DEAOU畫奧生物“PCR分子實驗室污染分析及解決對策聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種體外核酸擴增技術(shù)，它具有特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，能在幾個小時內(nèi)完成從一塊組織、一根毛發(fā)，甚至一個細胞中擴增出足量的目的產(chǎn)物供分析研究和檢測鑒定，所以，近年來PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于人和動物的多種傳染病早期診斷和食品/飼料中特定成分的檢測。PCR反應(yīng)雖然具有較強擴增能力和極高的靈敏性等優(yōu)點，但是也存在一個令人頭痛的問題——易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的結(jié)果。如果形成氣溶膠污染擴散，則可引起整個PCR實驗室的污染，處理起來非常棘手，嚴重的甚至要關(guān)閉實驗室。一、污染種類PCR實驗室污染主要是下面三個方面：（一）標(biāo)本間交叉污染：主要是在采（取）樣的過程中，由于取樣工具之間的交叉造成污染；或者在核酸提取的過程中，由于移液器、離心管等使用不當(dāng)導(dǎo)致的污染。（二）PCR試劑的污染：主要是在PCR試劑配制過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。（三）PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般為lOl^opies/mL）,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。二、污染的監(jiān)測一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染，是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、對照試驗①陰性質(zhì)控對照a）提取空白對照：核酸提取過程中不加樣品的空白管；b）PCR試劑對照：不含DNA/cDNA模板的PCR擴增反應(yīng)液試劑；c）陰性目標(biāo)DNA對照：即為內(nèi)源基因?qū)φ眨遣缓庠茨繕?biāo)核酸序列片段的模板。可使DEAOU畫奧生物用陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并與測試樣品等同處理進行核酸提取及PCR擴增。②陽性質(zhì)控對照a）弱陽性對照：使用已知的弱陽性樣品作為陽性質(zhì)控樣品，并與測試樣品等同處理進行核酸提取及PCR擴增；b）陽性目標(biāo)DNA對照：使用含有目標(biāo)DNA/RNA序列片段的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和（或）質(zhì)粒。2、重復(fù)性試驗為了避免實驗結(jié)果的偶然性，需要設(shè)置平行實驗，必要時可以對所做實驗在同樣條件下進行足夠次數(shù)的重復(fù)。三、防止污染的方法進行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程,最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。（一）人員：轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室的人員要按照嚴格的培訓(xùn)流程進行培訓(xùn)與考核，實驗室操作人員應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。（二）劃分操作區(qū)：PCR分子實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析室。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑準(zhǔn)備區(qū)樣品制備區(qū)PCR擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他工作區(qū)，工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。四、實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：在檢測過程中，所有試劑都要往自己的正前方放置，切不可從敞開口的試劑上方經(jīng)過；穿戴一次性手套，若在操作過程中不慎濺上溶液，應(yīng)立即更換手套；采（取）樣品的工具和容器最好使用一次性的，如重復(fù)使用，應(yīng)在使用前應(yīng)于10的高溫下干烤6小時以上或者于0.5%的次氯酸鈉溶液中浸泡過夜；樣品存放時要密封嚴實，以防外溢造成相互間的交叉污染；使用鑷子夾用離心管或DNA吸附柱，不能直接用手拿取，注意不要碰觸離心管內(nèi)蓋和吸附柱下端的開口處；DEAOU畫奧生物“在核酸提取時，可增加空白提取對照或陰性樣本提取對照，對核酸提取過程和實驗環(huán)境進行控制；操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，減小誤差，增加反應(yīng)的精確度；在加入模板時，應(yīng)該按照“陰性對照-待測樣品-陽性對照”的加樣順序，操作上應(yīng)遵循“開管蓋-加模板-蓋管蓋”的原則，保證管與管之間不會交叉污染；移液器污染也是一個值得注意的問題。由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內(nèi)或粘上吸頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取時要十分小心，吸時要慢，吸取盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染；實驗室要注意通風(fēng)透