第二章蛋白質和主要必需

氨基酸的測定第二章蛋白質和主要必需

氨基酸的測定1第一節(jié)概述蛋白質是植物的重要組成成分，也是農產(chǎn)品品質中最重要的成分。它的含量依作物種類、部位、生育時期、品種特性而有變化。植物各部位器官中蛋白質含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆類可達45％-55％，其次是花、葉、莖和根。作物在不同的生育階段根部位吸收的氮，不斷向新生組織輸送，在接近成熟時期，莖葉中的氮向貯存器官輸送，合成的蛋白質集中于種子中。

第一節(jié)概述蛋白質是植物的重要組成成分，也是農產(chǎn)品品質中最重2各種農產(chǎn)品中蛋白質的含量水平（%）

作物蛋白質（干基）作物蛋白質（干基）作物蛋白質（干基）作物蛋白質（干基）菜豆洋扁豆速豌豆蠶豆大豆亞麻向日葵(仁)棉籽(仁)小麥黑麥15.0~30.524.6~34.122.0~34.027.0~35.029.4~50.42.0~30.821.1~30.228.6~42.019.3~30.014.4~24.1大麥燕麥稻米玉米小米(仁)高梁蕎麥(仁)10.6~20.48.0~17.37.8~14.59.0~13.210.2~21.59.5~15.312.8~19.0馬鈴薯冬油菜甜菜蘿卜胡蘿卜洋蔥大蒜菠菜芹菜番茄0.7~2.71.0~1.50.7~1.40.6~1.20.6~1.91.9~2.86.72.31.3~3.60.3~0.8茄辣椒南瓜黃瓜甘藍花椰菜漿果核桃高梁葉高梁莖0.6~1.20.7~1.10.4~1.00.5~0.91.2~2.62.40.3~1.916.1~28.912.4~17.54.0~7.5各種農產(chǎn)品中蛋白質的含量水平（%）作物蛋白質作物蛋白質作物3蛋白質是生命的物質基礎，它的含量是衡量農、畜、水產(chǎn)品品質和營養(yǎng)價值的重要指標。測定植物各部分中蛋白質的含量，對其品質鑒定、品種選育、改善作物生育條件和調節(jié)作物體內新陳代謝和提高蛋白質含量等有重要意義。對產(chǎn)品加工方式及其產(chǎn)品質量有影響。在育種、食品和飼料等工作中常常需要測定蛋白質的含量。

為什么要測定蛋白質？蛋白質是生命的物質基礎，它的含量是衡量農、畜、水產(chǎn)品品質和營4氨基酸是組成蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產(chǎn)物。氨基酸的分析測定是研究蛋白質、酶的化學組成及性質的重要手段。動植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為構成蛋白質的氨基酸和游離的氨基酸兩種。“第一、第二限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，但人類和動物自身無法合成，須從食物中直接吸收。氨基酸的含量是衡量谷物、飼料蛋白質的重要標準之一。為什么要測定氨基酸？氨基酸是組成蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產(chǎn)物。為什么要5蛋白質的分析方法很多，可分為兩類：

(1)利用蛋白質的共性，即含氮量；

(2)利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸(堿)性基團和芳香基團測定蛋白質含量。最常用的方法是開氏（凱氏）法——測定含氮量。粗蛋白質：開氏法測定結果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白質氮，故稱“粗蛋白質”純蛋白質：開氏法測定中，如果蛋白質用重金屬鹽等沉淀分離以后，進行全氮測定，由氮換算而成的蛋白質的含量，則稱為“純蛋白質”。第二節(jié)蛋白質的測定蛋白質的分析方法很多，可分為兩類：第二節(jié)蛋白質的測定6籽粒中粗蛋白質的測定同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)蛋白質測定方法介紹籽粒中粗蛋白質的測定蛋白質測定方法介紹7一、籽粒中粗蛋白質的測定

