T/CSMAXXXX－2018草豆蔻種子超低溫保存技術規程范圍本標準規定了草豆蔻（AlpiniakatsumadaiHayata）種子超低溫保存過程中的術語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復培養等技術要求。本標準適用于草豆蔻種子的超低溫長期貯藏。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農作物種子檢驗規程水分測定術語和定義下列術語和定義適用于本文件。草豆蔻AlpiniakatsumadaiHayata為姜科（Zingiberaceae）山姜屬（AlpiniaRoxb.）植物，株高達3m，葉片線狀披針形，總狀花序頂生。其干燥近成熟種子性辛、溫，歸脾、胃經，具有燥濕行氣，溫中止嘔的功效。常用于治療寒濕內阻，脘腹脹滿冷痛。收載于《中國藥典（2015）》。草豆蔻果實AlpiniakatsumadaiHayatafruits果實為蒴果，圓球形，直徑約3.5~4cm，外面密生粗毛。內有類球形的種子團，直徑1.5~2.7cm，表面灰褐色，中間有黃白色的隔膜，將種子團分成3瓣，每瓣有種子多數，粘連緊密，種子團略光滑。草豆蔻種子AlpiniakatsumadaiHayataseeds草豆蔻的繁殖材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子表面灰棕色或淺褐色，卵圓狀多面體，長3~5mm，直徑約3mm，外被1層白色透明膜質假種皮，種脊為一條縱溝，一端有種臍；質硬，將種子沿種脊縱剖兩瓣，縱斷面觀呈斜心形，種皮沿種脊向內伸入部分約占整個表面積的1/2；胚乳灰白色。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經過前處理的草豆蔻種子置于液氮（-196℃）中保存。種子前處理果實采收5月至8月，果皮呈金黃色時，即可采收，去除果肉，取出種子洗凈。種子選擇挑選發育飽滿、完整、健康的種子為保存材料，置于10℃種子低溫低濕儲藏柜中保存備用（存放時間不超過6個月）。種子前處理生活力檢測參照《植物生理學實驗指導》中的溴麝香草酚藍（BTB）法測定草豆蔻種子生活力。待測種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子20粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將含胚部分埋入凝膠中。將培養皿置于35℃溫箱中4h后觀察結果。生活力計算在光下用放大鏡對染色結果進行觀察鑒定。凡種胚周圍出現黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數/總的種子數×100%待保存的草豆蔻種子生活力應≥70%。含水量范圍用尼龍網袋包裹草豆蔻種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內，硅膠與種子的體積比為55000:1，室溫條件下干燥處理4~18h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由18%~25%降至11%~16%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量草豆蔻種子保存量不少于500粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式草豆蔻種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的草豆蔻種子放入2mL凍存管（每管50粒種子）中，迅速投入液氮中保存?；謴团囵B種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測取出25粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進行超低溫保存后的初始生活力檢測。當種子生活力≥50%時視為保存成功?；謴团囵B將25粒解凍后的草豆蔻種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發芽盒中，溫度25℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養。草豆蔻種子出芽周期大概10～40d。附錄BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.1g，溶解于煮沸過的100mL純水中，然后用濾紙去殘渣。濾液若呈黃色，可加數滴氫氧化鈉溶液，使之變為藍色或藍綠色，此液長期貯存于棕色瓶中。1.5%BTB瓊脂凝膠：稱量0.1%BTB溶液40mL置于燒杯中，稱取0.5g瓊脂，將其剪碎后加入杯中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。參考文獻[1]中國植物志委員會.《中國植物志》第16（2）卷[M].科學出版社.2004（1991）：091[2]WuTe-lin.KaiLarsen.Zingiberaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2000.24:322-377.[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].XX，中國醫藥科技出版社，2015，238-239[4]傅家瑞，宋松泉.頑拗性種子生物學[M].中國科學文化出版社，2004:1[5]ReedBM.Pl