重組子導入、表達與篩選

重組子導入、表達與篩選

1找找看……重組DNA導入的目的是什么？請簡單描述需要被純化掉的對象轉化率是什么？該怎么計算表達？影響轉化率的因素是什么？找找看……重組DNA導入的目的是什么？請簡單描述需要被純化掉2一、重組DNA分子導入宿主細胞什么是轉化（transformation）？將重組DNA分子引入細菌（原核細胞），使其在細菌體內擴增及表達的過程。什么是轉染（transfection）?將噬菌體、病毒或以它們為載體構建的DNA重組體導入真核細胞的過程。一、重組DNA分子導入宿主細胞什么是轉化（transform3基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝41原核細胞的轉化（細菌轉化）1)受體細胞的選擇限制缺陷型:

避免修飾和降解重組缺陷型：

避免重組整合轉化親和型：

較高的可轉化性遺傳互補型：

利于篩選感染缺陷型：

防止感染1原核細胞的轉化（細菌轉化）1)受體細胞的選擇限制缺陷型:5宿主細胞

原核細胞：大腸桿菌

真核細胞：哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞

宿主細胞

原核細胞：大腸桿菌

真核細胞6重組體分子導入原核細胞感受態細菌：細菌表面正電荷增加，細胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收重組體分子導入原核細胞7（1）CaCl2轉化：細菌處于0度，二價陽離子存在的低滲溶液中，細菌膨脹成球形，處于感受態。此時加熱在42度的熱沖擊下進入細胞，在培養基上生長數小時后球形細胞恢復原狀并繁殖。轉化效率為105~106/ug（1）CaCl2轉化：細菌處于0度，二價陽離子存在的低滲溶液8重組子導入和篩選9（2）電擊法（electroporation）：

在高壓脈沖下，細菌細胞表面形成暫時性微孔，重組DNA進入微孔后，脈沖結束，細胞恢復。實驗簡單，不需要制備感受態菌，轉化效率高109~1010/ug（2）電擊法（electroporation）：10[原理]

利用高壓脈沖，在細菌細胞表面形成暫時性的微孔，重組DNA從微孔中進入，脈沖過后，微孔復原，在豐富培養基中生長數小時后，細胞增殖，重組DNA得到大量復制。

[原理]

利用高壓脈沖，在細菌細胞表面形成暫時性的微113）轉化率：DNA分子轉化宿主細胞獲得轉化子的效率什么叫轉化子？導入外源DNA分子后能穩定存在的宿主細胞什么叫重組子？導入的外源DNA為重組DNA的轉化子

3）轉化率：12表達方式：A、轉化子數/用于轉化的DNA分子總數B、轉化子數/宿主細胞總數計算示例，見書132頁表達方式：13影響因素：重組DNA：分子量小，轉化率高；親和性強的質粒載體轉化率高；ccc質粒DNA載體轉化率高受體細胞轉化方法：電擊法轉化率最高；氯化鈣法次之影響因素：14（1）農桿菌轉化法2、導入植物細胞基因槍法（1）農桿菌轉化法2、導入植物細胞基因槍法15基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因導入活細胞的一種轉化技術。（二）基因槍介法基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因導16優點：（1）無宿主限制。可以對任何基因型材料進行轉化研究；(2)靶受體幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細胞。（3）易于操作。缺點：如轉化頻率低、結果的重復性差，易導致基因沉默，實驗成本較高等。（二）基因槍法優點：（1）無宿主限制?？梢詫θ魏位蛐筒牧线M行轉化研究；(173、導入動物細胞顯微注射技術含目的基因的表達載體動物受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動物輸卵管或子宮轉基因動物顯微注射分裂分化移植發育3、導入動物細胞顯微注射技術含目的基因的表達載體動物受精卵含18脂質體法重組體脂質體受體細胞脂質體法重組體脂質體受體細胞19含有目的基因的重組宿主細胞（如細菌）可以通過規?；幕蚬こ躺a目的蛋白（如激素）含有目的基因的重組宿主細胞（如細菌）可以通過20找找看……基因表達系統有哪些？基因表達系統應該具有什么條件？重組子篩選的意義是什么？有哪些方法可以用來篩選重組子？找找看……基因表達系統有哪些？21最佳的基因表達體系：⑴目的基因的表達產量高;⑵表達產物穩定;⑶生物活性高;⑷表達產物容易分離純化。第一節基因的表達系統與表達策略最佳的基因表達體系：第一節基因的表達系統與表達策略22宿主細胞的選擇一、適合目的基因表達的宿主細胞的要求:1、容易獲得較高濃度的細胞；2、能利用易得廉價原料；3、不致病、不產生內毒素；4、發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；5、容易進行代謝調控；6、容易進行DNA重組技術操作；7、產物的產量、產率高，8、產物容易提取純化。宿主細胞的選擇一、適合目的基因表達的宿主細胞的要求:23二、宿主細胞分為兩大類：1、原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；2、真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。二、宿主細胞分為兩大類：24大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。優越性：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調控機理已有了深刻了解。②有各類菌株和載體系列。③目前以實現多種基因的高效表達。表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等。④易培養，成本低。大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。25缺點：①大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。②因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性復性才恢復活性。③蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基。④其內毒素很難除去。