H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（開氏法）方法原理：植物中的蛋白質含量基本上是不變的。可用開氏法消煮定氮，再將測得的含氮值乘以蛋白質換算系數(shù)，即得粗蛋白質含量。換算系數(shù)：平均6.25——蛋白質平均含氮16%，不同植物籽粒換算系數(shù)見P286表14-2。一、籽粒中粗蛋白質的測定H2SO4-K2SO4-CuS8注意問題籽粒樣品在開氏法分解時，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的。因此，蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，然后用開氏分解測定總氮量，同時用離子電極法測定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質換算系數(shù)即得蛋白質含量。注意問題籽粒樣品在開氏法分解時，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的9開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾(J.Kjeldahl)于1883年用來研究蛋白質變化的，后來被用于測定各種形態(tài)的有機氮。設備簡單易得，結果可靠，為一般實驗室所采用。至今尚無別的方法能與其比擬或將其取代。因此國際谷物化學協(xié)會(ICC)和美國分析化學家協(xié)會(AOAC)以及我國都把開氏法作為標準的分析方法。開氏法介紹開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾(J.Kjeld10開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾于1883年用來研究蛋白質變化的，后來被用于測定各種形態(tài)的有機氮。開氏定氮法：(Kjeldahldetermination)：在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液（硼酸）吸收，再以標準酸滴定，即可計算出樣品中的氮量。開氏法介紹有機氮銨鹽NH3NH4+開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾于1883年用來11新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件12開氏法也有缺點，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費用較高。近年已出現(xiàn)幾種以開氏法原理為基礎的全自動或半自動的開氏定氮儀。瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開氏1030分析儀(KjeltecAuto1030Analyzer)、日本生產(chǎn)的kjel-Auto自動氮和蛋白質分析儀和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Kjel—FOSS自動蛋白質分析儀等。開氏法介紹開氏法也有缺點，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費用13新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件14二、儀器設備消煮爐或電爐消煮管(或開氏瓶)100mL或50mL半微量定氮裝置半微量滴定管二、儀器設備消煮爐或電爐15三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3BO3

(分析純)20g溶于1L水中。每升H3BO3溶液加甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑20mL，并用稀酸或稀堿調節(jié)至紫紅色(pH=4.5)。0.01mol·L

-1(1/2H2SO4)或0.02mol·L

-1

HCl標準溶液。其他試劑同第四章(土壤全氮的測定)。三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3B16(1)樣品的消煮

稱取烘干樣品(過0.25mm篩)0.3000~0.5000g置于50mL或100mL開氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤后，加5mL濃H2SO4，小心輕搖后(最好加塞放置過夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐上，開始時用小火加熱，待消煮液呈棕色時，可提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍色時，再加熱約10min，取下冷卻至溫熱時，將消煮液無損地轉入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后定容并放置澄清。

四、操作步驟(1)樣品的消煮四、操作步驟17新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件18（2）氮的測定用移液管吸取澄清待測液5.00或10.00mL放入半微量定氮儀中進行定氮。同時作空白試驗和核對試驗。

見教材P46四、操作步驟（2）氮的測定見教材P46四、操作步驟19凱氏定氮儀半自動凱氏定氮儀半自動20新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件21氮含量換算成蛋白質的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質平均含氮16%為根據(jù)導出的值，但不同植物籽粒中蛋白質的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質的系數(shù)也稍有不同，P286。以定量蛋白質為目的的總氮量測定中，開氏法分解時，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開氏分解測定總氮量;同時用其他方法測定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質換算系數(shù)即得蛋白質含量。

注意問題氮含量換算成蛋白質的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質平均22本法測定的結果為粗蛋白質的含量。如要測定純蛋白質的含量，則樣品應先用蛋白質沉淀劑堿性硫酸銅、堿性醋酸鉛、200g·L-1~250g·L-1單寧或100g·L-1三氯乙酸等處理，將蛋白質從水溶液中沉淀出來，再測定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質的換算系數(shù)即可得：“純蛋白質”量。注意問題本法測定的結果為粗蛋白質的含量。注意問題23

