醫學微生物學實驗指導醫學微生物學實驗指導醫學微生物學實驗指導xxx公司醫學微生物學實驗指導文件編號：文件日期：修訂次數：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度醫學微生物學實驗指導西安交通大學醫學院微生物學教研室第一次實驗課內容實驗內容1.實驗目的與要求實驗內容2.實驗室規則實驗內容3.細菌形態學觀察技術實驗內容4.染色標本的制備—革藍染色實驗目的與要求醫學微生物學實驗課是該專業課程的重要組成部分，指導學生上好實驗課是教學過程中的重要環節，學習實驗課的目的是：1.使學生加深理解并鞏固理論知識，學習和掌握有關的實驗操作技術，為以后的醫學專業課學習打好基礎：2.在實驗中，培養學生觀察、思考和分析問題的能力，主動參與實驗的動手能力及獨立工作的能力。訓練學生嚴格的科學作風、嚴肅白的科學態度和嚴密的工作方法。3.培養學生在集體工作環境中互幫互讓，團結協作，共同完成好實驗的精神品德。為了達到上述目的，提高實驗課的教學效果，特提出以下要求：1.實驗課前做好預習，明確本次實驗課的內容及其原理、方法及注意事項；2.實驗中要仔細認真，注意分工與協作，操作實驗要按操作步驟進行。學會正確操作手法、準確記錄實驗結果。示教實驗要注意觀察，并記錄好相關內容；3.詳細討論實驗結果，提倡同學之間互幫互學，并緊密聯系理論課內容。要注意不論實驗結果與理論符合與否，都有討論的價值，并分析其原因，有可能的話還應重復實驗；4.嚴格遵守實驗室規則，在微生物學實驗課上，要樹立“有菌觀點”，嚴格掌握和不斷完善無菌操作技術。

實驗室規則一、進入實驗室須穿工作服、戴工作帽。除必要的書籍文具外，其它個人物品一律不得帶入實驗室。二、在實驗室內，禁止飲食、吸煙及與學習無關的其它活動，不得大聲喧嘩或嘻戲。三、未經老師許可，不得擅自搬動實驗器材及示教物品，不準隨意擺弄和旋轉實驗儀器上的開關及旋扭等。四、按照實驗要求，在老師的指導下，主動安排要進行的實驗，認真進行實驗操作，嚴格遵守無菌操作規程，爭取順利地完成實驗。五、實驗中使用完畢的器材和試劑，必須放回規定的位置。廢棄物必須按規定進行處理或歸放于指定的容器內，不能隨便亂丟亂放。六、實驗中萬一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情況，應及時報告老師進行處理，切勿自作主張不按規定處理。七、愛護實驗室內一切設備、掛圖、儀器。注意節約使用消耗材料及藥品試劑，注意用電安全及節約水電。八、實驗結束，要清理桌面，將實驗器材放回原處。值日同學要搞好實驗室的清潔衛生，保持室內整齊，離開實驗室前要關好門窗、水、電，并將手洗干凈。九、未經許可，不得將實驗室內任何物品帶出實驗室。

實驗一細菌形態學觀察技術將細菌培養物或含菌標本材料制備的染色標本片，置顯微鏡油鏡頭下，可以觀察到細菌的形狀、大小、結構、排列及染色特性等，了解這些特征有助于鑒別各種細菌。一、顯微鏡油鏡頭的使用與保護【使用原理】用油鏡觀察標本、是在使用高倍鏡的基礎上，采用同玻璃折光率相似的油狀物（如香柏油、液體石臘等），滴加在標本與油鏡頭中間，以避免光線散射，提高顯微鏡的清晰度和分辨能力。使觀察物象更加清楚明了。【操作方法】1.調試：打開電源，先采用低倍鏡，使視野達到清晰光亮。2.加油：雙手向上轉動粗螺旋，使鏡筒上升，將標本片固定于載物臺上，使染色面對準集光器央，加鏡油于標本面，調換油鏡頭對準標本面。3.調焦點：用左手向下輕轉粗螺旋，使鏡筒下降，同時眼睛從右側觀察下降程度，待鏡頭入油后接觸上玻片，用眼觀目鏡，反轉粗螺旋，使鏡筒慢慢上升，待看到模糊物象時，改用細螺旋上下調節，使物像達到完全清晰為宜（一般轉動細調節前后半圈）。4.觀察：觀察時只使用細調。需改換視野時，右手操縱推進器，左手轉動細螺旋，做到配合自如。并養成左眼觀察，右眼繪圖的習慣。【油鏡頭的保護】油鏡頭使用完結后，必須用擦鏡紙滴加少量二甲苯將油擦洗干凈（二甲苯用量宜少，以免鏡片間粘膠溶解）。下降集光器，半接物鏡轉成“八”字，再下降鏡筒，輕觸鏡臺表面，雙手平持顯微放入鏡箱，避免直射日光，置于干燥處，以防受潮。【注意事項】1.使用直筒顯微鏡觀察標本時，必須兩眼同時睜開，訓練使用左眼觀察，右眼繪圖。如用油鏡頭觀察，勿將鏡身歪斜，避免鏡油流出片面。2.觀察染色標本時，光線宜強，可上升集光器，開大光圈。觀察不染色標本時，光源宜弱，可下降集光器，縮小光圈。3.使用完畢，一定擦去鏡油。二、細菌不染色標本不染色的細菌和標本鏡檢，雖可觀察細菌在自然生活狀態下的大小、形態、活動等，但主要用于觀察細菌的動力。（一）懸滴法【材料】1.細菌：枯草桿菌8~12小時肉湯培養物。2.凹玻片，蓋玻片，凡士林等。【方法】1.取凹玻片一張，于凹窩周圍涂少許凡士林（見圖1）。圖1懸滴法2.用接種環沾取枯草桿菌8~12小時培養物，置于蓋玻片中央。3.反轉凹玻片，使凹窩對準蓋玻片中央，蓋于其上，輕壓后，迅速翻轉玻片，使蓋破片面向上。4.標本片置于顯微鏡載物臺上，先用弱光線，低倍鏡找物象，再改換高倍鏡觀察，密切注意，勿壓破蓋玻片。5.觀察：細菌在鏡下為灰色半透明體，并呈現真運動，如在明亮的海洋中，深入淺出游來動去。（二）壓滴法用途同懸滴法。【材料】1.細菌：枯草桿菌8~12小時肉湯培養物。2.載物玻片：蓋玻片等。【方法】1.取無油污物玻片1張。2.用接種環沾取枯草桿菌8~12小時肉湯培養物置于載物玻片中央。3.加蓋玻片于菌液表面，觀察方法同懸滴法。三、細菌染色標本片的制備（操作）由于細菌個體微小，基本上無色透明，故將其用適當染料染色觀察，方能顯示它的形態、大小、構造及染色特性等，在細菌和鑒別上有重要意義。【材料】1.葡萄球菌大腸桿菌18~24小時普通瓊脂斜面培養物。2.革蘭染色液。3.生理鹽水，載物玻片，接種環等。【方法】（一）細菌涂片的制作1.涂片：取清潔無油污載物玻片一張，接種環沾取生理鹽水1~2環置于玻片中央，再將接種環火焰滅菌待冷后，沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌苔少許，混于生理鹽水中，輕輕涂成均勻薄膜。2.干燥：室溫自然干燥，也可將涂面向上，遠離火焰上方微加溫干燥（切勿加熱過度，以防將標本燒枯）。3.固定：標本干燥后，通過酒精燈火焰三次（約2~3秒鐘），以殺死細菌并使之固定于玻片上。4.染色：可根據不同的染色要求，用相應染色液進行染色。（二）革蘭染色法：涂片的制備方法同前，革蘭染色方法可分為四步。1.初染：于涂抹面上滴加結晶紫染液數滴，覆蓋整個涂面，室溫作用一分鐘。用自來水輕輕沖洗，甩干水分。2.媒染：滴加魯戈碘液，室溫作用一分鐘，自來水沖洗，甩干水分。3.脫色：將載物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，邊提邊看，見涂面無色素下流為止（約30秒鐘）。自來水沖洗，甩干水分。4.復染：加稀釋復紅染液染30秒鐘，自來水沖洗，吸水紙吸干玻片水分。5.加油鏡檢：染色片待干后，于油鏡下，調強光視野觀察，呈紫色的為革蘭陽性菌，呈紅色的為革蘭陰性菌。（三）美蘭染色法【方法】將涂片固定滴加美蘭染液于玻片上，染1~2分鐘，水洗、待干、鏡檢。【結果】此法為單染色法，菌體和細胞均染成藍色。常用于腦膜炎球菌及白喉桿菌等細菌染色。四、細菌基本形態和特殊結構觀察（一）基本形態（示教）1.球形：葡萄球菌革蘭染色標本片——菌體正園形，染成蘭紫色，呈現葡萄串狀排列。G+球菌。2.桿形：大腸桿菌革蘭染色標本片——菌體短桿狀，染成紅色，呈分散排列。G-桿菌。3.螺形：霍亂弧菌革蘭染色標本片——菌體弧形，染成紅色，呈分散排列。G-弧菌。（二）特殊結構示教1.鞭毛：傷寒桿菌鞭毛染色片——菌體較粗大桿狀，染成蘭灰色，單個或成堆存在，周圍可見到波浪狀彎曲、較長、呈蘭灰色的鞭毛。