第十六章基因診斷第一節概述一、

什么是基因診斷所謂基因診斷，就是在基因水平上對疾病或人體的狀態進行診斷，它包括產前診斷，是一種新的臨床診斷方法。是以DNA和RNA為診斷材料，利用分子生物學技術，通過檢查基因的結構或表型來診斷疾病的方法和過程；其臨床意義在于能檢測DNA或RNA的結構變動與否，量的多少及表達情況等，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診或進行基因治療的依據。第十六章基因診斷第一節概述1二、基因診斷的概念界定以下6個方面內容：

（一）診斷水平基因水平（二）診斷技術從方法學來說，沒有特殊的基因診斷方法，就是分子生物學技術在臨床上的應用。

（三）診斷材料DNA和RNA。（四）診斷內容1、對于內源性基因來說：基因結構和表達是否異常。2、對于外源性基因來說：入侵基因的種類，是病毒核酸、細菌質粒還是寄生蟲DNA.

（五）診斷途徑

1、直接檢查基因結構是否存在：DNA點突變、缺失插入、基因重排、染色體畸變、mRNA剪接缺失錯位或結構變化等。

2、檢查基因轉錄產物mRNA：1）已經轉錄還是沒有轉錄？2）應該轉錄還是不應該轉錄？3）

轉錄正常、過量還是過少？3、檢查基因表型：正常還是異常，進行分析研究。

（六）診斷目的1、

確診相應疾病或得出相應結論。2、

是防治疾病或基因治療的根據。二、基因診斷的概念界定以下6個方面內容：2三、基因診斷的思路（一）基因是隨便能診斷的嗎？總不能亂診斷吧？（二）基因診斷和傳統的疾病診斷方法有什么區別和聯系？（三）基因診斷的理論基礎和技術能不能診斷診斷學基礎怎樣診斷？為此，作下述討論。希望對大家有所幫助。三、基因診斷的思路3四、基因診斷方法和傳統的疾病診斷方法

表1表型診斷（傳統方法）基因診斷（一）診斷依據疾病表型變化基因結構異常和表達異常（二）分類臨床診斷（病因、病解、病生）DNA診斷血清學診斷RNA診斷生化學診斷（三）特異性表型改變在很多情況下是非特以探測基因為目標，只要異性的，往往難以明確診斷，有特異性探針，利用分子延誤病情如FOU?雜交原理即可診斷，具有很高的特異性。

（四）敏感性探針可用“放標”或“非放診斷靈敏度高，標本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期診斷因為表型改變往往出現較晚，在表型改變之前，基因難以早期診斷結構或表達已發生改變，故往往可以早期診斷。

四、基因診斷方法和傳統的疾病診斷方法4（六）基因診斷范圍廣因為：①探針可為任何來源和種類，序列可為已知或未知，目標可為特定基因或特定基因組合，外源性或內源性基因，所以適應性強，診斷范圍廣。②被檢查基因是否處于活化狀態并不重要，故可對分化階段表達特異性基因及其異常進行檢測和診斷，這對腫瘤（如CML）療效及預后尤為重要。③在感染性疾病的診斷，能檢查正在生長或潛伏病原體，能明確既往感染或現行感染，對不易診斷（如產毒性E.coli）和不能安全培養（如立克次體）進行基因診斷，擴大了實驗室診斷范圍。（六）基因診斷范圍廣5（七）二者關系1.基因診斷必須建立在臨床一般檢查的基礎上，它必須是臨床檢查的第二步或第三步手段。（不是隨便診斷）2.基因診斷是分子生物學和醫學遺傳學發展到今天人們的一種設想，現在逐步走向臨床，變成現實。3.盡管實驗研究和臨床應用技術原理相同，但診斷對象是人的時候應該慎重！（不能亂診斷）4.同臨床診斷一樣，忌不獨立思考，人云亦云（舉例）。（七）二者關系6

細胞膜

細胞核DNAmRNA轉錄翻譯（protein）臨床表現基因診斷生化診斷血清學診斷臨床診斷圖一基因診斷與表型診斷細胞核7（五）基因診斷與診斷學（一）診斷是用醫學科學的方法對疾病的表現所作出的辯證邏輯的結論。診斷目的：為了防御疾病和進健康。（二）診斷學是論述診斷疾病的基本原則和方法的一門課程。其基本原則就是研究癥狀體征發生的基本規律和機理以及建立診斷的思維程序。基本診斷方法包括：詢問病史、體檢、實驗室檢查、以及其他檢查如：心電圖、超聲檢查、內窺鏡、CT、核磁共振等等。（三）基因診斷是診斷學的續寫，是診斷學的新篇章，從這個意義上來說：基因診斷遵循診斷學的基本原則；基因診斷的基礎是醫學基礎，專業基礎是醫學分子生物學和醫學遺傳學，不同的是我們在基因水平上，學習和研究：基因解剖（結構）、基因生理（轉錄翻譯等）、基因病解（結構異常），基因病生（表達異常），然后主要應用分子生物學技術手段進行基因診斷。（五）基因診斷與診斷學8（六）基因診斷的思維程序：第一套：逆向遺傳學（reversegenetics）思維程序1.

提取人類基因組（總）DNA；2.建立DNA文庫（DNABANK）；3.克隆任一DNA片段作為探針。4.確立該探針在基因組中的位置；這種探針在基因組中的位置一旦被確定下來，就可以成為遺傳標記（geneticmarker）.5.大量應用此類新的遺傳標記(用染色體步移法或染色體跳躍法)建立各條染色體的連鎖基因圖譜，最終建立整個人類的基因圖譜。6.篩選遺傳病病人或疑有與基因有關的疾病的病人；7.克隆病變基因8.比較正常基因和異常基因的差別推測正常異?；虍a物（蛋白質）在細胞中定位以及生理病理效應。（六）基因診斷的思維程序：9第二套拿來主義1.您診斷/研究的疾病是否：與/有/知道1）基因有關；2）該基因的正常/異常序列；3）該基因結構/表達異常的類型；4）特異性探針/PCR引物；5）轉錄物；6）表達產物/表達產物功能/表達產物功能測定方法。2.