方法原理

蛋白質中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白質末端自由氨基在pH=2～3的酸性緩沖液體系中呈陽離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質如橘黃G等的陰離子結合，形成不溶于水的蛋白質-染料絡合物而沉淀下來，通過測定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結合量，即每克樣品所結合的染料的毫克數(shù)。二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)方法原理二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC24主要儀器試劑操作步驟結果計算參見教材P286二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)主要儀器二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)25該法是間接測定種子中蛋白質的方法。方法簡單、快速，與開氏法的相關性較好，但準確性較差，適用于大批同類樣品的篩選工作。不適用隨意混合物的樣品的測定。如在篩選同種作物種子的大批樣品時，不必知道蛋白質的絕對含量，只要測定樣品的染料結合量即可進行比較。注意問題該法是間接測定種子中蛋白質的方法。方法簡單、快速，與開氏法26方法原理

蛋白質的肽鍵結構，具有類似于雙縮脲的反應基團。在堿性條件下能與Cu2+生成紫紅色可溶性絡合物，蛋白質含肽鍵多時反應呈紫色，反之肽鍵少時，反應呈紅色。這種顏色反應稱為雙縮脲反應(或稱縮二脲反應)。實驗證明，蛋白質溶液濃度在1-15mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質含量成正比關系。故可用此反應進行蛋白質的測定。三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)方法原理三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)27樣品處理與測定

參見教材P289。三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)樣品處理與測定三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)28適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質測定。一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是堿性硫酸銅水溶液，不適用于種子蛋白質的分析，因為它不穩(wěn)定，而且會浸出有色物質、脂肪及一些淀粉物質，干擾比色測定。而異丙醇雙縮脲試劑，可以減少這些物質的溶解，排除干擾。本法對溫度及時間的要求嚴格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫20-25℃，須于120～190min內比色；40℃為15-70min顯色穩(wěn)定；而在60℃連續(xù)振蕩條件下顯色，則反應時間縮短為5min。注意問題適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質測定。注意問題29第三節(jié)氨基酸的測定氨基酸分析方法包括測定氨基酸的總含量及測定全氨基酸中每種氨基酸的含量兩個方面。測定氨基酸總量的方法與蛋白質分析有密切的關系。許多測定蛋白質含氮含量的方法如開氏定氮法及各種比色法均可用于測定氨基酸的總含量。測定氨基酸總含量的方法還有甲醛滴定法，方法簡單，快速，廣泛應用于實際工作中。

第三節(jié)氨基酸的測定氨基酸分析方法包括測定氨基酸的總含量及測30全氨基酸：色譜法測定。薄層層析色譜法：60年代發(fā)展起來的分析方法，操作簡便，設備簡單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應用于分離和測定氨基酸。氣相色譜法：氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點，儀器的成本也比氨基酸自動分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對映異構物及超微量(ng)樣品中氣相色譜有特殊的作用。氨基酸自動分析儀：應用最廣泛的分析氨基酸的專用儀器。該儀器的基本原理仍然是離子交換柱層析。第三節(jié)氨基酸的測定全氨基酸：色譜法測定。第三節(jié)氨基酸的測定31一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

——氨基酸分析儀法方法原理

氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當流動相(緩沖溶液)推動氨基酸流經(jīng)裝有陽離子交換樹脂的色譜柱時(磺酸型Na+柱)，氨基酸與樹脂中的交換基團進行離子交換，當用不同的pH值的緩沖溶液進行洗脫時，因交換能力的不同而將氨基酸混合物分開，流出色譜柱的氨基酸再與茚三酮在100℃下反應生成紫色物質茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，顯色（570nm）后的氨基酸由光度計檢測。一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

32氨基酸自動分析儀氨基酸自動分析儀33(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。(2)胱氨酸及色氨酸的水解（鹽酸分解過程中破壞，需另行制備）。(3)植物性產(chǎn)品中游離氨基酸試樣的制備。(4)上機測定。操作步驟(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。操作步驟34二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