2．莢膜：肺炎雙球菌莢膜染色片——視野背景為紅色，其中可見到染色呈深紅色，矛頭狀菌體，縱向成雙排列，菌體周圍有未染上顏色的空白區，即莢膜。3.芽胞：破傷風梭菌芽胞染色片——菌體為細長桿狀，頂端有染成紅色、并大于菌體的球狀物即芽胞，呈“鼓槌狀”，其他散亂分布的紅色球體，為菌體脫落的成熟芽胞。《附錄》革蘭（Gram）染液的配制1.結晶紫染液將1份結晶紫酒精飽和液與4份1%草酸銨水溶液混合即成（14克結晶紫加95%酒精100毫升即為酒精飽和溶液）。2.魯戈（Lugol）碘液碘1克碘化鉀2克蒸餾水300毫升3.稀釋復紅液1份鹼性復紅飽和液（鹼性復紅3.2克溶于95%酒精100毫升中。即為鹼性復紅飽和溶液）加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸復紅染液（抗酸染色用），取1份石炭酸復紅染液加9份蒸餾水即為稀釋復紅染液。第二次實驗實驗內容1；細菌培養技術（操作）實驗內容2；細菌的生化反應檢測（示教）實驗內容3：播放錄象—《細菌感染的檢查方法和防治原則》實驗二細菌培養技術給細菌提供適宜的條件，細菌即可以生長繁殖，形成具有一定特征的培養物，學習細菌培養技術可以純化細菌，了解細菌的生長特征，并能進一步檢測細菌生化反應、變異性，制備細菌抗原，深入進行分子生物學工作等。了解細菌的培養特征也有助于鑒別細菌。細菌培養基的制備培養基是用人工方法將適合細菌生長繁殖的各種營養物配制而成的營養基質，以供細菌培養使用。一般培養基的主要成份為蛋白質、糖類、鹽類、水分等。另外還有一些營養要求較高的細菌，還必須加入血液或血清、雞蛋、維生素等其他營養物質。有時為了鑒別或抑制某些細菌，則可加入各種專用基質（如某種糖類、氨基酸等），指示劑，染料等。由于對培養基的使用目的不同，故在培養基的選擇上有所不同。按其物理性質可分為液體培養基、固體培養基、半固體培養基。按其成分和用途可分為普通培養基，鑒別培養基，選擇培養基和專用培養基等。培養基需加入小試管、中試管、三角瓶、平皿等內使用。培養基的種類很多，但一般制備原則有三條：1.足夠和適當的營養成份。籍以滿足細菌生長繁殖的要求，獲得典型細菌培養物，達到研究細菌的形態，生化反應，抗原結構及致病力等方面的目的。2.合適的酸鹼度。培養基的酸鹼度直接影響細菌的生長繁殖。一般細菌最合適PH為7.2~7.6。測定的方法常用普通比色法或精密PH試紙來測定（見附錄）。3.絕對無菌。培養基務必進行除菌處理，由于培養基所含成份不同，除菌的方法也不同。如普通培養基常用高壓蒸氣滅菌法。一、常用培養基的制備（一）普通肉湯培養基【材料】1.新鮮牛肉或牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，蒸餾水。2.酚紅指標劑，比色架及標準比色管或精密PH試紙。3.漏斗，量筒，三角燒瓶，試管等。【方法】1.稱取去脂去腱絞碎的鮮牛肉500克，浸于1000毫升蒸餾水中，冰箱過夜，次日煮沸30分鐘，紗布過濾，蒸餾水補足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸餾水1000毫升加熱溶化），即為肉浸液。2.取肉浸液1000毫，氯化鈉5克，蛋白胨10克混合加熱溶化。3.調整PH為7.6，用濾紙過濾分裝于中試管或三角燒瓶內，塞緊棉塞。【用途】供基礎培養基用，營養比肉膏湯好，一般營養要求不高的菌均可生長。（二）普通瓊脂培養基瓊脂是石花菜等海藻類提取的膠體物質，其化學成份主要是多糖。當溫度達到98℃以上可溶解于水，45【材料與方法】普通肉湯培養基100毫升，加入瓊脂2~3克，加熱溶化，用蒸餾水補足失去水分，調整PH為7.6后分裝中試管、平皿等器皿，高壓蒸氣15磅滅菌20分鐘，可制成普通瓊脂斜面和普通瓊脂平板。【用途】供一般細菌培養用，并可作無糖基培養基。（三）半固體培養基【材料與方法】取普通肉湯培養基100毫升，加入瓊脂0.5~0.7克，加熱溶化。調整PH為7.6，分裝于小試管內，每管1~5毫升，高壓蒸氣磅滅菌20分鐘，待冷后放入4℃【用途】保存一般菌種用，并可觀察細菌的動力及生化反應。（四）血液瓊脂培養基【材料與方法】將高壓滅菌后普通瓊脂培養基。冷至45℃~50【用途】供營養要求較高的細菌分離培養用，亦可觀察細菌的溶血特征。二、細菌接種技術及生長表現由于細菌感染而致病的各種標本及帶菌者所需檢查的各種標本，往往并非單一的細菌，而混有其它非致病菌（人體正常菌群）。因此當對此標本須作出細菌鑒定時，就必須從標本中分離出致病菌，稱為細菌分離培養技術。另外，對已得到可疑病菌進行細菌鑒定及菌種保存等培養，稱為純培養接種技術。（一）平板劃線接種法（又稱分離培養法）平板分離劃線的方法較多，其中以分區劃線法與曲線劃線法較為常用。其目的都要使細菌呈現單個菌落生長，便于同雜菌菌落鑒別。現只介紹分區劃線法。【材料】1.細菌：大腸桿菌、葡萄球菌18~24小時普通瓊脂斜面培養物。2.培養基：普通瓊脂平板。3.酒精燈，接種環等。【方法】1.右手持接種環，經火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌（或葡萄球菌）培養物少許。2.左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的1/10），劃線時接種環與平板表面成30~40o角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，接種環不應劃破培養基表面。3.燒灼接種環，殺滅環上殘留細菌，待冷（是否冷卻，可先在培養基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續平行劃線（見圖3），約占平板表面1/5左右，再次燒灼接種環，等三次平行劃線……以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。4.劃線完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標簽或臘筆注明菌名檢驗號碼，接種者班級，姓名，組別等，置37℃（二）純培養細菌接種法1.斜面培養基接種法：用于培養，保存菌種及其它實驗用。【材料】（1）大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時瓊脂斜面培養物。（2）普通瓊脂斜面培養基。（3）接種環，接種針，酒精燈等。【方法】（1）取一支斜面培養基及一支純菌種管，并排傾斜放在左手四指中拇指壓住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太緊時應預先松動）。（2）試管口部于火焰上往返通過2~3次滅菌，將滅菌白金環伸入有菌試管中，取少量細菌（一般應從斜面底部沾取），然后小心移至準備接種的試管中。（3）接種方法是自管底向上連續平劃線，若以保存菌為目的時可自管底上劃一粗直線即可。（4）取出接種環，將試管上部再經火焰滅菌，塞好棉塞，接種環滅菌后放回原處。（5）若自平皿培養物中取菌時，只應沾取一個單個菌落。（6）接種菌應作好標記，標明菌種名稱，日期等，置37℃2.液體培養基接種法：用于增菌及鑒定細菌生長特點，如表面生長，沉淀生長，均勻混濁生長等。【材料與方法】操作技術基本與上法相同，只是接種時應將沾菌之接種環沿接近液體表面之管內壁輕輕摩擦（勿用力振蕩）使細菌混入培養基內，置37℃3.半固體培養基穿刺培養法用于保存菌種及間接觀察細菌之動力（無動力之細菌僅沿穿刺線生長，清晰可見；有動力的細菌使培養基呈現混濁樣，穿刺線甚至難以看出）。