據1設計基因診斷方案。第二套拿來主義10第二節基因診斷的分子生物學基礎一、基因診斷的理論（一）生物大分子結構和功能（二）基因組結構和功能（三）遺傳信息的復制和表達（四）基因表達的調控（五）細胞通訊與細胞信號轉導的分子機制（六）癌基與抑癌基因（七）基因與疾病第二節基因診斷的分子生物學基礎11二、基因診斷的技術

（一）核酸分子雜交，在這些方法中，1.Southern印跡法是最經典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進行定位和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。2.Northern印跡法可用于組織細胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析。3.斑點雜交

可用基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。4.原位雜交

可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷；原為雜交的結果是顯示有關核酸序列的空間位置情況，因此可檢出含核酸序列的具體細胞，細胞的具體定位，數目和類型，可檢出基因和基因產物的亞細胞定位。二、基因診斷的技術12(二）聚合酶鏈式反應（PCR）PCR技術在基因診斷中已得到廣泛應用。在應用中，PCR常與其它技術如分子雜交，限制酶酶譜分析，單鏈構象多態性檢測，限制性片段長度多態性分析，DNA序列測定等聯合應用。（三）單鏈構象多態性

單鏈構象多態性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）檢測是一種基于單鏈DNA構象差別來檢測點突變的方法，常與PCR聯合應用，稱為PCR—SSCP技術。(二）聚合酶鏈式反應（PCR）13（四）限制酶酶譜分析基因突變可能導致基因上某一限制酶位點的丟失或其相對位置發生改變，以此酶消化待測DNA和野生型對照DNA，通過比較二者的酶切片段的長度、數量上的差異就可判斷待測DNA的突變情況。（五）DNA序列測定DNA序列測定是進行基因突變檢測的最直接、最準確的方法，可以確定突變的部位的突變的性質。（六）DNA芯片技術應用DNA芯片，可以檢測基因的結構及其突變多態性，對基因表達的情況進行分析。（四）限制酶酶譜分析14三、基因診斷的內容

（一）基因結構異常（基因突變檢測）１、點突變1）已知的點突變2）未知的突變2、少數核首酸的缺失或插入3、大片段丟失或插入4、基因重排（染色體易位）5、基因擴增（二）基因表達異常（基因轉錄物探測）1、mRNA相對定量2、mRNA絕對定量3、mRNA長度分析（三）連鎖分析（了解內容）1、限制性片段長度2、性家系連鎖分析3、連鎖不平衡（四）病原體的診斷入侵基因的種類三、基因診斷的內容（三）連鎖分析（了解內容）15四、基因診斷的途徑（一）內源性基因診斷的途徑主要有3種：即：基因突變的檢測mRNA的探測連鎖分析采取哪一條途徑主要取決于：對致病基因及其分子病理學的了解程度；致病基因本身突變類型的復雜性。四、基因診斷的途徑16（二）外源基因的入侵的病原體的診斷1.入侵基因組DNA具有特異的DNA序列，以區別于別種生物體DNA序列。2.能把這種特異的DNA序列制成具有特定信號的探針。五、基因診斷的基本方法（一）點突變

1、已知點突變PCR/ASO探針斑點（或缺縫）雜交法（1）據突變（位點序列：）a.設計一對引物，b.合成一對寡核苷酸探針（正常/突變序列雜合子）（2）提取患者基因組（總）DNA→PCR擴增（突變序列）DNA片段→（與ASO）斑點（或狹縫）雜交洗脫條件：完全配對（牢）不洗脫；不完全配對（不牢）易洗脫。（二）外源基因的入侵的病原體的診斷17（3）結果分析：①與正常探針雜交，而不和突變探針雜交表示受檢者不存在這種基因；②只與突變探針雜交，說明突變基因是純合子；③與正常/突變，探針都可雜交，說明突變基因是雜合子；④與正常/突變探針都不雜交說明不是已發現的突變。2、未知點突度SSCP—PAGE法、測序法

提取DNA→DNA變性→SSCP—PAGE→測序確證（二）少數較苷酸缺失或插入的診斷方法可以用（一）的方法（3）結果分析：18

（五）基因擴增限制酶酶切待測基因的DNA或CDNA片段作為探針（位置改變）法光密度掃描（定量）?；驍U增→拷貝數增加（分子量）→電泳行為改變→雜交條帶位置改變→與標準/正常對照定性/量掃描。（四）基因重排（染色體易位）多次/重PCR電泳分析、其前提是已知重排基因和重排位點的序列。（三）大片段丟失多次多重失PCR電泳分析設計引物使獲得產物序列長短不同，有固定大小，據不同長短序列存在與否，檢測是否有某些基因片段的缺失與突變（注意正常對照）。5′3′引物1引物3致病基因引物4引物25′3′引物1引物3（四）基因重排（染色體易位）多次/重PCR電泳分析19（六）多態性分析

1、RFLP（１）基本方法：①PCR產物酶切產物電泳分析。②基因連鎖分析（PCR/RFLP連鎖分析法）。人群個體核苷酸序列的差異性、稱為DNA的多態性。由此影響限制酶切部位點而致RFLP（限制性片段長度多態性）。RFLP按照孟德爾方式遺傳。故：①可檢測人群中個體間存在的RFLP（限制酶酶譜分析）②遺傳病的基因診斷（連鎖分析）。如果一特定家庭（系）中，某一致病基因與特異性的多態性片段緊密連鎖（連鎖—是指同一條染色體上相鄰近的基因一起被被遺傳），就可以用這種多態性片段作為“遺傳標志”，來判斷家庭成員或胎兒基因組中是否攜帶有致病基因。對于某一限制酶來說：酶切位點在人群中存在共性（可能一樣對核酶譜來說存在多態性（不一樣）。（２）DNA多態性位點普遍存在整個人類基因組，估計每100個核苷酸便有一個發生突變，出現多態性。如果建立起一套以20CM間隔平均分布于整個基因的RFLP位點，選用合適的探針，理論上可以對所有的遺傳病進行基因診斷。（六）多態性分析20（3）關于基因連鎖分析①多數遺傳病診斷途徑，因為：經基因突變檢測途徑，適用病種有限，原因是：a、致病的基因可在任何位點上產生突變，致使同一疾病有不同的突變類型。b、不少致病基因僅僅知道在哪一號染色體位置，尚未克隆出來，對其結構和分子機制毫無能知。c、有的致病基因尚未確定。

