱變性，變性蛋白質在水中的溶解度較小而產生沉淀。方法：加熱、大幅改變pH、加有機溶劑(丙酮、乙醇等)、加重金屬離子(Ag+,Cu2+,Pb2+等)、加有機酸(三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過氯酸等)及表面活性劑。/⑵變性沉淀/128⑶吸附吸附作用常能有效除去雜蛋白質。在發酵液中加入一些反應劑，它們相互反應生成的沉淀物對蛋白質具吸附作用而使其凝固。/⑶吸附/1295.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時，發酵液黏度增大，固液分離困難，采用酶將其轉化為單糖以提高過濾速度。如在蛋白酶發酵液中加入淀粉酶，能將培養基中多余的淀粉水解成單糖，降低發酵液黏度，提高濾速。/5.不溶性多糖的去除不溶性多糖較多時，發酵液黏度增大，固液分1306.高價金屬離子的去除對成品質量影響較大的無機雜質主要有：Ca2+,Mg2+,Fe3+等高價金屬離子，預處理中應將它們除去。/6.高價金屬離子的去除對成品質量影響較大的無機雜質主要有：C131

1、概念

細胞破碎是用物理、化學、酶或機械的方法來破壞細胞壁或細胞膜的方法。

細胞破碎技術是指利用外力破壞細

胞膜和細胞壁，使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術。

2、目的

破壞細胞外圍，使細胞內容物釋放出來。第三節細胞破碎技術

/

1、概念

細胞破碎是用物理、化學、酶或機械的方法1323.原理⑴細胞的結構細胞壁的破碎最關鍵。動物細胞無細胞壁，易于破碎。植物和微生物細胞的細胞壁堅固，破碎困難。/3.原理/133①細菌革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖層組成，細胞壁厚，為15-50nm。革蘭氏陰性菌的細胞壁在肽聚糖外側還有脂蛋白和脂多糖及磷脂構成的兩層外壁層，肽聚糖層1.5-2nm，外壁層8-10nm。因此革蘭氏陽性菌的細胞壁比革蘭氏陰性菌堅固，較難破碎。/①細菌/134細胞壁的結構及組成圖3.1

細胞外層結構

/細胞壁的結構及組成圖3.1細胞外層結構/135②真菌和酵母細胞壁呈絲狀，比革蘭氏陽性菌的細胞壁厚，約60nm，更難破碎。③霉菌細胞壁較厚，為100-250nm。④哺乳類細胞、嗜鹽菌和支原體哺乳類細胞和嗜鹽菌缺乏堅硬的細胞壁，支原體沒有細胞壁，易破碎。/②真菌和酵母/136⑤藻類細胞壁較復雜，其主要成分是纖維狀的多糖類物質。/⑤藻類/137細胞壁的結構及組成微生物革蘭式陽性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（nm）20～8010～25100～300層單層多層多層主要組成肽聚糖(40~90%)肽聚糖(5~10%)葡聚糖(30~40%)多糖脂蛋白甘露聚糖（30％）胞壁酸脂多糖蛋白質磷脂蛋白質脂多糖蛋白質脂類破碎難易程度難相對易最難各種微生物細胞壁的結構及組成/細胞壁的結構及組成微生物革蘭式陽性菌革蘭式陰性菌酵母壁厚（n138⑵細胞破碎和產物釋放原理細胞破碎主要采用各種機械破碎法和化學破碎法，或二者的結合。機械破碎中細胞所受的機械作用力主要有壓縮力和剪切力。化學破碎又稱化學滲透，利用化學或生化試劑(酶)改變細胞壁或細胞膜結構，增大胞內物質溶解速率；或完全溶解細胞壁，形成原生質體后，在滲透壓的作用下使細胞膜破裂而釋放胞內物質。/⑵細胞破碎和產物釋放原理細胞破碎主要采用各種機械破碎法和化學139破碎方法細胞破碎機理/破碎方法細胞破碎機理/140二、細胞破碎法破碎方式機械法非機械法液體剪切作用固體剪切作用干燥處理溶胞作用珠磨法壓榨高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學法物理法細胞破碎方法分類/二、細胞破碎法破碎方式機械法非機械法液體剪固體剪干燥溶胞珠磨141細胞壁的破碎破碎方法的選擇：