用無菌操作技術，滅菌穿刺針沾取細菌后，垂直刺入半固體培養基中央直達近管底處，再沿原穿刺線抽出即可，置37℃實驗內容2；實驗三細菌的生化反應檢測（示教）不同細菌由于所含的酶系統不完全相同，因而對營養物質的分解能力及代謝產物亦不一致，據此，可用以鑒別細菌的種類。一、單糖發酵試驗【原理】單糖發酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養基內，使其最終濃度為0.75~1％。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發酵管，接種細菌經37℃培養18~24小時，若能分解糖產酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有C02和H2【材料】1．菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2．培養基：葡萄糖發酵管，乳糖發酵管等。【方法】1．將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發酵管內。2．置37℃3．觀察結果：由于一些細菌能分解某種糖類產酸，所以培養基中PH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養基顏色由紅變黃。產酸者以“+”表示，如果同時產生氣體，則培養基中小倒管內有氣泡出現，此乃產酸又產氣，以“⊕”表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。【結果】傷寒桿菌大腸桿菌葡萄糖+⊕乳糖-⊕二、V-P(Voges-Proskauer)試驗【原理】有些細菌如產氣桿菌，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸脫羧，生成乙酰甲基甲醇，在堿性環境中被氧化為二乙酰，再與培養基內胍基結合，生成紅色化合物，V—P試驗陽性。【材料】1．菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2．培養基：葡萄糖蛋白胨水培養基。3．試劑：V-P試劑[40％氫氧化鉀水溶液(內含0.3％肌酸)和6%α-奈酚酒精溶液]。【方法】1.分別接種大腸桿菌，產氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白胨水中。2.置37℃培養48小時后，取出分別加入KOH1ml和α3.觀察結果：培養液變為紅色為陽性，不變色為陰性。【結果】大腸桿菌：-；產氣桿菌：+三、甲基紅（M、R）試驗【原理】某些細菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養基PH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應；若產酸量少或產生的酸進一步轉化為醇、醛、氣體和水等，則培養基的酸堿度仍在PH6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現黃色，為陰性反應。【材料】1.菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：葡萄糖蛋白胨水培養基。3.試劑：甲基紅試劑。【方法】1.分別將大腸桿菌，產氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養基中。2.置37℃【結果】大腸桿菌：+，產氣桿菌：-。四、枸櫞酸鹽利用試驗【原理】枸櫞酸鹽培養基系一綜合性培養基，其中枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源。一般細菌能利用磷酸二氫銨作為氮源，但不一定能分解枸櫞酸鹽取得碳源。因此，根據可否利用枸櫞酸鹽來鑒別細菌，如產氣桿菌可利用枸櫞鹽作為碳源，細菌生長繁殖，形成菌苔，分解枸櫞酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養基PH上升到7.0以上，由綠色變為深蘭色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性；而大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，得不到碳源，不能生長，無菌苔形成，培養基顏色不發生變化，為枸櫞酸鹽利用試驗陰性。【材料】1.菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：枸櫞酸鹽斜面。【方法】1.分別將大腸桿菌，產氣桿菌接種于兩支枸櫞酸鹽斜面培養基。2.置37℃【結果】產氣桿菌：+（有菌苔生長，培養基變色）大腸桿菌：-（無菌苔生長，培養基不變色）五、靛基質（Indol）試驗【原理】某些細菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養基中的色氨酸，產生靛基質（無色吲哚），再與歐立希試劑（對二甲基氨基苯甲醛）反應，形成紅色化合物—玫瑰吲哚，即為陽性反應。【材料】1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：蛋白胨水培養基。3.試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對二甲基氨基苯甲醛）【方法】1.分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養基中。2.置37℃培養2~3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑0【結果】大腸桿菌：+；傷寒桿菌：-。六、硫化氫（H2S）產生試驗【原理】某些細菌能分解培養基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氫。硫化氫遇到培養基中的鉛鹽（醋酸鉛）或鐵鹽（硫酸亞鐵），則形成黑褐色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。培養基內含有還原劑硫代硫酸鈉，使形成的硫化氫不再氧化。【材料】1.菌種：大腸桿菌，傷塞桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：醋酸鉛培養基。【方法】1.分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛培養基內。2.置37℃3.觀察結果：取出后對光觀察，若沿穿刺線有黑褐色沉淀物，即表示該菌能產生硫化氫（H2S），否則反之。【結果】大腸桿菌：-（無黑色沉淀線生成）傷寒桿菌：+（有黑色沉淀線生成）七、尿素分解試驗【原理】某些細菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產生氨，氨溶于水變成氫氧化銨，使培養基變堿而呈紅色即為陽性。【材料】1.菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：尿素培養基。【方法】1.分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養基上。2.置37℃3.取出觀察結果，培養基變為紅色，即尿素分解試驗陽性，若不變色，即為尿素分解試驗陰性。【結果】變形桿菌：+；傷寒桿菌：-。八、氧化酶試驗【原理】某些細菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能將氧化酶試劑（鹽酸二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺）氧化成紅色的醌類化合物，即為氧化酶試驗陽性。