——染料結合法-DBL法

賴氨酸是一種必須的氨基酸。缺乏賴氨酸，人與動物不僅不能正常發(fā)育，還會引起某些疾病。在絕大多數(shù)谷物中，賴氨酸是最缺乏的氨基酸，被稱為第一限制氨基酸。對人體的作用：1．提高智力、促進生長、增強體質。2．增進食欲、改善營養(yǎng)不良狀況。3．改善失眠，提高記憶力。4．幫助產(chǎn)生抗體、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。5．幫助鈣的吸收，治療防止骨質疏松癥6．降低血中甘油三酯的水平，預防心腦血管疾病的產(chǎn)生。二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

35賴氨酸在谷物貯存、加工過程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質而破壞，變成營養(yǎng)上的“無效”。測定方法：2,4,6—三硝基苯磺酸(TNBS法)、1-氟-2,4-二硝基苯法(FDNB法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法(CNPY法)等。這類方法操作手續(xù)繁長費時，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。染料結合法-DBL法：國內外應用較廣泛的、簡便易行。二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

——染料結合法-DBL法賴氨酸在谷物貯存、加工過程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧36原理：染料結合法可用于測定樣品中蛋白質的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的-NH2的酰基掩蔽，使其失去和染料結合的能力。然后分別測定酰化前后的染料結合量DBC值：酰化前的測定值為賴氨酸+組氨酸+精氨酸。而酰化后只是組氨酸+精氨酸，以上兩項測定結果的差值，就可計算之賴氨酸的含量。

二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

——染料結合法-DBL法原理：染料結合法可用于測定樣品中蛋白質的堿性氨基酸，37樣品處理：稱取已粉碎過60目篩酰化和不酰化樣品各兩份，重量見下表。分別加30～35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的試管中，標明為A、B管(酰化樣品)和C、D管(不酰化樣品)。同時應另稱樣品測定水分含量。樣品種類稱樣量（mg）酰化樣品不酰化樣品水稻麥類普通玉米高賴氨酸玉米高梁谷子大豆其它豆類花生仁向日葵子棉子700或800500800700或5001000900180275300200125500或600400600400或50070070010017520015090樣品處理：稱取已粉碎過60目篩酰化和不酰化樣品各兩份，重量見38色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人與動物的新陳代謝中起著重要的作用，某些代謝產(chǎn)物對人類的大腦功能及生長發(fā)育影響很大，公認為“第二限制性氨基酸”。預防糙皮病：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類缺乏色氨酸會患糙皮病（皮炎），常食玉米會發(fā)生。調節(jié)情緒：色氨酸是腦部化學物質5-羥色胺的重要前體，能幫助調節(jié)情緒。

改善睡眠：色氨酸生成的5-羥色胺，能改變睡眠持續(xù)時間。三、谷物和飼料中色氨酸的測定

——乙醛酸法色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人與動物的新陳代謝中起著重39在我們所吃的食物中，每100克食物色氨酸含量較高的有：海蟹（含801毫克）豆腐皮（含715毫克）肉松（含710毫克）生西瓜子（含631毫克）黃豆（含485毫克）黑芝麻（含402毫克）全脂奶粉（含372毫克）生葵花子（含365毫克）。

三、谷物和飼料中色氨酸的測定

——乙醛酸法在我們所吃的食物中，每100克食物色氨酸含量較高的有：海蟹（40目前提出的測定方法很多，歸結起來有三類：一是找出一種理想的水解方法，使色氨酸和其它的氨基酸一樣，且用離子交換色譜進行測定；二是暴露具有反應活性的吲哚環(huán)，然后與某些試劑反應生成帶色化合物，進行比色測定；三是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰，對色氨酸進行分光光度或熒光測定。其中乙醛酸法具有簡單、快速的特點。三、谷物和飼料中色氨酸的測定