缺點：26酵母

酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基27重組子的篩選和鑒定重組子的篩選和鑒定28（一）根據載體的性狀變化進行篩選1根據載體的抗藥性標記進行篩選（一）根據載體的性狀變化進行篩選1根據載體的抗藥性標記進行29載體上的抗藥基因：抗氨芐青霉素基因抗四環素基因抗卡那霉素基因等凡是轉入了載體的細胞都獲得了這種抗藥性，可以在平板上生長菌落。載體上的抗藥基因：凡是轉入了載體的細胞都獲得了這種30

當帶有完整抗藥性基因的載體轉化無抗藥性細胞后，凡轉入載體的細胞都獲得了抗藥性，能在含有相應藥物的瓊脂平板上生長成菌落，而未被轉化的宿主細胞不能生長。

當帶有完整抗藥性基因的載體轉化無抗藥31重組子導入和篩選32重組子導入和篩選332根據載體抗藥性插入失活選擇

2根據載體抗藥性插入失活選擇

34根據載體抗藥性標志插入失活選擇

含有兩個以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個基因，并導致這個基因的失活，就可用兩個含不同藥物的平板，互相對照，篩選含重組DNA的菌落，這就是插入失活效應。根據載體抗藥性標志插入失活選擇

含有兩個以上的抗35重組子導入和篩選36重組子導入和篩選37重組子導入和篩選38外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重組DNA空載體不含有載體或重組DNA外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重組393-半乳糖苷酶系統3-半乳糖苷酶系統40β-半乳糖苷酶系統

載體：pUC、pGEM系列載體等

帶有一個來自大腸桿菌DNA的短序列，其中含有編碼β-半乳糖苷酶（β-galatosidase）基因（LacZ基因）的調控序列和N端146個氨基酸的編碼序列，在編碼序列中插入了一個多克隆位點，但不破壞閱讀框架，不影響功能。β-半乳糖苷酶系統

載體：pUC、pGEM系列載體等41

當這種載體轉入的宿主細胞是含有β-半乳糖苷酶C端編碼序列時，此酶的N端序列和C端序列可以互補（成為α互補），產生具有酶活性的蛋白質（β-半乳糖苷酶），從而使宿主細菌在含有IPTG,X-gal的培養基上呈藍色。

當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色。

當這種載體轉入的宿主細胞是含有β-半乳糖苷酶C端編碼42LacZ基因-半乳糖苷酶在X/gal培養基上呈現蘭色X-galX(發色底物)+gal(半乳糖)