破碎目的待破碎生物體的類型破碎目的：獲取產品，考慮破碎收率和能耗；研究胞內產物在體內的功能，宜采用軟處理。待破碎生物體的類型：不同生物體對破碎有不同的敏感度/細胞壁的破碎破碎方法的選擇：破碎目的/142細胞壁的破碎

細胞對破碎的敏感度細胞聲波攪拌減壓冷凍壓力動物細胞7777革蘭式陰性芽孢桿菌和球菌6566革蘭式陽性芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5革蘭式陽性球菌3.5（2）325孢子2（1）21菌絲16（1）5

生物體的大小，形態，齡期，品系，生長條件，細胞壁結構，pH，溫度以及細胞的變化也影響對破碎的敏感度。/細胞壁的破碎細胞對破碎的敏感度細胞聲波攪拌減壓冷凍1431.機械破碎方法HC23-高壓細胞破碎機⑴高壓勻漿法DY89-1型電動玻璃勻漿機/1.機械破碎方法HC23-高壓細胞破碎機⑴高壓勻漿法DY8144作用機理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環隙高速(可達到450m／s)噴出后撞擊到碰撞環上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。高壓勻漿器的操作壓力通常為50～70MPa。

⑴高壓勻漿法/作用機理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環隙高速(可1451.機械破碎方法影響細胞破碎的因素：溫度壓力循環操作次數細胞濃度閥座形式⑴高壓勻漿法/1.機械破碎方法影響細胞破碎的因素：⑴高壓勻漿法/146影響破碎效率的因素溫度：破碎率隨溫度的增加而增加例如：操作溫度由5℃增加到30℃，破碎率約提高1.5倍。高溫對破碎有利，但應考慮熱變性壓力每增加10MPa，溫度2℃。適用于酵母和細菌細胞的破碎。高壓勻漿法/影響破碎效率的因素溫度：高壓勻漿法/1471.機械破碎方法珠磨機簡圖⑵

珠磨法生產廠商:

瑞士WAB公司德國西門子機械公司形式：立式臥式（效率高）/1.機械破碎方法珠磨機簡圖⑵珠磨法生產廠商:/148原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球和微球之間以及微球和細胞之間發生沖擊和研磨，使懸浮液中的細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。產熱由夾套帶走。珠磨法/原理：在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運動，微球和微球之間以及微149珠磨機主體：立式和臥式圓筒型腔體一般，臥式比立式珠磨破碎效率高：因為立式機中向上流動的液體在某種程度上會使研磨珠流態化，從而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度為2.5g／cm3)或氧化鋯(密度為6.0g／cm3)微球(粒徑約0.1～10mm)，填充率為80％～85％。/珠磨機主體：立式和臥式圓筒型腔體/1501.機械破碎方法動力學方程：遵循一級動力學方程珠磨法R：t時間內釋放的蛋白質數量（mg/g）Rm：能釋放的蛋白質最大數量，即100％破碎k：破碎速率常數，與珠粒大小、填充率、細胞濃度等有關其中：S＝R/Rm，破碎率/1.機械破碎方法動力學方程：遵循一級動力學方程珠磨法R：t1511.機械破碎方法影響破碎效率的因素：轉盤外緣速度細胞濃度珠粒大小及裝載量溫度流速珠磨法/1.機械破碎方法影響破碎效率的因素：珠磨法/1521.機械破碎方法珠磨法破碎過程產生大量熱能，設計時需考慮換熱問題。適用于絕大多數真菌菌絲和藻類等微生物細胞的破碎。影響破碎率的操作參數較多，操作過程優化設計較復雜。珠磨法/1.機械破碎方法珠磨法/1531.機械破碎方法原理：細胞是彈性體，比一般剛性固體粒子難于破碎。將彈性細胞冷凍使其成為剛性球體，降低破碎難度，撞擊破碎正是基于這樣的原理。操作：細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(凍結速度為每分鐘數千攝氏度)，形成粒徑小于50um的微粒子。高速載氣(如氮氣，氣流約為300m/s)將凍結的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結的細胞發生破碎。⑶撞擊破碎法/1.機械破碎方法原理：⑶撞擊破碎法/1541.機械破碎方法特點：細胞破碎僅發生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細胞破碎均勻，可避免反復受力發生過度破碎的現象。細胞破碎程度可通過無級調節載氣壓力(流速)控制，避免細胞內部結構的破壞，主要用于細胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于微生物細胞和植物細胞的破碎。⑶撞擊破碎法/1.機械破碎方法特點：⑶撞擊破碎法/1551.機械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機⑷超聲波法/1.機械破碎方法JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機⑷超聲波法1561.機械破碎方法作用機理：