——乙醛酸法目前提出的測定方法很多，歸結起來有三類：三、谷物和飼料中色氨41方法原理谷物中蛋白質經(jīng)木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在濃硫酸存在的情況下，F(xiàn)e3+可將乙酸氧化為乙醛酸，2mol色氨酸能與1mol乙醛酸縮合，產(chǎn)生hopkins-cole反應，生成紅紫色的化合物，其紅紫色的強度與色氨酸的含量在一定范圍內成正比，其最大的吸收峰在545nm，進行比色測定。三、谷物和飼料中色氨酸的測定

——乙醛酸法Fe3+混合顯色劑方法原理谷物中蛋白質經(jīng)木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在濃硫42主要儀器試劑操作步驟結果計算注意事項

見教材P298三、谷物和飼料中色氨酸的測定

——乙醛酸法主要儀器三、谷物和飼料中色氨酸的測定

43思考題1.什么是粗蛋白質？如何測得純蛋白質的含量？2.主要農作物的蛋白質換算系數(shù)是多少，為什么不同作物的籽粒其蛋白質換算系數(shù)會有差異？3.含硝態(tài)氮高的樣品，如何測定其蛋白質含量？4.為什么染料結合法、雙縮脲法能用于測定蛋白質含量？其方法原理，適用范圍是什么？為什么它們都不能直接測得蛋白質的含量？5.氨基酸含量測定有哪些方法？思考題1.什么是粗蛋白質？如何測得純蛋白質的含量？44第二章蛋白質和主要必需

氨基酸的測定第二章蛋白質和主要必需

氨基酸的測定45第一節(jié)概述蛋白質是植物的重要組成成分，也是農產(chǎn)品品質中最重要的成分。它的含量依作物種類、部位、生育時期、品種特性而有變化。植物各部位器官中蛋白質含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆類可達45％-55％，其次是花、葉、莖和根。作物在不同的生育階段根部位吸收的氮，不斷向新生組織輸送，在接近成熟時期，莖葉中的氮向貯存器官輸送，合成的蛋白質集中于種子中。

第一節(jié)概述蛋白質是植物的重要組成成分，也是農產(chǎn)品品質中最重46各種農產(chǎn)品中蛋白質的含量水平（%）

作物蛋白質（干基）作物蛋白質（干基）作物蛋白質（干基）作物蛋白質（干基）菜豆洋扁豆速豌豆蠶豆大豆亞麻向日葵(仁)棉籽(仁)小麥黑麥15.0~30.524.6~34.122.0~34.027.0~35.029.4~50.42.0~30.821.1~30.228.6~42.019.3~30.014.4~24.1大麥燕麥稻米玉米小米(仁)高梁蕎麥(仁)10.6~20.48.0~17.37.8~14.59.0~13.210.2~21.59.5~15.312.8~19.0馬鈴薯冬油菜甜菜蘿卜胡蘿卜洋蔥大蒜菠菜芹菜番茄0.7~2.71.0~1.50.7~1.40.6~1.20.6~1.91.9~2.86.72.31.3~3.60.3~0.8茄辣椒南瓜黃瓜甘藍花椰菜漿果核桃高梁葉高梁莖0.6~1.20.7~1.10.4~1.00.5~0.91.2~2.62.40.3~1.916.1~28.912.4~17.54.0~7.5各種農產(chǎn)品中蛋白質的含量水平（%）作物蛋白質作物蛋白質作物47蛋白質是生命的物質基礎，它的含量是衡量農、畜、水產(chǎn)品品質和營養(yǎng)價值的重要指標。測定植物各部分中蛋白質的含量，對其品質鑒定、品種選育、改善作物生育條件和調節(jié)作物體內新陳代謝和提高蛋白質含量等有重要意義。對產(chǎn)品加工方式及其產(chǎn)品質量有影響。在育種、食品和飼料等工作中常常需要測定蛋白質的含量。