-半乳糖苷酶LacZ基因-半乳糖苷酶在X/gal培養基上呈現蘭色X-g43重組子導入和篩選44重組子導入和篩選45重組子導入和篩選46重組子導入和篩選474根據外源性DNA片段性狀進行篩選根據外源基因可能表達的蛋白質對缺乏該蛋白的細菌的影響4根據外源性DNA片段性狀進行篩選48

如果外源性DNA片段可編碼產生蛋白質，并且該蛋白質為細菌生命活動所必需，可利用該蛋白質的性狀進行篩選。

如亮氨酸是細菌生命活動所必需的，當外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因時，將該外源性DNA片段轉入亮氨酸缺陷的細菌中，放入僅含亮氨酸的培養基中，只有能利用亮氨酸的細菌才能生長，因此，能生長的細菌即為含有外源性DNA片段。

如果外源性DNA片段可編碼產生蛋白質，并且該蛋白49（二）根據重組DNA的結構特征進行篩選

1、重組DNA的快速裂解、鑒定

初步篩選方法，根據重組DNA大小和載體DNA大小之間的差別來區分的。

瓊脂糖凝膠中進行電泳分離

，紫外燈下觀察并比較與載體

DNA片段遷移率，初步判斷是

否有外源DNA插入。（二）根據重組DNA的結構特征進行篩選

1、重組DNA的快502、限制性內切酶圖譜進行分析

限制性內切酶進行酶切，

凝膠電泳分析是否有外源DNA

的插入。

2、限制性內切酶圖譜進行分析

限制性內切酶進行51（三）分子水平檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因提取受體生物全部DNA適當限制酶切割DNA片段用同位素標記的目的基因片段雜交顯出雜交帶（表明目的基因已插入）分子雜交技術（三）分子水平檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基52

核酸分子雜交是核酸分析的重要方法，是鑒定重組DNA的最通用方法，

雜交方法適用范圍

菌落印跡雜交檢測細菌體固定在膜上后，

經裂解釋放的DNA

斑點雜交檢測未經凝膠電泳分離的，

固定在膜上的DNA或RNA

原位雜交直接檢測細胞或組織中的DNA或RNA

Southern印跡雜交檢測經酶切、凝膠電泳分離的，

已轉移到膜上的DNA

Northern印跡雜交檢測經凝膠電泳分離的，

已轉移到膜上的RNA

核酸分子雜交是核酸分析的重要方法，是鑒定重組DNA53（二）個體水平例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。（二）個體水平例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，544PCR反應進行鑒定利用引物直接擴增外源基因進行檢測4PCR反應進行鑒定55

肺腺癌β-catmRNA原位雜交法×400

肺腺癌β-catmRNA原位雜交法×40056Smad2mRNA在系膜增生型IgA腎病腎小球的表達原位雜交×200Smad2mRNA在系膜增生型IgA腎病腎小球的57重組子導入、表達與篩選

重組子導入、表達與篩選

58找找看……重組DNA導入的目的是什么？請簡單描述需要被純化掉的對象轉化率是什么？該怎么計算表達？影響轉化率的因素是什么？找找看……重組DNA導入的目的是什么？請簡單描述需要被純化掉59一、重組DNA分子導入宿主細胞什么是轉化（transformation）？將重組DNA分子引入細菌（原核細胞），使其在細菌體內擴增及表達的過程。什么是轉染（transfection）?將噬菌體、病毒或以它們為載體構建的DNA重組體導入真核細胞的過程。一、重組DNA分子導入宿主細胞什么是轉化（transform60基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝611原核細胞的轉化（細菌轉化）1)受體細胞的選擇限制缺陷型:

避免修飾和降解重組缺陷型：

避免重組整合轉化親和型：

較高的可轉化性遺傳互補型：

利于篩選感染缺陷型：

防止感染1原核細胞的轉化（細菌轉化）1)受體細胞的選擇限制缺陷型:62宿主細胞

原核細胞：大腸桿菌

真核細胞：哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞

宿主細胞

原核細胞：大腸桿菌

真核細胞63重組體分子導入原核細胞感受態細菌：細菌表面正電荷增加，細胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收重組體分子導入原核細胞64（1）CaCl2轉化：細菌處于0度，二價陽離子存在的低滲溶液中，細菌膨脹成球形，處于感受態。此時加熱在42度的熱沖擊下進入細胞，在培養基上生長數小時后球形細胞恢復原狀并繁殖。轉化效率為105~106/ug（1）CaCl2轉化：細菌處于0度，二價陽離子存在的低滲溶液65重組子導入和篩選66（2）電擊法（electroporation）：

在高壓脈沖下，細菌細胞表面形成暫時性微孔，重組DNA進入微孔后，脈沖結束，細胞恢復。實驗簡單，不需要制備感受態菌，轉化效率高109~1010/ug（2）電擊法（electroporation）：67[原理]

利用高壓脈沖，在細菌細胞表面形成暫時性的微孔，重組DNA從微孔中進入，脈沖過后，微孔復原，在豐富培養基中生長數小時后，細胞增殖，重組DNA得到大量復制。

[原理]

利用高壓脈沖，在細菌細胞表面形成暫時性的微683）轉化率：DNA分子轉化宿主細胞獲得轉化子的效率什么叫轉化子？導入外源DNA分子后能穩定存在的宿主細胞什么叫重組子？導入的外源DNA為重組DNA的轉化子

3）轉化率：69表達方式：A、轉化子數/用于轉化的DNA分子總數B、轉化子數/宿主細胞總數計算示例，見書132頁表達方式：70影響因素：重組DNA：分子量小，轉化率高；親和性強的質粒載體轉化率高；ccc質粒DNA載體轉化率高受體細胞轉化方法：電擊法轉化率最高；氯化鈣法次之影響因素：71（1）農桿菌轉化法2、導入植物細胞基因槍法（1）農桿菌轉化法2、導入植物細胞基因槍法72基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因導入活細胞的一種轉化技術。（二）基因槍介法基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因導73優點：（1）無宿主限制?？梢詫θ魏位蛐筒牧线M行轉化研究；(2)靶受體幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細胞。（3）易于操作。缺點：如轉化頻率低、結果的重復性差，易導致基因沉默，實驗成本較高等。（二）基因槍法優點：（1）無宿主限制。可以對任何基因型材料進行轉化研究；(743、導入動物細胞顯微注射技術含目的基因的表達載體動物受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動物輸卵管或子宮轉基因動物顯微注射分裂分化移植發育3、導入動物細胞顯微注射技術含目的基因的表達載體動物受精卵含75脂質體法重組體脂質體受體細胞脂質體法重組體脂質體受體細胞76含有目的基因的重組宿主細胞（如細菌）可以通過規模化的基因工程生產目的蛋白（如激素）含有目的基因的重組宿主細胞（如細菌）可以通過77找找看……基因表達系統有哪些？基因表達系統應該具有什么條件？重組子篩選的意義是什么？有哪些方法可以用來篩選重組子？找找看……基因表達系統有哪些？78最佳的基因表達體系：⑴目的基因的表達產量高;⑵表達產物穩定;⑶生物活性高;⑷表達產物容易分離純化。第一節基因的表達系統與表達策略最佳的基因表達體系：第一節基因的表達系統與表達策略79宿主細胞的選擇一、適合目的基因表達的宿主細胞的要求:1、容易獲得較高濃度的細胞；2、能利用易得廉價原料；3、不致病、不產生內毒素；4、發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；5、容易進行代謝調控；6、容易進行DNA重組技術操作；7、產物的產量、產率高，8、產物容易提取純化。宿主細胞的選擇一、適合目的基因表達的宿主細胞的要求:80二、宿主細胞分為兩大類：1、原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；2、真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。二、宿主細胞分為兩大類：81大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。優越性：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調控機理已有了深刻了解。②有各類菌株和載體系列。③目前以實現多種基因的高效表達。表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等。④易培養，成本低。大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。82缺點：①大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。②因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性復性才恢復活性。③蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基。④其內毒素很難除去。