【材料】1.菌種：淋球菌或腦膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小時巧克力斜面培養物。2.培養基：巧克力平板。3.試劑：0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺（或鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸對氨基二甲苯胺）水溶液。【方法】1.將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；2.置37℃3.滴加新鮮配制的0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺水溶液于固體培養基上；4.觀察結果：加試劑后，若菌落出現紅色→深紅色→紫黑色變化均為陽性；反之陰性。【結果】腦膜炎球菌和淋球菌：+；白色葡萄球菌：-。【注意事項】1.此項試驗應避免含鐵物質，因遇鐵會出現假陽性。2.試劑在空氣中易氧化，故應新鮮配制。冰箱保存使用不超過兩周。3.若要分離培養腦膜炎球菌，應在菌落變成紫黑色之前立即轉種。否則細菌容易死亡。《附錄》1．V-P試驗劑的配制甲液：α-萘酚6g95%灑精100ml乙液：KOH40g肌酸0.3g蒸餾水100ml2．甲基紅試劑的配制甲基紅0.04g95%酒精60ml蒸餾水40ml先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸餾水，混合，搖勻即成。3．歐立希（Ehrlich）試劑的配制對位二甲基氨基苯甲醛4g95%酒精380ml濃硫酸或濃鹽酸80ml三種成分混合即成，瓶口要嚴密，以免揮發。4．蛋白胨水培養基的制備成分：蛋白胨10g氯化鈉5g蒸餾水1000ml制法：（1）先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解,再加足蒸餾水量。（2）調節pH至7.6、用濾紙過濾。（3）分裝中試管，每管約3-4ml，加塞滅菌后備用。用途：供吲哚試驗用5．單糖發酵管的制備成分：蛋白胨水培養基100ml0.2%酚紅1ml所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g制法：（1）將上述成分溶化，混勻分裝于內含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約2ml，加塞。（2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存備用。用途：供單糖發酵試驗用。附注：0.2%酚紅配制法酚紅（phenolred）0.2g1/10N苛性鈉（NaOH）8ml蒸餾水92ml將酚紅入研缽徐徐加入苛性鈉研磨，再補足蒸餾水即成。若需長時間保存，可高壓滅菌后貯存備用。6．葡萄糖蛋白胨水培養物成分：蛋白胨5g葡萄糖5g制法：（1）將上述成分溶解于蒸餾水中。（2）調節pH至7.6，用濾紙過濾除渣。（3）分裝中試管，每管約3-4ml，滅菌后備用。用途：供甲基紅及V-P試驗用。7．枸櫞酸鹽斜面培養基的制備成分：磷酸二氫銨0.1g磷酸氫二鉀0.1g硫酸鎂0.02g枸櫞酸鈉0.23g氯化鈉0.5g瓊脂2g蒸餾水100ml0.5%溴麝香草酚藍酒精溶液2ml制法：（1）先將上述各種鹽類溶解于蒸餾水中，使其完全溶解。（2）矯正pH至6.8，然后加入瓊脂和指標劑。（3）搖勻，脫脂棉過濾，分裝中試管，每管約3-5ml。（4）滅菌后置成斜面備用（冷后為綠色）用途：供枸櫞酸鹽利用試驗用。8．醋酸鉛培養基的制備成分：2%肉湯瓊脂200ml硫代硫酸鈉0.05g醋酸鉛10g蒸餾水100ml制法：（1）先將10g醋酸鉛加入100ml蒸餾水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備用（10%醋酸鉛溶液）。（2）加熱溶化2%肉湯瓊脂200ml，加入硫代硫酸鈉0.05g，混合后高壓滅菌。（3）從高壓滅菌鍋取出，待冷卻至45℃（4）分裝小試管，每管約2ml，直立待冷凝后備用。用途：供硫代氫生成試驗用。說明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不宜久然。9．尿素培養基的制備成分：蛋白胨1g氯化鈉5g葡萄糖1g蒸餾水900ml瓊脂15~20g0.1%酚紅12ml20%尿素水溶液（無菌）100ml制法：（1）除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯正pH至6.8~6.9。（2）加入瓊脂和酚紅，8~10磅10分鐘滅菌。（3）冷卻至60℃（4）分裝中試管（無菌），每管3~4ml，置成斜面備用。用途：供尿素分解試驗用。說明：（1）尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。（2）無菌尿素溶液制備：稱取尿素20g，混合于100ml蒸餾水中，充分搖勻，用G6濾菌器過濾除菌，以達到無菌的目的。10．巧克力色瓊脂平板的制備成分：肉湯瓊脂100ml無菌脫纖維羊或兔血10ml。制法：（1）將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱加入脫纖維血，搖勻。（2）傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。用途：用于培養腦膜炎雙球菌或淋球菌。說明：加血一定要趁熱加。實驗內容3：播放錄象—《細菌感染的檢查方法和防治原則》

第三次實驗實驗四細菌分布及外界因素對細菌影響的檢測實驗內容：1．課堂上全部操作；2．次日預約看結果一、自然沉降法檢查空氣中的細菌【材料】普通瓊脂平板。【方法】取普通瓊脂平板一個，打開皿蓋，讓培養基直接暴露于空氣中，置于實驗臺上或需要測定的地方15~30分鐘。蓋上皿蓋，用記號筆或蠟筆注明放置地點、實驗日期和實驗者班級、姓名等，放入37℃二、傾注法檢查水中的細菌【材料與方法】1.用無菌吸管吸取勝0.5ml水樣加入肉湯培養基中。2.另取一支未接種的肉湯管做對照，與上管一起置于37℃溫箱培養18~2【結果】對照管應透明清亮，試驗管變混濁，說明水樣中有活菌存在。并可通過比濁法估計細菌生長繁殖后的數量。三、人體體表及各種物品表面的細菌檢查—拭子法和涂抹法【材料】普通瓊脂平板。【方法】取普通瓊脂平板一個，在平板底面用記號筆或蠟筆將平板分成若干等份，于每份培養基表面分別用手指、衣物、書本、筆等輕輕涂抹（不要擦破培養基）。也可用無菌生理鹽水擦洗衣物等，用無菌棉拭子涂于培養基表面，蓋上皿蓋,分別標記清楚。置37℃溫箱培養18~24小時【注意事項】本實驗檢出的除細菌外，尚可能有真菌、放線菌等，請注意加以區別。四、人咽喉部位的細菌檢查【材料】血液瓊脂平板。【方法】1.咳碟法取血液瓊脂平板一個，打開皿蓋，將培養基面置于口腔前約10厘米處，用力咳嗽數次（讓飛沫落在培養基表面），然后蓋上皿蓋，注明被檢查者姓名、實驗日期等。置37℃2.試子法用無菌棉簽涂取扁桃腺兩旁的分泌物，在血瓊脂平板表面涂布成線，然后改用接種環，作分區劃線接種，置37℃五、化學因素對細菌的影響（化學消毒劑的殺菌試驗）【材料】1.菌種：葡萄球菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：普通瓊脂平板。3.化學消毒劑：5%石炭酸、2%碘酒、70%酒精、0.1%升汞。4.其他：直徑0.6cm無菌圓形濾紙片、小鑷子、接種環等。【方法】1.