在超聲波作用下，液體發生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和閉合產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關。超聲波法/1.機械破碎方法作用機理：超聲波法/1571.機械破碎方法超聲波的負面影響：1、溫度上升：懸浮液預冷，夾套冷卻短期冷卻與短期破碎交替。2、超聲處理會引起諸如游離基這樣的化學效應，破壞目的產物，可加入游離基清除劑（組氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。3.影響因素：聲強、聲頻、溫度、時間、離子強度、pH、細胞類型。超聲波法/1.機械破碎方法超聲波的負面影響：超聲波法/1581.機械破碎方法機械法破碎細胞的優缺點：優點：內含物全部釋放時間短，效率高，成本低通用性強，適于實驗室和工業生產缺點：需要高的能量產生高溫，高剪切力，引起產品變性失活非專一性，碎片分布寬，給分離造成困難/1.機械破碎方法機械法破碎細胞的優缺點：/1592.化學和生物化學滲透法(非機械法)作用機理：用化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分處理方法：酸堿處理；化學試劑；表面活性劑；有機溶劑EDTA螯合劑；變性劑化學滲透法/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)作用機理：化學滲透法/1602.化學和生物化學滲透法(非機械法)⑴酸堿處理調節pH，改變蛋白質的荷電性質，提高產物的溶解度。⑵化學試劑處理用表面活性劑或有機溶劑(甲苯)處理細胞，增大細胞壁的通透性，降低胞內產物的相互作用，使之容易釋放。/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)⑴酸堿處理/1612.化學和生物化學滲透法(非機械法)優點：產物釋放有一定的選擇性不需要特殊設備細胞外形保持完整，細胞碎片少，漿液粘度低，利于后續分離化學滲透法缺點：通用性差時間長，效率低某些化學試劑有毒/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)優點：化學滲透法缺點：/1622.化學和生物化學滲透法(非機械法)應用：檢測胞內酶活性釋放胞內物質研究化學滲透法/2.化學和生物化學滲透法(非機械法)應用：化學滲透法/1632.化學和生物化學滲透法

(非機械法)作用機理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大腦內產物的遇透性。溶菌酶適用于革蘭氏陽性菌細胞壁的分解，應用于革蘭氏陰性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶。酵母細胞的酶溶需用Zymo1yase(幾種細菌酶的混合物)、-1,6—葡聚糖酶(或甘露糖酶）；破壞植物細胞壁需用纖維素酶。酶法胞溶/2.化學和生物化學滲透法

(非機械法)作用機理：酶溶法(En1642.化學和生物化學滲透法

(非機械法)優點：產品釋放選擇性高抽提速率和收率高產品破壞少pH、溫度外界條件要求低不殘留細胞碎片酶法胞溶缺點：費用高通用性差存在產品抑制不適于工業生產/2.化學和生物化學滲透法

(非機械法)優點：酶法胞溶缺點：/1652.化學和生物化學滲透法

(非機械法)應用：原生質體融合釋放出克隆出的胞內蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物與機械法破碎細胞協同使用從細胞內不同的位置選擇性的釋放蛋白酶法胞溶/2.化學和生物化學滲透法