②基因連鎖分析必須具備的先決條件：a、家系中的關鍵成員（父母）為RFLP的雜合子，才能區分兩條同源染色體。連鎖遺傳病只要母親為某一RFLP的雜合子即可。b、子代存在患病的純合子，這樣才能確定致病基因與哪條染色體RFLP共同遺傳。c、任何一種遺傳病、單獨使用一種RFLP、均有相當一部分父母染色體無法區分、所以要聯用若干種RFLP及相當探針，提交診斷。d、待檢親代必須為生物學意義親代。（3）關于基因連鎖分析21③連鎖不平衡并不多見：指某一個多態性位點在基因和等位突變基因中的分布頻率有顯著差異。因此可用與特異等位基因連鎖這一多態性進行基因診斷。如：正常人酶切圖譜有9/9、22/9、22/22kb型，β-地貧純合子只有9/9kb型（kan發現撕工島人β-珠蛋白基因3’BamHI的多態性位點）故不經家系分析，僅以這一多態性即可用產前診斷。④RFLP連鎖分析可能常是可靠的。連鎖分析存在一定的錯誤原因是：a、人為差錯。b、RFSP連鎖分析方法本身的差錯程度（方法本身局限性。）因為在減數分裂中間傳染色體的某些區域可以發生重組和交換，從而使得原先共同遺傳的DNA突變與RFLP發生分離，這樣情況下作出連鎖分析結果就會發生錯誤。診斷的錯誤率可以從DNA標志與疾病的共同遺傳度來估計，重組率高于5%的連鎖探針不宜采用，事實表明，除個別情況外，由于染色體重組所致的錯誤診斷小于1%，因此，RFLP連鎖分析通常是可靠的。③連鎖不平衡并不多見：222、微小重復序列（如CA序列）多態性分析。（１）基本方法：PCR/PAGE家系分析法（教材P146）。①重復單位和重復次數不同具有高度的遺傳多態性，對他們和等位基因進行家系分析，說明他們遵照孟德爾遺傳規律、是一套新的遺傳標記系統（２）應用舉例：產前基因診斷杜氏肌營養不良（突變類型未明）。2、微小重復序列（如CA序列）多態性分析。23（七）基因表達異常的診斷。1、mRNA相對定量（1）點雜交（或狹縫雜交）光密度掃描法；（2）RT—PCR；2、mRNA絕對定量RT—PCR/競爭性PCR3、mRNA長度分析Northern雜交法，RT—PCR產物電泳分析（八）病原體的診斷PCR法第十六章基因診斷課件24第三節基因診斷的應用一、遺傳病的基因診斷（一）血紅蛋白病血紅蛋白病是由于血紅蛋白合成異常所致的遺傳性血液病。習慣上分為異常血紅蛋白病和地中海貧血２類。1.異常血紅蛋白病是珠蛋白肽鏈結構的改變變導致主要功能部位氨基酸的置換，影響Hb的溶解度、穩定性及生物學功能。分子基礎：單堿基替代，缺失、插入……

２.地中海貧血（α地中海貧血和β地中海貧血）是珠蛋白合成速率降低，導致鏈和非鏈合成的不平衡→多余的珠蛋白鏈沉積在Rbc膜上→改變了膜的通透性和硬度→導致溶血性貧血。第三節基因診斷的應用254.診斷要求HbPunjabα地中海貧血（α珠蛋白合成↓）β地中海貧血（β珠蛋白合成↓）占我國新疆異常Hb病55.6%（1）產前診斷為主要目的。每一民族或群體有特突變類型譜中國人主要突變類型有6種（P30）分子基礎Hbβ鏈121密碼單個堿基替代：GAA（Glu)→CAA（Gln）→改變了EccRI一個識別位點大多數是α珠蛋白基因缺失所致。點突變、缺失或插入往往不涉及限制酶識別位點。DNA診斷：PCR擴增（β珠蛋白第3個外顯子和基因3′端DNA序列、全長144bp）EcoRI酶切電泳分析。（3）液體分子雜交C1限制酶譜分析，或PCR擴增電泳分析PCR/ASO探針法（主要方法）結果正常對照40/104bp兩個片段HbPuNJob144bp,40/104bp兩種類型雜合子（同理擴增β珠蛋白DNA片段MnlI酶譜分析診斷HbE（β26Glu→Lys))正常對照有正常雜交信號（C1）酶切片段不缺（C2）PCR產物有（C3）α地貧與正常結果反之。PCR/RFLP連鎖分析法RNA診斷：異常Hb病人mRNA的RT/PCR產物測序知編碼區堿基變化—推導相應氨基酸變化。RT-PCR介導的α珠蛋白mRNA定量↓。①PCR介導的mRNA定量法。②mRNA的剪切缺陷檢測（自學）4.診斷要求HbPunjabα地中海貧血（α珠蛋白合成↓26（二）杜氏肌營養不良癥（DMD）和貝克營養不良癥（BMD）

1.DMD和BMD是常見的性連鎖隱性遺傳病，2.主要特征是進行性肌萎縮和腸肌假性肥大，XP21.21—21.3區抗肌萎縮蛋白基因突變形式不同。DMD多在5歲發病，在20歲左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其發病率為活產男嬰的1/3500。BMD癥狀較DMD為輕，壽命較長，并有生育能力，發病率為1/30000。3.分子基礎：抗肌萎縮蛋白基因內（1）DNA片段缺失（60%的病例→導致閱讀框移碼→移碼實變→致DMD，整碼缺失→BMD）。（2）部分重復（病例的5%）（3）缺失或重復的2個熱點區①該基因5’端處②45~55外顯子范圍內。（二）杜氏肌營養不良癥（DMD）和貝克營養不良癥（BMD）274.DMD、DNA診斷因DMD（及BMD）大多數為基因缺失所致，該病DNA診斷主要是抗肌萎蛋白基因缺失的檢測。診斷技術：（1）基因組探針法用XP21區分離得到的不同探針如（P20）來接進行相應內切酶酶譜分析、檢出率取決于探針數和酶切位點數目。（2）cDNA探針法抗肌萎縮蛋白基因系列cDNA探針分析患者基因缺失、外顯子拼接改變和基因內部分重復。（3）多重PCR法如有人設計多對引物進行多重PCR擴增該基因的9個易發缺失“熱點區”DNA片段，可檢出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多態性分析法基因內及其旁側探針進行RFLP連鎖分析或CA多態性分析適用于非缺失型DMD。5.DMD、RNA診斷：診斷技術RT—PCR擴增該基因外顯子（全長2.4MB、外顯子起來全長c14kb、用多對引物）可檢出：外顯子拼接異常。聯用測序：可定位基因缺失的起始和終止。4.DMD、DNA診斷因DMD（及BMD）大多數為基因缺失所28（三）苯酮尿癥（PKU）