將瓊脂平板分為四等分，并在其底面做標記。2.用接種環取葡萄球菌瓊脂斜面培養物，密涂于整個瓊脂培養基表面。3.用小鑷子夾取無菌小濾紙片，分別蘸取上述消毒劑（消毒劑不宜蘸得過多，防止外流）。平貼于各相應分區的中央，蓋上皿蓋，標明日期和試驗者。4.置37℃六、細菌的藥物敏感試驗【材料】1.菌種：大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：普通瓊脂平板。3.分別含各種抗生素的直徑0.6cm的圓形紙片（青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素）、小鑷子等。【方法】1.取瓊脂平板兩個，每個平板分為五等份，并做相應標記。2.用接種環分別密涂大腸桿菌及葡萄球菌于兩個瓊脂平板培養基表面。3.用小鑷子以無菌操作技術先夾取一無菌不含抗生素的濾紙片平貼于平板中央，再分別夾取含抗生素的各種濾紙片平貼于各相應區中央，蓋上皿蓋。注明班級、姓名、日期等。4.置37℃5.抑菌程度判定：抑菌程度的判定是依照濾紙片周圍細菌的生長與抑菌圈直徑大小來判定。對藥物的敏感程度抑菌環直徑（mm）不敏感無抑菌環輕度敏感<10中度敏感10~15高度敏感>15《附錄》抗生素濾紙片的制備方法1.取直徑0.6cm園形濾紙片，每100片置于一小平皿中，15磅滅菌20分鐘，再置于烤箱（60~100℃2.取一定濃度的不同抗生素（見表1）分別注入裝有無菌濾紙片的小平皿內，每100片加入1ml抗菌素，浸泡半小時后，再置37℃溫箱中2~3小時干燥。干表1常用幾種抗生素的濃度表抗生素名稱濃度（每毫升）標記字樣/符號青霉素200μ青（P）鏈霉素1mg鏈（S）紅霉素1mg紅（E）卡那霉素200μ卡（K）慶大霉素40μ慶（G）七、噬菌體的噬菌作用噬菌體（bacteriophage）具有嚴格寄生性，對相應的易感細胞，具有高度的種特異性和型特異性。感染細胞后，或者裂解宿主細胞，或者處于溶原狀態。可應用噬菌體作細菌的鑒定、分型、檢查未知細菌和防治某些疾病。【材料與方法】1.噬菌體的溶菌現象（1）取4支肉湯管，2支接種金黃色葡萄球菌，2支接種大腸桿菌。（2）將上述兩種菌肉湯管各取1支，分別加入金黃色葡萄球菌噬菌體肉湯液0.2ml。（3）將上述4支肉湯管，置37℃2.噬菌體的溶菌斑（1）取普通瓊脂平板1只，分為4等分，注明①、②、③、④。（2）用無菌棉簽在①、②處涂布接種痢疾桿菌，在③處接種大腸桿菌，在④處接種白色葡萄球菌。（3）在②、③、④處各加1小滴痢疾桿菌噬菌體肉泌液，在①處加1滴肉湯。（4）置37℃培養16~1圖5噬菌體的溶菌斑【結果】1.溶菌現象加有噬菌體的金黃色葡萄球菌肉湯管清亮，其余均混濁。2.溶菌斑如圖5，在②處的中央有一無菌生長的空斑，即溶菌斑（或蝕斑），其余部位無此現象。八、紫外線的殺菌試驗【原理】波長240nm~280nm的紫外線，因與DNA吸收光譜一致，而具有明顯的殺菌作用。其機制是使細菌DNA鏈中兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構型，干擾其正常復制，導致細菌死亡。【材料】1.菌種：大腸桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。2.培養基：普通瓊脂平板。3.無菌黑色圖案紙片，紫外線燈，消毒液。【方法】1.用接種環取大腸桿菌瓊脂斜面培養物，密涂于普通瓊脂平板培養基表面。2．火焰滅菌小鑷子、待稍涼后，打開平皿蓋，取無菌黑紙片一片平貼于涂有細菌的平板培養基表面中間。3.將平板暴露于距紫外燈管20~30cm處，打開紫外線燈照射30分鐘。4.照射完畢，無菌操作取出黑紙片，投入消毒液中，蓋上皿蓋，做標記，注明日期，試驗者等。5.置37℃培養18~24小【結果】黑紙片遮蓋處細菌生長形成灰白色菌苔，形狀同黑紙片形狀。直接暴露在紫外線燈下的培養基表面無生長或僅有少量的細菌生長，形成菌落。【應用】紫外線的殺菌力雖強，但穿透力弱，故僅用于實驗室、手術室空氣及物體表面的消毒滅菌。【注意事項】殺菌波長的紫外線對人體皮膚，眼睛有損傷作用，使用時應注意防護。九、濾過除菌【原理】濾過是一種機械除菌法，主要用于一些不耐高溫液體的除菌，例如：血清、毒素、抗毒素、藥物等。但濾過不能除去病毒、支原體和L型細菌。【材料】1.待濾的血清肉湯（燒瓶分裝、有菌）。2.肉湯管3.濾器（已滅菌）和過濾裝置、無菌刻度吸管和試管等。【方法】1.無菌取一環待濾血清肉湯接種于肉湯管內。2.將燒瓶中的血清肉湯倒入濾斗，啟動抽氣機，減壓抽濾。濾畢，關閉抽氣機。迅速以無菌刻度吸管吸取瓶中濾液，移置于無菌試管中。3.無菌取一環濾液接種于另1管肉湯。4.將2管肉湯置37℃【結果】接種待濾血清肉湯的管呈混濁，接種已濾血清肉湯的管澄清。第四次實驗實驗內容1：血漿凝固酶試驗（操作）實驗內容2：腸桿菌科細菌的檢測（綜合實驗一）1）糞便材料的分離、培養—鑒別培養基；2）次日，雙糖鐵培養基接種初步鑒定。實驗七病原性球菌的檢測一、主要病原性球菌的形態、培養特征【形態示數】1.葡萄球菌（革蘭染標本）：革蘭染色陽性，為正圓形，呈葡萄串狀排列，亦有單個散在分布。2.鏈球菌（革蘭染色標本）：革蘭染色陽性，圓形或卵圓形，呈鏈狀排列。3.肺炎雙球菌（小鼠腹腔液涂片，HiSS染色）：革蘭陽性球菌，矛頭狀成雙排列，平端相對，尖端相背。莢膜染色片中，菌體呈紅色，菌體周圍的莢膜呈淡紅色或無色。4.腦膜炎雙球菌（腦脊液涂片，美蘭染色）：革蘭陰性球菌，腎形成雙排列，凹面相對，菌體呈淺蘭色，多位于中性粒細胞漿內，胞漿外也有少數散在分布。【培養特征】1.葡萄球菌在血液瓊脂平板上的生長表現：菌落為圓形，中等大小，表面光滑，邊緣整齊，不透明；金黃色葡萄球菌菌落呈現金黃色，而白色葡萄球菌，檸檬色葡萄球菌菌落呈白色或檸檬色（如菌落色素不易區別時，用白紙片沾菌落少許有助觀察）；金黃色葡萄球菌的菌落周圍多有透明溶血環，而其他葡萄球菌一般無溶血環（僅少數新分離白色葡萄球菌可呈現微溶血現象）。2.鏈球菌在血液瓊脂平板上的生長表現：除丙型鏈球菌外，菌落均較微小，如針尖大，圓形，灰色，半透明。根據溶血性將鏈球菌分為三類。甲型鏈球菌的菌落周圍有小的草綠色溶血環，乙型鏈球菌有較大的透明溶血環，丙型鏈球菌不溶血。二、葡萄球菌血漿凝固酶試驗（操作）【原理】血漿凝固酶試驗是區別致病性葡萄球菌與非致病葡萄球菌的最重要指標。致病性葡萄球能產生血漿凝固酶，此酶的作用類似凝血酶原，在血漿中激活劑的作用下，可使血漿中的纖維蛋白原轉變為不溶性的纖維蛋白，從而導致血漿凝固（呈現塊狀或顆粒狀）。非致病性葡萄球菌不產生此酶，因而不能凝固血漿。此酶有兩種存在形式：結合于細胞壁上血漿凝固酶，采用玻片法測；游離形式的血漿凝固酶，采用試管法檢測。【材料】1.金黃色、白色葡萄球菌瓊脂斜面18~24小時培養物。2.1:2人或兔血漿。3.生理鹽水、玻片、接種環等。【方法】1.取載玻片一張，用蠟筆分成三等份。2.于第一、二格內滴加入血漿各1滴，于第三格內滴加生理鹽水1滴。3.取金黃色葡萄球菌斜面培養物少許，分別混懸于第三格及第一格內，取白色葡萄菌混懸于第二格內，分別研磨混勻。靜置2~3分鐘。【結果】第三格和第二格中細菌呈出均勻混濁，而第一格中細菌呈現塊裝或顆粒狀凝固現象，即判定為血漿凝固酶陽性。三、抗鏈球菌溶血素“O”試驗【原理】鏈球菌“O”溶血素是A族溶血性鏈球菌的代謝產物之一，能溶解人或兔的紅細胞，對氧敏感，如與空氣中的氧接觸；能使蛋白質上的-SH基氧化成-S-S基，失去溶血活性。在實驗中可借還原劑的作用，使它重新恢復溶血活力。溶血素“O”具有很強的抗原性，人感染該菌后，2~3周產生相應的抗體，此種抗體能中和溶血素“O”的溶血活力。因此，測定患者血清中抗鏈球菌溶血素“O”抗體的效價，可作為風濕熱等疾病的輔助診斷。