(非機械法)應用：酶法胞溶/1663.物理滲透法滲透壓沖擊法：

將細胞置于高滲透壓的介質中，使之脫水收縮，達到平衡后，將介質突然稀釋或將細胞轉置于低滲透壓的水或緩沖液中，在滲透壓的作用下，外界的水向細胞內滲透，使細胞變得腫脹，膨脹到一定程度，細胞破裂，它的內含物隨即釋放到溶液中。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/1673.物理滲透法滲透壓沖擊法：

滲透壓沖擊(Osmoticshock)是在各種細胞破碎法中最為溫和的一種，適用于易于破碎的細咆，如動物細胞和革蘭氏陰性菌。物理法/3.物理滲透法滲透壓沖擊法：物理法/1683.物理滲透法凍融法：

將細胞急劇凍結后在室溫緩慢融化，此凍結融化操作反復進行多次，使細胞受到破壞。凍結的作用是破壞細胞膜的疏水鍵結構，增加其親水性和通透性。另一方面，出于胞內水結晶使胞內外產生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細胞膨脹而破裂。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/1693.物理滲透法凍融法：操作：將細胞急劇凍結至-20～-15℃，使之凝固，然后在室溫緩慢融化，此凍結融化操作反復進行多次，使細胞受到破壞。缺點：反復凍融使蛋白質變性，影響活性蛋白質的回收率。凍融法適用于比較脆弱的菌體。物理法/3.物理滲透法凍融法：物理法/1703.物理滲透法干燥法：

將細胞用不同的方法干燥（真空、冷凍、噴霧和氣流等），細胞膜結合水喪失，滲透性發生變化而破裂缺點：條件變化劇烈，易引起生物物質變性物理法/3.物理滲透法干燥法：物理法/171機械破碎法和非機械破碎法的比較比較項目機械法非機械法比較項目機械法非機械法破碎機理切碎細胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片細小碎片較大設備需專用設備不需專用設備內含物釋放全部部分通用性強差粘度高（核酸多）低（核酸少）經濟成本低成本高時間時間短時間長應用范圍實驗室、工業范圍實驗室范圍/機械破碎法和非機械破碎法的比較比較項目機械法非機械法比較項目172破碎技術的選擇原則：目的產物在細胞質中，需機械破碎法目的產物在細胞膜附近，可采用非機械破碎法目的產物與細胞膜或細胞壁結合，可采用兩種方法結合/破碎技術的選擇原則：/173破碎技術的研究發展方向：多種破碎方法結合與上游過程結合1、培養過程控制2、寄主細胞選擇3、克隆噬菌體溶解基因4、耐高溫產品的基因表達與下游結合從后分離過程考察細胞破碎技術/破碎技術的研究發展方向：/174第四節離心沉降與過濾分離技術一、離心沉降㈠沉降基本原理重力沉降：適用于分離較大的顆粒。重力沉降過程中固體顆粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用。當浮力、摩擦阻力和重力達到平衡時，球形固體顆粒勻速沉降。/第四節離心沉降與過濾分離技術一、離心沉降/175㈠沉降基本原理沉降速度：式中：dp—球形粒子直徑，m

ρs—粒子的密度，kg/m3

ρL—介質的密度，kg/m3g—重力加速度，m/s2μL

—流體介質的黏度，Pa·s/㈠沉降基本原理沉降速度：/176離心沉降離心沉降：

依靠慣性離心力的作用而實現的沉降過程。

適于分離兩相密度差較小，顆粒粒度較細的非均相物系。氣固物系：旋風分離器；液固物系：旋液分離器或沉降離心機。/離心沉降離心沉降：177離心沉降離心沉降速度：式中：N—轉鼓轉速，r/minr—球形粒子半徑，mS—沉降系數