1、苯尿癥是一種常見的隱性患傳性氨基酸代謝病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→兒茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患兒出生后須及早得到低phe飲食治療，否則發生不可逆大腦損害和嚴重智力發育障礙。3、分子基礎：（1）迄今約3/4的導致中國人經典型重PKU的突基因已被查清，它們分屬11種基因PAH基因點突變。體外研究表明，這些突變導致PAH活力↓或喪失。（2）PAH第11外顯子的第399密碼GTA（val）→GTT（val）中性突變：①不改變任何限制酶識別位點，故又稱“序列多態性”。②這一“序列多態性”在PKU患者和正常人中存在著連鎖不平衡性，故可作為一種“遺傳標記”應用于產前診斷。苯丙氨酸羥化酶↓（肝、PAH）（三）苯酮尿癥（PKU）苯丙氨酸羥化酶↓（肝、PAH）294、DNA診斷：①PCR/ASO探針法。若待診斷的PKU家系的基因突變類型尚屬“未知”或無RFLP信息。②PCR/SSCP—直接則序法→不定期出導PKU的點突變。5、序列多態性連鎖分析前提是該家系存在述第399密碼子序列多態性用于產前診斷：（不知基因實變類型，也無RFLP信息。）病案—某孕婦曾生育一例PKU患者，現妊娠第二胎8周，要求對胎兒進行產前診斷。診斷：（1）PAH基因的RFLP分析：該家庭除ECORI外，其它酶切點都不具有雜合性，而丈夫、患兒、孕婦、胎兒雙均為ECORI11/17kb片段的雜合子，因此胎兒可能正常，可能為PKU患者。據RFLP分析無法對胎兒作出產前診斷（為什么？缺乏基因連鎖分析先決條件。（2）序列多態性：PCR/ASO探針DNA片段點雜交法。①PCR擴增父親、孕婦/患兒、胎兒PAH基因片段。②合成ASO（相應于第399密碼子中性實變序列的一對等位基因的特異ASO探針。③雜交：說明：①患兒擴增DNA片段與正常/中性突變ASO探針雜交;②父親;③胎兒擴增a、患兒的1個PKU，基因與密碼子399A→T中性突變相偶（連鎖），這個PKU基因來自母方。a.孕婦。b、胎兒沒有這一中性實變，可以排除胎兒為PKLL患者，結合ECLRI位點RFLP資料，可產和的診斷胎兒完全正常。c、胎兒出生后基因分析和隨方證實診斷正確。DNA片段中能與正常的ASO探針雜交。4、DNA診斷：①PCR/ASO探針法。若待診斷的PKU家系30四、血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，由于正常凝血過程中血漿凝血的活力有缺陷所致?；颊叱Ｒ虺鲅恢够蚶^發病而夭折，治療主要靠替代療法，輸入缺乏的血漿因子。重型血友病甲和乙的男性發病率為1/5000~1/50000。為甲型血友病和乙型血友病。

主要特征：①是一組X連鎖遺傳凝血缺陷疾病。②缺乏Xq遠端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突變具極為異質性，與β地貧不同。（因子占X染色體全長0,1%，共186kb包括26個外顯子）不存在存族和群體特異性，幾乎每一種不同的甲型血友病家系都具有自已獨特的突變類型。（所以該病基因診斷不宜用PCR/ASO探針直接檢測點突變，而主要依賴RFLP連鎖分析）①也是X連鎖遺傳的凝血缺陷疾病。②約1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替代療法過程中會產生FIX的抑制物）。③在非缺失（FIX基因）型中，已發現398種不同的基因突變。（FIX基因定位在Xq26→q27，全長34kb包括8個外顯子）。四、血友病①是一組X連鎖遺傳凝血缺陷疾病。31①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鑒定了FIX基因的5個限制者多態性位點，故可用RFLP連鎖分析進行產前診斷和攜帶者檢測。②病倒：乙型血友家系分析FIX基因發現某患者缺失該基因5kbDNA序列（第2~3外顯子+第2內含子全部+部分第1，第3內含子）a、對該家系一例乙型血友病變高危妊娠產前基因診斷，診斷胎兒為男性乙型血友病患者。b、對該孕婦第二胎產前診斷為女性乙型血友病基因攜帶者。（上海醫遺傳所淅江乙型血友病家系）4、診斷情況（報道）：①應用克隆化FⅧcDNA與VIII基因連鎖DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁側的限制酶酶切位點多態性，并采用PCR/BCLI或XbaIRFLP連鎖分析法進行了甲型血友病的產前診斷和攜帶者檢測。②用PCR/SSCP法檢查了FVIII內含子18處BCLI的多態性。（終止妊娠對胎兒作凝血子測定和DNA分析、證實產前診斷正確。）①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鑒定了FIX基因的5個32類別基因特征診斷方法1、病毒性肝炎①甲型肝炎（HAV）①甲肝病毒基因是線狀分子、約含于7500個核苷酸。②已獲HAV幾個毒株cDNA克隆。①CDNA探針雜交（RNA）法。②SSRNA探針雜交（RNA）法有報道。②乙型肝炎（HBV）①HBVDNA約3.3kb，是非共價閉合的環狀結構。①PCR斑點雜交法。②PCR電泳EB染色法③丁型肝炎（HDV①HDV基因為環狀SSRNA長約1678個核苷酸①DNA或cDNA探針雜交（RNA）法②RT/PCR單抗ELISA法2、細菌引起的疾病（1）產毒性Ecoli、侵襲性Ecoli;(2)霍亂弧菌；（3）痢蒺桿菌；（4）淋球菌基因診斷用PCR擴增斑點雜交法。3、瘧疾、寄生蟲基因診斷用PCR或結合探針技術。二、傳染病的基因診斷類別基因特征診斷方法1、病毒性肝炎①甲肝病毒基因是線狀分33三、腫瘤的基因診斷（一）基因重排的生理和病理基因重排—指某些基因片段改變原來存在的順序，通過調整有關基因片段的連接順序，再重排為一個完整的轉錄單位1.生理（1）基因表達DNA水平的調控方式之一。（2）免疫球蛋白分子多樣性的分子機理之一。2.病理重排和重組位點之間DNA片段移除，會使在恒定區兩側的某些限制酶切位點的位置發生改變。可用：（1）限制性片段長度改變；（2）分子雜交（恒定區域連接區基因為探針）。確定基因重排的存在與否，以對腫瘤進行基因診斷。三、腫瘤的基因診斷34免疫球蛋白重鏈基因探針（J）和輕鏈基因探針（k，入）對B細胞淋巴瘤DNA的雜交圖譜。說明：1、正常對照2、B細胞淋巴瘤，入基因無重排，重排后雜交端的位置實驗：提取瘤細胞DNA→酶切（至少2組以上）雜交（至少兩種以上）→結論（看到2組以上的雜交圖譜改變時，即可下診斷結論）。12J1212k入（二）基因內部重排與B細胞淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因探針（J）和輕鏈基因探針（35（三）基因間重排（染色體易位）淋巴樣腫瘤細胞的染色體易位癌基因腫瘤染色體易位發生頻率C-myc……………………bc1-2囊性淋巴瘤t（14;18)(q32;qI1)85%……兩個重要事實：1、囊性淋巴瘤染色體易位頻率最高；2、所有易位都涉及到C-onc的易位。這對于診斷，分型和預后具有重要的意義。（三）基因間重排（染色體易位）361.圖：22號染色體和9號染色體易位導致慢性粒細胞白血?。–ML）易位結果22號染色體長臂丟失，形成微小的ph（費城首次發現的）染色體。（CML中90—95%的病例具有ph染色體）。（四）基因重排與CML的診斷9229q+22q-1.圖：22號染色體和9號染色體易位導致慢性粒細胞白血病（C372.說明：1.ph染色體是染色體易位t（9;22）2.C-oncC-ab和c-sis分別位于第9號和第22號染色體長臂上，易位涉及到兩個癌基因的互換（基因間重排，但通常不涉及它們的基因內部重排，故一般認為重排后它們的基因結構并無改變）。3.CMLDNA分子中最具有結構特點并可以用于診斷的序列區域是bcr，研究發現，第9號染色體斷裂點位置變化很大，多半出現在c-abl5’端100kb區間內；第22號染色體斷裂點較集中，基本上存在于一個5.8kb區域內。這個區域叫斷裂點簇區即bcr。4.CML發生染色體易位時，先在各自的斷裂點處斷開，然后進行基因間重排，使c-abl/bcr形成融合基因，此基因可轉錄和翻譯自己特異的mRNA和蛋白質。5.為了準確測定bcr重排，須：①選擇適當的探針；②選擇兩個以上的限制酶酶解產物作雜交分析。③CML具有bcr重排（多數）和bcr未重排型（少數）④Bcr重排等同ph陽性；⑤Bcr重排與CML緩解期復發有正性關系，與預后有關系，與ALL，AML有關系。PCR技術檢測bcr/abl轉錄產物也可用作CML的診斷，預后和判斷治療效果等用途。2.說明：38（五）腫瘤異質性的分子基礎：基因表達圖譜分析用于腫瘤分類分期（六）基因擴增與乳腺癌的預后（七）原位雜交技術在腫瘤病理診斷中的應用（自學）。四、基因診斷方法在法醫學上的應用（一）DNA指紋（基因指紋）