抗“O”試驗的效價是指完全不溶血之血清最高稀釋度。【材料】1.患者血清：1：50稀釋2.溶血素“O”及還原劑片劑（按說明配制）3.1%兔紅細胞4.生理鹽水，試管、吸管，37℃【方法】1.取清潔小試管5支，依次排列編號。2.于第一管注入生理鹽水1.8ml，第二管0.1ml，第三管0.2ml，第四管0.3ml，第五管0.5ml。3.于第一管注入0.2ml1：50稀釋的患者的血清，反復吹吸三次，混勻。吸出0.4注入第二管，吸出0.3ml注入第三管，吸出0.2ml注入第四管，吸出0.6ml棄去，第五管不加，作為對照管，此時，各管的血清稀釋度為1:500、1:625、1:833、1:1250。4.于每管注入還原溶血素“O”0.25ml，置37℃5.取出后于每管注入1%紅細胞懸液0.25ml，置37℃抗“O”試驗操作表材料管號12345生理鹽水1.80.10.20.30.5(棄去0.6)1：50稀釋血清（ml）0.20.40.30.2-血清稀釋度1:5001:6251:8331:1250對照還原溶血素“O”0.250.250.250.250.25置37℃1%紅血球0.250.250.250.250.25置37℃【結果】先觀察對照管，再依次觀察試驗管，溶血者上清呈透明紅色為抗“O”抗體陰性。不溶血者呈均勻混濁為抗“O”抗體陽性。以完全不溶血之血清最高稀釋度作為抗體的效價。效價在1：500單位以上者表示病人曾經受過溶血性鏈球菌感染，多次試驗逐步增高者可作為活動性風濕病的輔助診斷。逐漸下降者，多處于緩解期。；恒定不變者，多為非活動期。四、肺炎雙球菌小鼠毒力試驗肺炎球菌中，有少數菌不產生莢膜，故無致病力，具有莢膜的肺炎球菌致病力強，小白鼠對肺炎球菌很敏感，故可用作肺炎球菌的毒力鑒定，同時可用以純化肺炎球菌。【材料與方法】1.取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎菌菌液0.2ml，飼養觀察。2.待瀕臨死亡時，及時解剖，取心血接種血平板作細菌培養。3.取其腹腔液涂片，作莢膜染色鏡檢。【結果】1.有毒力的肺炎球菌，能使小白鼠在注射菌液后12~36小時瀕臨死亡。2.血培養可獲得肺炎球菌純培養物。3.有毒力的肺炎球菌，莢膜染色鏡檢，可見有明顯的莢膜。【注意事項】1.在實驗中要特別注意無菌操作。2.實驗中，可用無毒力的肺炎球菌作對照實驗。五、臨床標本中化膿性球菌的分離鑒定從臨床標本中分離鑒別化膿性球菌時，可根據各種化膿球菌不同的生物學特征，直接涂片鏡檢、分離培養等方法，鑒定出未知的化膿球菌，不僅可為化膿性感染的臨床診斷提供依據，而且可進行藥物敏感試驗，為臨床選用有效的抗菌藥物提供參考。1.標本的采集和處理（1）膿標本用無菌棉簽，蘸取患處深部膿液少許，置入無菌小試管內，送檢。（2）痰標本、用無菌棉簽，挑取病人膿稠痰塊，置放無菌小試管內，送檢。（3）咽喉部標本令病人把口張大，用壓舌板壓住舌根部，用無菌棉簽，迅速蘸取咽喉部分泌物，置入無菌小試管，送檢。（4）血標本疑為化膿性球菌敗血癥患者，在嚴格無菌操作下，靜脈采血5ml，直接加入50ml的肉湯瓶內，立即搖勻，送檢。（5）腦脊液標本在嚴格無菌操作下，作腰椎穿刺取腦脊液，送檢。2.檢驗程序根據檢查的目的要求，按下圖所示，進行檢查。

膿、痰、咽喉拭子膿、痰、咽喉拭子病灶分泌物標本涂片染色鏡檢形態排列結構染色性觀察生長情況菌落特點溶血性色素挑選可疑菌落直接接種血平板涂片染色鏡檢轉種液體定向性培養基特殊試驗轉種血斜面生化反應動物試驗血清學試驗藥敏試驗血液穿刺液（直接接種）肉湯瓶涂片染色鏡檢（培養生長后）【注意事項】1.上面只表明一般的檢查原則，在實驗檢查中，還需要根據臨床提供的可能診斷，作定向的檢查。2.若疑為流腦或淋病患者。其標本送檢時，要注意保溫，所用的培養基要提前放入孵箱內預溫。3.欲檢查腦膜炎球菌或淋球菌，其標本應接種于巧克力色瓊脂平板。實驗內容2：實驗八腸道桿菌的檢測綜合實驗（一）：1．糞便材料的分離、培養—鑒別培養基；2．次日，雙糖鐵培養基接種初步鑒定。一、主要腸道桿菌的形態、培養特征（示教）（一）形態觀察1.大腸桿菌（革蘭氏染色標本）革蘭氏染色陰性，中等大小球桿菌，兩端純圓，呈現分散排列。2.傷寒桿菌（革蘭氏染色標本）革蘭氏染色陰性，中等大小球桿菌，散在分布。3.痢疾桿菌（革蘭氏染色標本）革蘭氏陰性桿菌。（二）培養特性1.大腸桿菌：在普通瓊脂平板上形成圓形、中等大小、灰白、半透明，邊緣整齊光滑之菌落，有特殊氣味。在EMB平板上菌落呈現紫黑色，有金屬光澤。在MCK平板上菌落呈紅色。2.傷寒桿菌：在普通瓊脂平板上菌落為園形，中等大小、灰白、半透明，邊緣整齊、表面光滑。在EMB平板上，菌落較小，無色半透明。在MCK平板上菌落較小，無色半透明。3.痢疾桿菌：菌落特征同傷寒桿菌。二、糞便標本中腸道病原菌分離鑒定糞便中的細菌種類很多，要檢出病原菌，通常應用具有選擇性或鑒別性的培養基，其特點是此類培養基中除含有細菌所需的營養物質外，還含有抑菌劑和指示劑。可選擇性的抑制沙門氏桿菌和痢疾以外的其它腸道桿菌生長，指示劑則可用以鑒別細菌的生化特性。其檢驗程序如下。（一）標本采集采取標本時應注意病情和病程，盡量在未使用抗菌素之前，選取膿血或粘液部分。取材后應立即送檢。如不能立即送檢，可將本本保存于30%甘油緩沖鹽水中。（二）分離培養【材料】EMB平板，MCK平板。【方法與結果】用接種環挑取少量糞便標本，以分離劃線法接種于EMB平板或MCK平板上，置37℃平板劃線法平板劃線法糞便接種于37EMB平板24小時37MCK平板24小時大、紫黑色、有金屬光澤，不透明，為非致病菌菌落小、無色較透明，為可疑菌落大、紅色、不透明為非致病菌落小、無色較透明為可疑菌落（三）初步鑒定【材料】雙糖鐵培養基【方法與結果】將可疑菌落接種于雙糖鐵培養基中，經37℃上層下層動力H2S+eq\o\ac(○,+)+-非致病菌+eq\o\ac(○,+)---+--痢疾桿菌-+++傷寒桿菌-eq\o\ac(○,+)++副傷寒桿菌第五次實驗綜合實驗（二）：1．分離可疑菌的血清學鑒定—玻片凝集（操作）2．血清學實驗—肥達反應（操作）3．播放錄象——腸桿菌科（一）血清學鑒定【材料】傷寒桿菌，甲、乙型副傷桿菌，痢疾桿菌診斷血清，載玻片，生理鹽水等。【方法與結果】根據初步鑒定結果，用已知診斷血清作玻片凝集試驗，如發生凝集，即可確定。如疑集陰性，應復查后再定。（二）繼續鑒定：根據需要可進一步作生化反應，血清學分型等鑒定。【注意事項】1.作分離培養時宜取膿血便接種于鑒別培養基或選擇培養基上。2.挑取可疑菌落時，每份標本可選取2~3個菌落，每個菌落接種一支雙糖管。3.玻片凝集確定后，如果需要，可保存菌種，以便進一步鑒定和研究用。《附錄》1、伊紅美蘭（簡稱EMB）培養基制備1）成份：①pH7.6%無糖瓊脂100毫升②20%乳糖溶液2毫升③2%伊紅水溶液2毫升④0.5%美蘭水溶液1毫升2）制法：將上述成分混合溶化，8~10磅高壓蒸氣滅菌15分鐘，制成平板備用。3）應用原理：培養基中含有乳糖，伊紅及美蘭指示劑，伊紅系酸性染料，當大腸桿菌分解乳糖產酸時，細菌帶正電荷，而染上伊紅，伊紅與美蘭結合形成紫黑色化合物，所以菌落呈出紫黑色，且有金屬光澤；致病菌不分解乳糖故其菌落不變色，較透明，培養基中加入的染料還可抑制其他革蘭陽性菌生長。2、雙糖鐵培養的制備1）成分：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，硫代硫酸鈉0.05g，硫酸亞鐵0.5g，葡萄糖0.1g，乳糖1g，瓊脂1g，酚紅0.025g，蒸餾水100ml。2）制法：將上述成分（除瓊脂及酚紅）混合，加熱溶化，矯正PH至7.4~7.6。再加入瓊脂及酚紅，煮沸，分裝小試管內，每支約2ml，經10磅15分鐘后，置成高層斜面，冷凝后即成。