為什么要測定蛋白質？蛋白質是生命的物質基礎，它的含量是衡量農、畜、水產(chǎn)品品質和營48氨基酸是組成蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產(chǎn)物。氨基酸的分析測定是研究蛋白質、酶的化學組成及性質的重要手段。動植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為構成蛋白質的氨基酸和游離的氨基酸兩種。“第一、第二限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，但人類和動物自身無法合成，須從食物中直接吸收。氨基酸的含量是衡量谷物、飼料蛋白質的重要標準之一。為什么要測定氨基酸？氨基酸是組成蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產(chǎn)物。為什么要49蛋白質的分析方法很多，可分為兩類：

(1)利用蛋白質的共性，即含氮量；

(2)利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸(堿)性基團和芳香基團測定蛋白質含量。最常用的方法是開氏（凱氏）法——測定含氮量。粗蛋白質：開氏法測定結果中因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白質氮，故稱“粗蛋白質”純蛋白質：開氏法測定中，如果蛋白質用重金屬鹽等沉淀分離以后，進行全氮測定，由氮換算而成的蛋白質的含量，則稱為“純蛋白質”。第二節(jié)蛋白質的測定蛋白質的分析方法很多，可分為兩類：第二節(jié)蛋白質的測定50籽粒中粗蛋白質的測定同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)蛋白質測定方法介紹籽粒中粗蛋白質的測定蛋白質測定方法介紹51一、籽粒中粗蛋白質的測定

H2SO4-K2SO4-CuSO4-Se消煮法（開氏法）方法原理：植物中的蛋白質含量基本上是不變的。可用開氏法消煮定氮，再將測得的含氮值乘以蛋白質換算系數(shù)，即得粗蛋白質含量。換算系數(shù)：平均6.25——蛋白質平均含氮16%，不同植物籽粒換算系數(shù)見P286表14-2。一、籽粒中粗蛋白質的測定H2SO4-K2SO4-CuS52注意問題籽粒樣品在開氏法分解時，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的。因此，蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，然后用開氏分解測定總氮量，同時用離子電極法測定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質換算系數(shù)即得蛋白質含量。注意問題籽粒樣品在開氏法分解時，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的53開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾(J.Kjeldahl)于1883年用來研究蛋白質變化的，后來被用于測定各種形態(tài)的有機氮。設備簡單易得，結果可靠，為一般實驗室所采用。至今尚無別的方法能與其比擬或將其取代。因此國際谷物化學協(xié)會(ICC)和美國分析化學家協(xié)會(AOAC)以及我國都把開氏法作為標準的分析方法。開氏法介紹開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾(J.Kjeld54開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾于1883年用來研究蛋白質變化的，后來被用于測定各種形態(tài)的有機氮。開氏定氮法：(Kjeldahldetermination)：在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液（硼酸）吸收，再以標準酸滴定，即可計算出樣品中的氮量。開氏法介紹有機氮銨鹽NH3NH4+開氏法是測定全氮量的經(jīng)典方法，是丹麥人開道爾于1883年用來55新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件56開氏法也有缺點，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費用較高。近年已出現(xiàn)幾種以開氏法原理為基礎的全自動或半自動的開氏定氮儀。瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開氏1030分析儀(KjeltecAuto1030Analyzer)、日本生產(chǎn)的kjel-Auto自動氮和蛋白質分析儀和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的Kjel—FOSS自動蛋白質分析儀等。開氏法介紹開氏法也有缺點，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費用57新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件58二、儀器設備消煮爐或電爐消煮管(或開氏瓶)100mL或50mL半微量定氮裝置半微量滴定管二、儀器設備消煮爐或電爐59三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3BO3

(分析純)20g溶于1L水中。每升H3BO3溶液加甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑20mL，并用稀酸或稀堿調節(jié)至紫紅色(pH=4.5)。0.01mol·L