概念——在人體基因組DNA中存在高度可變的小衛星區域，在同一酶解物的Sou-thern印跡圖上同一個體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個體特異性一樣，這種southern印跡圖被稱為DNA指紋。（五）腫瘤異質性的分子基礎：基因表達圖譜分析用于腫瘤分類分期391.Jeffreys據珠蛋白基因座近處出現的RFLP頻率及測定的核苷酸總數，推算出人基因的異質性是非常大的，約100bp中就有一個差異，但并不完全均一，有的順序（核心序列）比較穩定，有的區域變動很大（超變區）它們都是一些很短的重復順序。2.對這些重復順序酶切時，可產生16，17、32、33、3F、4、62和3F6bp長度不等的限制性片段。3.人工合成很短的重復序列作為探針，與酶切的人體DNA作southernblot，可得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數目和分子大小，幾乎不可能有兩個人是完全相同的，因此，把這種雜交圖形稱為DNA指紋，它是基因特異診斷有力的根據。4.DNA指紋按孟德爾方式遺傳。（二）DNA指紋分析在法醫學的應用于個體識別和親子鑒定。1.Jeffreys據珠蛋白基因座近處出現的40自測題一、單項選擇題1、1976年簡悅威采用液相DNA分子雜交技術在世界上首次完成了（）A、α－地中海貧血的基困診斷B、β－地中海貧血的基困診斷C、血紅蛋白病M的基因診斷D、瘧原蟲的基因診斷2、基因診斷是在基因水平上對疾病或人體的狀態進行診斷，它包括（）A、血清學診斷B、生化學診斷C、產前診斷D、病理學診斷3、在核酸分子雜交的基因分析方法中，最經典的是（）A、NorthernblotBWesternblotCdotblotD.Southernblot4、聚合酶鏈式反應（PCR）又稱為基因體外擴增，它與基因體內擴增不同的是（）A、反應體系模板不同B、聚合酶輔基不同C、聚合反應方向不同D、反應體系所需溫度差異自測題415、檢測長度相同而構象不同的單鏈DNA需要進行（）A、瓊脂糖凝膠電泳B、聚丙烯酰胺凝膠電泳C、瓊脂粉電泳D、圓盤電泳6、限制酶酶譜分析中，常用的限制酶是指（）A、Ⅰ型限制酶B、Ⅱ型限制酶

C、Ⅲ型限制酶D、Ⅰ型和Ⅲ型限制酶7、限制酶酶切圖譜經常被人們稱作（）A、DNA的遺傳圖譜B、DNA的連鎖圖譜C、DAN的消化圖譜D、DNA的物理圖譜8、核酸序列測定方法始建立于（）A、20世紀50年代初期B、20世紀60年代初期C、20世紀70年代后期D、20世紀80年代后期5、檢測長度相同而構象不同的單鏈DNA需要進行（）429、Sanger雙脫氧末端終止測序法的鏈終止劑是（）A．2、3－二脫氧核糖核苷酸B、2、4－二脫氧核糖核苷酸C、3、4－二脫氧核糖核苷酸D、3、5－二脫氧核糖核苷酸10、20世紀90所代初，適應“后基因組時代”的到來，基因芯片技術率先（）A、在美國啟動B、在日本啟動C、在歐洲啟動D、在以色列啟動11、基因芯片的實質是一種（）A、高密度的單克隆抗體列陣B、高密度的多肽列陣C、高密度的核酸列陣D、高密度寡核苷酸列陣12、對于突變位點已被闡明的一些遺傳病，可以采用基因診斷的方法是（）A、PCR/ASO探針法B、PCR/SSCP/sequencing法C、RT/PCR法D、RFLP分析法9、Sanger雙脫氧末端終止測序法的鏈終止劑是（）4313.α-珠蛋白質基因蔟定位于（）A、6P13.3-Pter，B、17P13.3-Pter，C、18P13.3-Pter，D、19P13.3-Pter，14、α-地中海貧血患者的分子缺陷主要有（）A、2種基因型B、3種基因型C、4種基因型D、5種基因型15、地中海貧血是一種（）A、巨幼紅細胞貧血；B、營養性缺鐵性貧血；C、遺傳性溶血性貧血；D、障礙性貧血16、B-地中海貧血患者的基因缺陷主要有（）A、少數核苷酸的缺失或插入；B、大片段丟失或插入；C、基因重排或染色體易位；D、點突變或閱讀框易位

13.α-珠蛋白質基因蔟定位于（）4417、杜氏肌營養不良癥（DMD）患者基因缺失的主要熱點區位于DMD基因的（）A、起始區；B、尾區；C、中央部位；D、中央部位的內含子區域18、甲型血友病的基因缺陷是（）A、