3）使用原理：克氏雙糖鐵培養基中含有葡萄糖、乳糖、硫酸亞鐵及酚紅指示劑等成份。經菌分解葡萄糖產酸時，使培養基的下層由紅變黃，斜面培養基中雖然也含有葡萄糖但量小，且分解產生的酸為揮發性酸，所以只發酵葡萄糖的細菌斜面仍為紅色；產酸并產氣時，培養基中有氣泡或裂隙出現。培養基中乳糖含量大，被分解后產酸多，因此不僅培養基下層變黃，而且斜面出由紅變黃，基于上述現象，通常將培養基的斜面部分代表乳糖，下層部分代表葡萄糖。培養基中含有硫酸亞鐵，如有硫化氫產生，則生成黑色硫化鐵，使培養基中出現黑色。三、肥達反應【原理】肥達試驗是一種試管凝集反應。用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原，與病人血清作定量凝集試驗，以測定患者血清中無相應抗體存在，作為傷寒、副傷寒診斷的參考。【材料】1.患者血清1：10稀釋2.傷寒桿菌O菌液、H菌液、甲、乙型副傷寒H菌液3.生理鹽水、試管、吸管、56℃【方法】1.取清潔小試管32支，分成4排，每排8支，依次編號。2.于小試管內各注入0.5ml生理鹽水。3.于每一排第一管內加入1：10稀釋的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混勻，吸出0.5ml注入第二管作對倍稀釋，……依次稀釋至第7管，棄去0.5ml，第8管為對照。4.從第8管開始，從后向前，第一排各管內注入傷寒桿菌H菌液0.5ml；第二排各管注入傷寒桿菌O菌液0.5ml；第三排各加入甲型副作寒桿菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副傷寒桿菌H菌液0.5ml；5.加完菌液后，振蕩試管架，混勻，置于56℃水浴箱2~4小時，放冰箱過夜，或放置37肥達氏反應操作表單位:ml試管11223345678（對照）生理鹽水0.50.50.50.50.50.50.50.51:1：10病人血清0.50.50.50.50.50.50.5棄去0.5傷寒桿菌H菌（第1排0.50.50.50.5050.50.50.5血清最終稀釋度1:401:801:1601:3201:6401:12801:2560-結果【結果與分析】先觀察對照管，正確結果應無凝集現象，再觀察各試驗管的凝集現象，凝集程度以“+”多少表示之。（++++）最強，上液澄清，細菌全部凝集沉淀于管底。（+++）強，上液輕度混濁，細菌大部分凝集沉淀于管底。（++）弱，上液混濁，細菌少部分凝集。（-）不凝，液體呈乳狀與對照管相同。效價判定：以能出現“++”凝集現象的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價。一般認為O抗體效價在1：80以上，H抗體效價在1：160以上，有輔助診斷意義。但在分析結果時，應注意以下兩點：（1）非腸熱癥患者，由于曾接種過傷寒，副傷寒疫苗或以往在流行區有過隱性感染或患過傷寒，副傷寒，以及回憶反應等原因，也可呈現陽性結果。不過，由這些原因所引起的陽性反應主要是H抗體升高，O抗體效價一般不高，同時，每隔5~7天試血一次，其抗體效價一般不會隨病程而升高。上述這些都有別于現癥感染。（2）少數腸熱癥患者，由于發病初期曾使用大量抗生素，或機體有免疫缺陷病，或機機反應性極弱等原因，抗體效價可以很低，甚至為陰性結果。因此不能只根據肥達氏試驗的結果去作簡單肯定或否定的結論，必須結合當地流行情況，既往接觸史，以及臨床癥狀和體征，作出正確的判斷。四、大腸桿菌腸毒素試驗產腸毒素型大腸桿菌能引起嬰幼兒及旅流者腹瀉，嚴重病例可出現霍亂樣腹瀉，并能造成流行。產腸毒素能力與二種可傳遞質粒有關，一種編碼ST（耐熱腸毒素）和LT（不耐熱腸毒素）；另一種只編碼ST。由于此類大腸桿菌在形態培養和生化反應特性上與一般大腸桿菌無區別，因此，可用檢測腸毒素的方法來鑒別該菌。該型菌中有產生ST菌株，也有產生ST和LT菌株，故一般分別檢測ST和LT兩種腸毒素。（一）LT測定法【原理】LT是蛋白質，不耐熱，65℃【材料】1.產腸毒素大腸桿菌肉湯培養濾液（含LT）、生理鹽水、5%戊巴比妥鈉。2.10周齡健康家兔、注射器、小燒杯、天平、兔固定臺，解剖器械等。【方法】1.家兔禁食1天，仰位固定于兔臺上，耳靜脈緩慢注入5%戊巴比妥鈉（按0.5ml/kg體重），麻醉后剖腹取出小腸，自回腸末端開始，結扎3節腸段，每段長約10cm。2.向中間腸段注入生理鹽水2ml，前、后兩節腸段各注入細菌培養濾液2ml，關腹。3.18小時后，再取出小腸，測量各節腸段的長度，并收集各段內的腸液稱重，比較。【結果】1.注射細菌濾液段腸內液體明顯增多。2.此項試驗結果可以鑒定產腸毒素型（LT）大腸桿菌。（二）ST測定法【原理】ST分子量較小，無免疫原性，耐熱，經100℃20分鐘處理不被破壞，可以激活腸粘膜細胞上的鳥苷環化酶使胞內【材料】1.產腸毒素大腸桿菌培養濾液（含ST）、生理鹽水。2.1~4日齡乳鼠、注射器、胃飼針頭（或細塑料管）、小燒杯、天平、眼科剪鑷等。【方法】1.取乳鼠2只，編號，1只經胃灌注入生理鹽水0.1ml，另一只灌入細菌濾液0.1ml，禁食3~4小時。2.解剖乳鼠，取出全部腸子，稱量乳鼠腸子重量與摘除腸道后其余部分重量，求其重量比。【結果】腸重/體重的比率：0.09ST陽性0.07~0.09ST可疑0.07以下ST陰性【注意事項】1.灌胃材料中，可按每毫升加入1滴2%伊文氏藍液，以指示正確灌入胃內。2.本實驗可用來鑒定產ST腸毒素大腸桿菌。五、痢疾桿菌熒光菌球試驗【原理】將相應抗體加在痢疾桿菌的培養液中，雖相互結合，但細菌不被殺死，在適宜溫度下仍能生長，形成痢疾桿菌微小菌團。如在抗體上標記熒光，則形成痢疾桿菌熒光菌球。【材料與方法】1.將痢疾桿菌接種于含有一定量的熒光抗體的蛋白胨水中，37℃2.蘸取上述培養物接種環于清法玻片上，放上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。【結果】熒光球大而發亮呈園球狀，結構較疏松，周圍近似卷發狀。隨孵育時間增長，菌球結構致密，周圍較園，整齊，菌球周圍有刺毛，孵育時間短時，菌球往往呈多形性。

第六次實驗實驗內容1：結核桿菌的檢測—抗酸染色（操作）實驗內容2：病毒部分的綜合實驗（一）流感病毒分離培養—雞胚接種（操作）實驗內容3：播放錄象—多種病毒的電鏡照片實驗內容1：實驗十二結核桿菌的檢測結核桿菌與麻風桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。結核桿菌菌體細長略帶彎曲，有分枝生長趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關系。該菌營養要求高，生長緩慢，形成“菜花狀”菌落。一、結核桿菌檢驗程序結核病人病灶中查到結核桿菌，是病原學診斷的重要依據，根據感染部位不同，可采集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進行檢驗。直接涂片①染色鏡檢較厚涂片抗酸染色報告菌體特征濃縮集落菌后涂片（或熒光染色）報告菌落特征及抗酸染色結果37℃數周報告菌落特征及抗酸染色結果37數周標本材料②分離培養標本材料固體：改良羅氏培養基標本經酸、堿處理3-4周觀察病變及檢查結核桿菌3-4周觀察病變及檢查結核桿菌注射豚鼠腹股溝皮下③動物接種二、結核桿菌培養特性1.液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸堿處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）后接種液體培養基，35℃2.