-1(1/2H2SO4)或0.02mol·L

-1

HCl標準溶液。其他試劑同第四章(土壤全氮的測定)。三、試劑20g·L-1

H3BO3—指示劑溶液：稱取H3B60(1)樣品的消煮

稱取烘干樣品(過0.25mm篩)0.3000~0.5000g置于50mL或100mL開氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑1.8g，加幾滴水濕潤后，加5mL濃H2SO4，小心輕搖后(最好加塞放置過夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐上，開始時用小火加熱，待消煮液呈棕色時，可提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍色時，再加熱約10min，取下冷卻至溫熱時，將消煮液無損地轉入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后定容并放置澄清。

四、操作步驟(1)樣品的消煮四、操作步驟61新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件62（2）氮的測定用移液管吸取澄清待測液5.00或10.00mL放入半微量定氮儀中進行定氮。同時作空白試驗和核對試驗。

見教材P46四、操作步驟（2）氮的測定見教材P46四、操作步驟63凱氏定氮儀半自動凱氏定氮儀半自動64新編-第2章蛋白質和主要必需氨基酸的測定課件65氮含量換算成蛋白質的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質平均含氮16%為根據(jù)導出的值，但不同植物籽粒中蛋白質的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質的系數(shù)也稍有不同，P286。以定量蛋白質為目的的總氮量測定中，開氏法分解時，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開氏分解測定總氮量;同時用其他方法測定硝態(tài)氮的含量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質換算系數(shù)即得蛋白質含量。

注意問題氮含量換算成蛋白質的系數(shù)，一般采用6.25，這是由蛋白質平均66本法測定的結果為粗蛋白質的含量。如要測定純蛋白質的含量，則樣品應先用蛋白質沉淀劑堿性硫酸銅、堿性醋酸鉛、200g·L-1~250g·L-1單寧或100g·L-1三氯乙酸等處理，將蛋白質從水溶液中沉淀出來，再測定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質的換算系數(shù)即可得：“純蛋白質”量。注意問題本法測定的結果為粗蛋白質的含量。注意問題67

方法原理

蛋白質中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)的-NH2、咪唑基和胍基以及蛋白質末端自由氨基在pH=2～3的酸性緩沖液體系中呈陽離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質如橘黃G等的陰離子結合，形成不溶于水的蛋白質-染料絡合物而沉淀下來，通過測定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應前后溶液中染料濃度的變化，可計算出樣品的染料結合量，即每克樣品所結合的染料的毫克數(shù)。二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)方法原理二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC68主要儀器試劑操作步驟結果計算參見教材P286二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)主要儀器二、同類種子中蛋白質的測定(染料結合-DBC法)69該法是間接測定種子中蛋白質的方法。方法簡單、快速，與開氏法的相關性較好，但準確性較差，適用于大批同類樣品的篩選工作。不適用隨意混合物的樣品的測定。如在篩選同種作物種子的大批樣品時，不必知道蛋白質的絕對含量，只要測定樣品的染料結合量即可進行比較。注意問題該法是間接測定種子中蛋白質的方法。方法簡單、快速，與開氏法70方法原理

蛋白質的肽鍵結構，具有類似于雙縮脲的反應基團。在堿性條件下能與Cu2+生成紫紅色可溶性絡合物，蛋白質含肽鍵多時反應呈紫色，反之肽鍵少時，反應呈紅色。這種顏色反應稱為雙縮脲反應(或稱縮二脲反應)。實驗證明，蛋白質溶液濃度在1-15mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質含量成正比關系。故可用此反應進行蛋白質的測定。三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)方法原理三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)71樣品處理與測定