凝血因子Ⅷ片段缺失，點突變或插入；B、

凝血因子Ⅸ片段缺失，點突變或插入；C、

PAH的嚴重缺乏；D、CK的水平升高19、用基因診斷的方法對感染性疾病進行診斷的主要優點是：A、

診斷過程對人體沒有損傷；B、可以進行病因診斷；C、方法簡便，費用較低；D、可以早期診斷20、目前普遍采用SOUTHERN印跡雜交進行DNA指紋分析，用于法醫案檢工作中的個體識別和親子鑒定，其分子基礎是（）A、

DNA的多態性；B、RNA的多態性；C、蛋白質的多態性；D、氨基酸的多態性17、杜氏肌營養不良癥（DMD）患者基因缺失的主要熱點區位于45二、多項選擇題1、人類疾病的發生常常涉及到（）A、

內源基因的突變；B、外源基因的入侵；C、基因重組；D、姐妹染色體交換2、機體對外源性病原體入侵的防御體現在（）A、整體水平；B、細胞水平；C、分子水平；D、基因水平3、基因診斷的目的是為了（）A、

確診相應的疾病；B、得出相應的結論C、作為防治疾病的依據D、開展基因治療4、從基因診斷的發展史來看，具有代表性的分子生物學技術有（）A、核酸分子雜交；B、PCR；C、DNA芯片技術；D、限制性酶切圖譜分析技術二、多項選擇題465、基因診斷的技術和方法按原理大致可分為（）A、DNA探針技術；B、PCR技術C、DNA探針和PCR結合的技術D、DNA測序技術6、基因診斷的途徑有：A、直接探測基因結構是否存在突變；B、檢測基因轉錄產物mRNA是否表達異常；C、檢測基因表達產物蛋白質結構的變化；D、根據臨床診斷的初步結論進行基因診斷7、對感染性疾病進行基因診斷的分子生物學依據是：A、DNA或者RNA是生物遺傳信息的載體；B、所有生物使用相同的構件分子；C、每種生物大分子在細胞中有特定功能D、每個物種的特性是通過它具有的一套與眾不同的核酸和蛋白質而保持的8、基因突變存在以下共同特點，即（）A、稀有性B、隨機性C、可逆性D、有害性5、基因診斷的技術和方法按原理大致可分為（）479、目前常用的基因探針有（）A、cDNA探針B、基因組探針C、人工合成DNA探針D、RNA探針10、常用的基因探針標記的方法有（）A、地戈辛標記B、生物素標記C、放射性P標記D、放射性35S標記三、名詞解釋1、基因診斷2、

DNA指紋3、RFLP四、答題1、簡述你對基因診斷的概念的理解2、簡述基因診斷的基本途徑3、簡述基因診斷的基本技術和方法4、簡述基因指紋在法醫案檢工作中個體識別與親自鑒定的分子生物學基礎五、

論述題1、試論基因診斷方法與傳統疾病診斷方法的區別與聯系？2、論基因診斷與醫學診斷學的辨證關系3、試論遺傳性疾病基因診斷的思維程序4、試論感染性疾病基因診斷的思維程序9、目前常用的基因探針有（）48參考答案與題解一、單項選擇題1、A、液相雜交是指在溶液中進行的雜交反應，雜交反應后需將雜交分子（雙鏈）與未雜交分子（單鏈）分開，再判斷雜交程度，通常靈敏度較低。1976年簡悅威定成α-地貧的基因診斷為基因診斷的餓發展作出了開創性貢獻。2、C．產前診斷關系到優生優育和胎兒質量。有遺傳病生育夫婦中有一方為常染色體顯性或者父方為X連鎖隱性遺傳病的攜帶者及凡可進行產前基因診斷的疾病，妊娠確立后應在適當時間接受產前診斷。血清學診斷、生化學診斷和病理學診斷均為表型診斷（進一步參考論述題1）參考答案與題解493.Dsouthernblot是經典的核酸分子雜交基因分析方法，其余核酸分子雜交基因分析方法均由此發展或派生而來。4.D核酸體內擴增核酸體外擴增（1）模板DNA或RNADNA或RNA（2）酶DNA聚合酶或逆轉錄酶DNA聚合酶或逆轉錄酶（3）酶的輔基Mg+等Mg+等（4）引物RNADNA（5）PH7.2±7.2±（6）溫度37℃94℃（變性）、55℃（退火）、72℃延伸3.Dsouthernblot是經典的核酸分子雜交基因分505、B．PAGE分辨率高，適合于SSCP分析，瓊脂糖凝膠用于一般核酸電泳，瓊脂粉一般用于細菌固體培養基配制。圓盤電泳是PAG一種古老形式，已逐漸被淘汰。6、B．型限制酶能夠識別DNA分子特異序列，并在該部位切割，故能獲得特異的DNA片段。I型和III型限制酶不具備上述特性。7、D．標明限制酶在DNA分子上的限制位點數限制片段大小以及排列順序的圖譜通常稱為DNA的物理圖譜或者是限制性圖譜，遺傳圖、連鎖圖請參考人類基因組計劃相關知識8、C由 Sanger等開始建立。5、B．PAGE分辨率高，適合于SSCP分析，瓊脂糖凝膠用于519、Aα—脫氧核糖核苷酸分子戊糖環第三位脫氧，則無法與下一個脫氧核苷酸形成3`5`磷酸二酯鍵，多核苷酸鏈無法延伸，故為鏈終止劑。是否存在天然或人工的2、4—二脫氧核糖核苷酸和3、4—二脫氧核糖核苷酸及其作用尚不得而知。核苷酸戊糖環第五位連接磷酸無氧可脫。10、A11、C受人類基因組計劃的促進和計算機芯片技術的啟發，基因芯片技術首先在美國啟動，在對開發利用基因組計劃的研究成果有著深遠的意義。（進一步參考第十五章基因芯片技術）。12、A診斷已知的點突變的遺傳性疾病，可以首選 PCR/ASO探針法，擴增DNA片段與相應ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是化合子還是雜交子。診斷未知的點突變可用PCR/SSCP/SEQUENCING方法，通過確證性測序可以得知點突變的位置。RT/PCR法用于基因表達異常的診斷，RFLP法則適用于多態性分析。9、Aα—脫氧核糖核苷酸分子戊糖環第三位脫氧，則無法與下一5213、A14、B15、C地中海貧血是一種由于珠蛋白合成障礙遺傳性溶血性貧血。其病理機制及巨幼紅細胞貧血，營養性缺鐵性貧血和障礙性貧血進一步參考內科學。16、D17、C18、A19、D內源性基因突變，與基因型改變沒有引起表型改變或不足以引起表型改變或感染性疾病早期，外源入侵基因，不足以引起機體表型變化（如感染量極少），用基因診斷方法則可以進行早期診斷?；蛟\斷屬于病因診斷，但不是其主要優點。診斷是用醫學科學的方法對疾病的表現所作出的辨證邏輯的緒論。臨床診斷過程對人體都有一定的影響?；蛟\斷正逐步走向臨床。20、A1985年Jeffreys等人在人體基因組DNA中發現了高度可變的小衛星區域，在同一酶解物的Southerblot圖上，不同個體之間除非同卵雙生譜帶都不同，原因是小衛星的高可變區形成的DNA的多態性。屬于蛋白質、氨基酸和RNA尚沒有多態性這一說法。13、A14、B53一、