固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理后，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現“菜花狀”3.結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理后的材料涂片，置液體培養基中，35℃恒三、齊一尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法（操作）【原理】結核桿菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色后，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經美蘭復染，結核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色。【材料】1.結核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。2．抗酸染色液3.載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。【方法】1.無菌手續采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。2.用臘筆將涂面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液干涸。如有干涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鐘，待冷后流水漂去多余的染液。3.用3%鹽酸酒精清脫色，脫至涂面無色為止，約1-3分鐘，自來水沖洗。4.滴加呂氏美蘭染液復雜30秒~1分鐘，水洗。自然干燥或吸干后油鏡檢查。【結果】1.結核桿菌呈現細長，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特征，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核桿菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。2.涂片染色能查到結核桿菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個以上，甚至需達到5萬以上。故材料多進行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標本片觀察中，不一定每個視野都能看到結核桿菌。3.結核桿菌易發生變異，在陳舊培養基或臨床治療后標本材料中，結核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。4.標本已經高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。四、熒光染色法此系用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列于后表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。抗酸菌金胺熒光素染色法方法染劑時間脫色劑時間對比染液時間結果金胺—酚染色法金胺0.1g，加5%石炭酸100ml10至15分鐘3%鹽酸酒精1分鐘0.5%高錳酸鉀溶液1分鐘抗酸菌呈金黃色或銀白色熒光，紫外光源呈暗背景,紫蘭光源呈蘭色背景金胺—羅丹明（B）染色法金胺1.5g，羅丹明（B）0.7g，0.7g,甘油75ml，石炭酸10ml，蒸餾水50ml，搖勻，溶解過濾備用15至20分鐘0.5%鹽酸酒精2分鐘5%高錳酸鉀溶液2至4分鐘抗酸菌呈金黃色熒光，背景清晰，無其它熒光物質干擾方法染劑時間脫色劑時間對比染液時間結果金胺—品紅—美蘭染色法金胺（O）0.1g加95%酒精10ml，石炭石炭酸3ml，蒸餾水87ml混勻，堿性品紅4g溶于75%酒精20ml中緩慢加9%碳酸100ml混勻15分鐘3%鹽酸酒精2分鐘10%呂弗勒氏美蘭水溶液2分鐘熒光鏡檢，抗酸菌呈亮黃色熒光，普通光學顯微鏡檢，抗酸菌呈紅色，背景及其它細菌呈蘭色五、結核桿菌毒力試驗——動物試驗法【材料】1.動物：體重200~250克豚鼠2只2.結核桿菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經濃縮集菌）3.注射器及消毒用材料等。【方法】1.選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩只。2.吸取結核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml3.注射后每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等癥狀。4.給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽性結果。5.6周后，將豚鼠進行解剖，觀察淋巴結是否腫大，有無干酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無灰白色結節病灶，取可疑病灶進行涂片染色鏡檢和分離培養。若為陽性結果，可報告“動物接種后××天查到有結核菌感染”。如無癥狀及病變者，可報告為陰性。六、結核桿菌濃縮集菌法（以處理痰標本為例）材料：結核病人24小時痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。（一）漂浮法：1.取24小時痰液15毫升，裝入細口瓶內，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鐘殺菌。2.待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振蕩20—30分鐘，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時。3.取瓶口表面油狀物涂于載物玻片上，微微加熱，干后再加，如此重復5—6次，至厚度適宜，烘干待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。(二)沉淀法：1.取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鐘后，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振蕩混勻，亦可置37℃2.矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鐘，棄去上清液。3.取沉淀物涂片染色鏡檢。若進行分離培養和動物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。《附錄》抗酸染液的配制1.石炭酸復紅液：稱取鹼性復紅4克，溶于95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。2.3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒97毫升混合。3.呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶于95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。實驗內容2：病毒部分的綜合實驗（一）實驗十五流感病毒的分離鑒定流行性感冒病毒簡稱流感病毒