參見教材P289。三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)樣品處理與測定三、同類種子中蛋白質的測定(雙縮脲法)72適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質測定。一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是堿性硫酸銅水溶液，不適用于種子蛋白質的分析，因為它不穩(wěn)定，而且會浸出有色物質、脂肪及一些淀粉物質，干擾比色測定。而異丙醇雙縮脲試劑，可以減少這些物質的溶解，排除干擾。本法對溫度及時間的要求嚴格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫20-25℃，須于120～190min內比色；40℃為15-70min顯色穩(wěn)定；而在60℃連續(xù)振蕩條件下顯色，則反應時間縮短為5min。注意問題適用于大批品種篩選、育種等工作中的蛋白質測定。注意問題73第三節(jié)氨基酸的測定氨基酸分析方法包括測定氨基酸的總含量及測定全氨基酸中每種氨基酸的含量兩個方面。測定氨基酸總量的方法與蛋白質分析有密切的關系。許多測定蛋白質含氮含量的方法如開氏定氮法及各種比色法均可用于測定氨基酸的總含量。測定氨基酸總含量的方法還有甲醛滴定法，方法簡單，快速，廣泛應用于實際工作中。

第三節(jié)氨基酸的測定氨基酸分析方法包括測定氨基酸的總含量及測74全氨基酸：色譜法測定。薄層層析色譜法：60年代發(fā)展起來的分析方法，操作簡便，設備簡單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應用于分離和測定氨基酸。氣相色譜法：氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點，儀器的成本也比氨基酸自動分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對映異構物及超微量(ng)樣品中氣相色譜有特殊的作用。氨基酸自動分析儀：應用最廣泛的分析氨基酸的專用儀器。該儀器的基本原理仍然是離子交換柱層析。第三節(jié)氨基酸的測定全氨基酸：色譜法測定。第三節(jié)氨基酸的測定75一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

——氨基酸分析儀法方法原理

氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當流動相(緩沖溶液)推動氨基酸流經(jīng)裝有陽離子交換樹脂的色譜柱時(磺酸型Na+柱)，氨基酸與樹脂中的交換基團進行離子交換，當用不同的pH值的緩沖溶液進行洗脫時，因交換能力的不同而將氨基酸混合物分開，流出色譜柱的氨基酸再與茚三酮在100℃下反應生成紫色物質茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，顯色（570nm）后的氨基酸由光度計檢測。一、全氨基酸和游離氨基酸的分析

76氨基酸自動分析儀氨基酸自動分析儀77(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。(2)胱氨酸及色氨酸的水解（鹽酸分解過程中破壞，需另行制備）。(3)植物性產(chǎn)品中游離氨基酸試樣的制備。(4)上機測定。操作步驟(1)全氨基酸試樣的制備（鹽酸水解）。操作步驟78二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

——染料結合法-DBL法

賴氨酸是一種必須的氨基酸。缺乏賴氨酸，人與動物不僅不能正常發(fā)育，還會引起某些疾病。在絕大多數(shù)谷物中，賴氨酸是最缺乏的氨基酸，被稱為第一限制氨基酸。對人體的作用：1．提高智力、促進生長、增強體質。2．增進食欲、改善營養(yǎng)不良狀況。3．改善失眠，提高記憶力。4．幫助產(chǎn)生抗體、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。5．幫助鈣的吸收，治療防止骨質疏松癥6．降低血中甘油三酯的水平，預防心腦血管疾病的產(chǎn)生。二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

79賴氨酸在谷物貯存、加工過程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質而破壞，變成營養(yǎng)上的“無效”。測定方法：2,4,6—三硝基苯磺酸(TNBS法)、1-氟-2,4-二硝基苯法(FDNB法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法(CNPY法)等。這類方法操作手續(xù)繁長費時，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。染料結合法-DBL法：國內外應用較廣泛的、簡便易行。二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

——染料結合法-DBL法賴氨酸在谷物貯存、加工過程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧80原理：染料結合法可用于測定樣品中蛋白質的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的-NH2的酰基掩蔽，使其失去和染料結合的能力。然后分別測定酰化前后的染料結合量DBC值：酰化前的測定值為賴氨酸+組氨酸+精氨酸。而酰化后只是組氨酸+精氨酸，以上兩項測定結果的差值，就可計算之賴氨酸的含量。

二、谷物和飼料中賴氨酸的測定

——染料結合法-DBL法原理：染料結合法可用于測定樣