多項選擇題1、

AB人類疾病的發生往往涉及內源性基因突變，如遺傳病和外源性基因入侵，如感染性疾?。毦⒓纳x感染等）。基因重組和姊妹染色體交換是基因“生理”的過程，可能產生疾病，但是從遺傳學上來說是希有事件。2、ABCD機體抵御外源性病原體體現在整體水平，表現為機體調動自身免御系統的整體防御。在細胞水平如Mφ吞噬異物，分子水平則有抗原抗體反應?；蛩絼t表現為限制修飾系統對入侵DNA的水解作用。3、ABCD4、ABC5、ABC6、ABD檢測基因表達產物蛋白質結構的變化屬于表型診斷。基因診斷必須建立在臨床診斷的初步結論的基礎上，不是隨意診斷。AD根據生命狀態基本邏輯原理每個物種都有一套與眾不同的核酸，此為感染性疾病診斷的分子學依據。一、

多項選擇題547、AD據生命狀態基本邏輯原理，每個物種都有一套與眾不同的核酸，此為感染性疾病診斷的分子生物學依據。8、ABCD從遺傳學上來說，基因突變有如下特點：（1）希有性基因突變在任何一種生物都是一種希有事件，對人類來說，其突變頻率約為10-5~10-6/細胞代，細菌為10-7~10-8/細胞代；（2）隨機性基因突變不論對細胞、個體或是對基因或是對基因表型影響的方向來說，都是隨機事件；（3）可逆性基因可以發生正突變，也可發生回復突變，只不過二者頻率不一樣，這意味著只是基因分子結構的改變，并非基因的丟失；（4）有害性大部分基因突變的表型效應都是有害的，人類的各種遺傳病都是在進化過程中經突變而產生的。9、ABCD10、ABC7、AD據生命狀態基本邏輯原理，每個物種都有一套與眾不55三．名詞解釋1、基因診斷(genediagnosis)是在基因水平上對疾病或人體狀態進行診斷的一種新的診斷疾病的方法，它包括產前診斷。2、DNA指紋（DNAfinger--printing）1985年英國學者發現人類基因組中存在高度可變的小衛星區域，在同一酶降解物的Southern印跡圖上同一個體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋一樣具有高度個體特異性，因此這種Southern印跡圖稱為DNA指紋或基因指紋。三．名詞解釋56四．簡答題1．基因診斷的概念界定以下6個方面內容。（1）診斷水平是基因水平，不是分子、細胞、器官或整體水平。（2）診斷技術是分子生物學技術，從方法上來說，沒有特殊的基因診斷方法，就是分子生物學技術在臨床上的應用。（3）診斷材料是DNA或RNA。（4）診斷內容對內源性基因來說，基因結構和表達是否異常；對外源性基因來說：入侵基因的種類，是病毒核酸，細菌質粒還是寄生蟲DNA。（5）

診斷途徑①直接檢查基因結構，是否存在：DNA點突變、缺失、插入、基因重排或染色體畸變；mRNA剪接缺失、錯位、結構變化等。②檢查基因轉錄產物mRNA:a.已經轉錄還是沒有轉錄？

應該轉錄還是不應該轉錄？

轉錄正常，過量還是過少？③檢查基因表型：正常還是異常，進行分析研究。（6）診斷目的①確診相應疾病或得出相應結論。②

是防治疾病或基因治療的根據。四．簡答題572、據臨床診斷的初步結論進行基因診斷，可以：⑴直接探測基因結構是否存在突變；⑵檢測基因轉錄產物mRNA是否表達異常。3、DNA探針技術，PCR技術及DNA探針和PCR結合的技術。4、1985年英國遺傳學家等人在人體基因組DNA中發現了高度可變的小衛星區域，在同一酶解物的印跡土上同一個體的不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個體特異性，因此這種印跡圖稱為基因指紋，是法醫察檢工作中個體識別與親子鑒定的分子生物學基礎。2、據臨床診斷的初步結論進行基因診斷，可以：58五、

論述題1.傳統疾病的診斷方法可以稱為表型診斷。表型診斷與基因診斷的區別如下表型診斷基因診斷診斷依據疾病表型變化基因結構異常和表達異常分類臨床診斷、血清學診斷、 生化學診斷DNA診斷RNA診斷特異性表型改變在很多情況下是非特異性往往難以明診斷延誤病情,如FOU。以探測基因為目標，屬病因診斷，只要有特異性的探針，用分子雜交原理，即可診斷,具有特異性。敏感性難以評估.。探針可用“放標”或“非放標”,診斷靈敏度高，標本只需微量，DNApg水平即可早期診斷因為表型改變往往出現較晚難以早期診斷。在表型改變之前，基因結構或表達已發生改變，故可早期診斷.診斷范圍難以評估原因參下述五、

論述題表型診斷基因診斷診斷依據疾病表型變化基因結構異常59（1）基因探針可以為任何來源，任何種類；序列可以為未知或已知；目標可為特定基因或特定基因組合，或是內源性基因或是外源性基因，所以適應性強，診斷范圍廣。（2）被檢查的基因是否處于活化狀態并不重要，故可對分化階段表達特異性基因及其異常進行檢測和診斷，這對腫瘤（如CMI）療效及預后尢為重要。（3）在感染疾病的診斷，能檢查正在生長或潛伏生長的病原體，既能明確現行感染，又能明確既往感染。對不易診斷（如產毒性大腸桿菌和不能安全培養（如立克次體）者進行基因診斷，擴大了實驗室診斷范圍。（1）基因探針可以為任何來源，任何種類；序列可以為未知或已知602、診斷是用適當科學的方法對疾病的表現所作出辯證邏輯的結論。診斷學是論述診斷疾病的基本原則和方法的一門課程。其基本原則就是研究癥狀，體征發生的基本規則和機理，以及建立診斷的思維程序?；蛟\斷是診斷學的讀寫。從這個意義上來說基因診斷遵循診斷和診斷學的基本原則。基因診斷必須建立在臨床診斷基礎上。2、診斷是用適當科學的方法對疾病的表現所作出辯證邏輯的結論61第一套逆向遺傳學(reversegenetics)思維程序：（1）取人類基因組DNA；（2）建立DNA文庫；（3）克隆位任一DNA片段作為探針；（4）確定該探針在基因組中的位置；這種探針在基因組中的位置一旦被確定下來，就可以成為有用的遺傳標記（geneticmark）;（5）大量應用此類新的遺傳標記，用染色體“步移法”或染色體“跳躍法”，建立各條染色體的連鎖基因圖，最終建立整個人類基因圖譜；（6）篩選遺傳病人或懷疑與基因有關疾病的病人；（7）克隆病變基因；（8）比較正常和異?；虻牟顒e，推測正常，異?；虍a物在細胞中的定位及其生理病理效應。第一套逆向遺傳學(reversegenetics)思維程序62第二套“站在巨人的肩膀上”（1）你診斷/研究的疾病是否：與/有/知道