ω—轉鼓的旋轉角速度，rad/s/離心沉降離心沉降速度：/178離心沉降從該式可以看出：①當ρs＞ρL，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當ρs=ρL，則S=0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρs＜ρL，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。蛋白質離心沉降時，蛋白質的相對分子質量越大，沉降系數越大，離心沉降速度越大。/離心沉降從該式可以看出：/179㈡離心分離法1.差速離心分離法原理：利用不同粒子在離心力場中沉降的差別(大而重的顆粒沉降最快，最先到達底部)，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分級沉淀。/㈡離心分離法1.差速離心分離法/180操作：一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。優點：操作最簡便，使用最廣泛。缺點：分辨率不高，沉淀系數在同一數量級內的各種粒子不容易分開，常用于粗制品提取。/操作：/1812.區帶離心分離法根據操作條件不同，分為差速區帶離心和平衡區帶離心。3.差速區帶離心分離法在離心前將密度梯度介質(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)裝入離心管內，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部，同梯度液一起離心。/2.區帶離心分離法/182差速區帶離心分離法離心后在近旋轉軸(r1)處的介質密度最小，離旋轉軸最遠(r2)處介質的密度最大，但最大介質密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρs＞ρL。梯度液在離心過程中和離心完畢后，取樣時起著支持介質和穩定劑的作用，避免分層粒子的再混和。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。/差速區帶離心分離法離心后在近旋轉軸(r1)處的介質密度最小，1834.等密度離心分離法在離心前預先配制介質的密度梯度，密度梯度液包含被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，梯度液形成底濃頂稀的密度梯度，原來分布均勻的粒子也發生重新分布。/4.等密度離心分離法/184在管頂處粒子密度大于介質密度，粒子沉降；當管底介質的密度大于粒子密度，粒子上浮；粒子進入它本身的密度位置，粒子不再移動。只要轉速、溫度不變，延長離心時間也不改變粒子的成帶位置。此法應用于物質的大小相近，密度差異較大時。/在管頂處粒子密度大于介質密度，粒子沉降；當管底介質的密度大于185

㈢

Centrifuges離心分離設備/

㈢Centrifuges離心分離設備/186//187

常用的離心機：a、Tubularbowl:管式離心機最簡單，可提供較大離心力；管狀離心機可以冷卻，在蛋白質生產中很有利；懸浮液由管底進，澄清液由管口流出。//188沉降離心機類型

管式離心機特點是轉鼓(管)直徑小、長度大、轉速高、分離效率很高，可以處理顆粒粒徑為0.01mm的懸浮液和難分離的乳濁液。可連續操作，懸浮液或乳濁液由轉鼓下端加入，被轉鼓內的縱向肋板帶動迅速達到與轉鼓同角速度旋轉。在離心力作用下，顆粒或重液層甩向鼓壁由重液出口引出，輕液則從轉鼓中心部位溢出。離心分離因數可達65,000，工業上可用于油水分離，實驗室中可用于分離微生物和蛋白質。管式離心機示意圖/沉降離心機類型管式離心機特點是轉鼓(管)直徑小、長度189Tubularbowl/Tubularbowl/190管壁上沉積物為濃漿*可連續加料至流出物固體損失使離心不能正常進行*須定時拆卸、清洗，這種間斷性操作也是最大的缺點//191SRBA2圓筒式離心機懸浮液沿圓筒的旋轉軸連續加入，通過筒壁上的小孔流出中空柱狀料液的內徑為一常數，不隨料液的加入而改變

濾餅在筒壁上沉積/SRBA2圓筒式離心機懸浮液沿圓筒的旋轉軸連續加入，通過筒192沉降離心機適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細小、密度差不大的體系的分離。離心分離因素達50,000以上的超高速離心機甚至可以使不同分子量的蛋白質分子在具有密度梯度的溶液中分級。沉降離心機工作原理/沉降離心機適用于各種懸浮液或乳濁液、尤其是粒度細小、密度差193沉降離心機類型

碟式離心機(薄層分離沉降離心機)轉鼓內裝有一疊隨轉鼓旋轉的倒錐形碟片，碟片間隙為0.5～1.5m