缺點：83酵母

酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達。酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基84重組子的篩選和鑒定重組子的篩選和鑒定85（一）根據載體的性狀變化進行篩選1根據載體的抗藥性標記進行篩選（一）根據載體的性狀變化進行篩選1根據載體的抗藥性標記進行86載體上的抗藥基因：抗氨芐青霉素基因抗四環素基因抗卡那霉素基因等凡是轉入了載體的細胞都獲得了這種抗藥性，可以在平板上生長菌落。載體上的抗藥基因：凡是轉入了載體的細胞都獲得了這種87

當帶有完整抗藥性基因的載體轉化無抗藥性細胞后，凡轉入載體的細胞都獲得了抗藥性，能在含有相應藥物的瓊脂平板上生長成菌落，而未被轉化的宿主細胞不能生長。

當帶有完整抗藥性基因的載體轉化無抗藥88重組子導入和篩選89重組子導入和篩選902根據載體抗藥性插入失活選擇

2根據載體抗藥性插入失活選擇

91根據載體抗藥性標志插入失活選擇

含有兩個以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個基因，并導致這個基因的失活，就可用兩個含不同藥物的平板，互相對照，篩選含重組DNA的菌落，這就是插入失活效應。根據載體抗藥性標志插入失活選擇

含有兩個以上的抗92重組子導入和篩選93重組子導入和篩選94重組子導入和篩選95外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重組DNA空載體不含有載體或重組DNA外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重組963-半乳糖苷酶系統3-半乳糖苷酶系統97β-半乳糖苷酶系統

載體：pUC、pGEM系列載體等

帶有一個來自大腸桿菌DNA的短序列，其中含有編碼β-半乳糖苷酶（β-galatosidase）基因（LacZ基因）的調控序列和N端146個氨基酸的編碼序列，在編碼序列中插入了一個多克隆位點，但不破壞閱讀框架，不影響功能。β-半乳糖苷酶系統

載體：pUC、pGEM系列載體等98

當這種載體轉入的宿主細胞是含有β-半乳糖苷酶C端編碼序列時，此酶的N端序列和C端序列可以互補（成為α互補），產生具有酶活性的蛋白質（β-半乳糖苷酶），從而使宿主細菌在含有IPTG,X-gal的培養基上呈藍色。

當多克隆位點有外源DNA片段插入時，破壞此酶的N端閱讀框架，產生無α互補功能的N端片段，因此在帶有外源DNA片段的細菌在含有IPTG/X-gal的培養基上呈白色。

當這種載體轉入的宿主細胞是含有β-半乳糖苷酶C端編碼99LacZ基因-半乳糖苷酶在X/gal培養基上呈現蘭色X-galX(發色底物)+gal(半乳糖)

-半乳糖苷酶LacZ基因-半乳糖苷酶在X/gal培養基上呈現蘭色X-g100重組子導入和篩選101重組子導入和篩選102重組子導入和篩選103重組子導入和篩選1044根據外源性DNA片段性狀進行篩選根據外源基因可能表達的蛋白質對缺乏該蛋白的細菌的影響4根據外源性DNA片段性狀進行篩選105

如果外源性DNA片段可編碼產生蛋白質，并且該蛋白質為細菌生命活動所必需，可利用該蛋白質的性狀進行篩選。

如亮氨酸是細菌生命活動所必需的，當外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因時，將該外源性DNA片段轉入亮氨酸缺陷的細菌中，放入僅含亮氨酸的培養基中，只有能利用亮氨酸的細菌才能生長，因此，能生長的細菌即為含有外源性DNA片段。

如果外源性DNA片段可編碼產生蛋白質，并且該蛋白106（二）根據重組DNA的結構特征進行篩選

1、重組DNA的快速裂解、鑒定

初步篩選方法，根據重組DNA大小和載體DNA大小之間的差別來區分的。

瓊脂糖凝膠中進