①

基因有關或相關的基因；②

該基因的正常/異常序列；③

該基因結構/表達異常的類型；④

特異性探針/PCR引物；⑤

轉錄物；⑥

表達產物/表達產物功能/表達產物功能測定方法。（2）

據（1）設計基因診斷方案。4、參3答案。第二套“站在巨人的肩膀上”63第十六章基因診斷第一節概述一、

什么是基因診斷所謂基因診斷，就是在基因水平上對疾病或人體的狀態進行診斷，它包括產前診斷，是一種新的臨床診斷方法。是以DNA和RNA為診斷材料，利用分子生物學技術，通過檢查基因的結構或表型來診斷疾病的方法和過程；其臨床意義在于能檢測DNA或RNA的結構變動與否，量的多少及表達情況等，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診或進行基因治療的依據。第十六章基因診斷第一節概述64二、基因診斷的概念界定以下6個方面內容：

（一）診斷水平基因水平（二）診斷技術從方法學來說，沒有特殊的基因診斷方法，就是分子生物學技術在臨床上的應用。

（三）診斷材料DNA和RNA。（四）診斷內容1、對于內源性基因來說：基因結構和表達是否異常。2、對于外源性基因來說：入侵基因的種類，是病毒核酸、細菌質粒還是寄生蟲DNA.

（五）診斷途徑

1、直接檢查基因結構是否存在：DNA點突變、缺失插入、基因重排、染色體畸變、mRNA剪接缺失錯位或結構變化等。

2、檢查基因轉錄產物mRNA：1）已經轉錄還是沒有轉錄？2）應該轉錄還是不應該轉錄？3）

轉錄正常、過量還是過少？3、檢查基因表型：正常還是異常，進行分析研究。

（六）診斷目的1、

確診相應疾病或得出相應結論。2、

是防治疾病或基因治療的根據。二、基因診斷的概念界定以下6個方面內容：65三、基因診斷的思路（一）基因是隨便能診斷的嗎？總不能亂診斷吧？（二）基因診斷和傳統的疾病診斷方法有什么區別和聯系？（三）基因診斷的理論基礎和技術能不能診斷診斷學基礎怎樣診斷？為此，作下述討論。希望對大家有所幫助。三、基因診斷的思路66四、基因診斷方法和傳統的疾病診斷方法

表1表型診斷（傳統方法）基因診斷（一）診斷依據疾病表型變化基因結構異常和表達異常（二）分類臨床診斷（病因、病解、病生）DNA診斷血清學診斷RNA診斷生化學診斷（三）特異性表型改變在很多情況下是非特以探測基因為目標，只要異性的，往往難以明確診斷，有特異性探針，利用分子延誤病情如FOU?雜交原理即可診斷，具有很高的特異性。

（四）敏感性探針可用“放標”或“非放診斷靈敏度高，標本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期診斷因為表型改變往往出現較晚，在表型改變之前，基因難以早期診斷結構或表達已發生改變，故往往可以早期診斷。

四、基因診斷方法和傳統的疾病診斷方法67（六）基因診斷范圍廣因為：①探針可為任何來源和種類，序列可為已知或未知，目標可為特定基因或特定基因組合，外源性或內源性基因，所以適應性強，診斷范圍廣。②被檢查基因是否處于活化狀態并不重要，故可對分化階段表達特異性基因及其異常進行檢測和診斷，這對腫瘤（如CML）療效及預后尤為重要。③在感染性疾病的診斷，能檢查正在生長或潛伏病原體，能明確既往感染或現行感染，對不易診斷（如產毒性E.coli）和不能安全培養（如立克次體）進行基因診斷，擴大了實驗室診斷范圍。（六）基因診斷范圍廣68（七）二者關系1.基因診斷必須建立在臨床一般檢查的基礎上，它必須是臨床檢查的第二步或第三步手段。（不是隨便診斷）2.基因診斷是分子生物學和醫學遺傳學發展到今天人們的一種設想，現在逐步走向臨床，變成現實。3.盡管實驗研究和臨床應用技術原理相同，但診斷對象是人的時候應該慎重?。ú荒軄y診斷）4.同臨床診斷一樣，忌不獨立思考，人云亦云（舉例）。（七）二者關系69

細胞膜

細胞核DNAmRNA轉錄翻譯（protein）臨床表現基因診斷生化診斷血清學診斷臨床診斷圖一基因診斷與表型診斷細胞核70（五）基因診斷與診斷學（一）診斷是用醫學科學的方法對疾病的表現所作出的辯證邏輯的結論。診斷目的：為了防御疾病和進健康。（二）診斷學是論述診斷疾病的基本原則和方法的一門課程。其基本原則就是研究癥狀體征發生的基本規律和機理以及建立診斷的思維程序?；驹\斷方法包括：詢問病史、體檢、實驗室檢查、以及其他檢查如：心電圖、超聲檢查、內窺鏡、CT、核磁共振等等。（三）基因診斷是診斷學的續寫，是診斷學的新篇章，從這個意義上來說：基因診斷遵循診斷學的基本原則；基因診斷的基礎是醫學基礎，專業基礎是醫學分子生物學和醫學遺傳學，不同的是我們在基因水平上，學習和研究：基因解剖（結構）、基因生理（轉錄翻譯等）、基因病解（結構異常），基因病生（表達異常），然后主要應用分子生物學技術手段進行基因診斷。（五）基因診斷與診斷學71（六）基因診斷的思維程序：第一套：逆向遺傳學（reversegenetics）思維程序1.

提取人類基因組（總）DNA；2.建立DNA文庫（DNABANK）；3.克隆任一DNA片段作為探針。4.確立該探針在基因組中的位置；這種探針在基因組中的位置一旦被確定下來，就可以成為遺傳標記（geneticmarker）.5.大量應用此類新的遺傳標記(用染色體步移法或染色體跳躍法)建立各條染色體的連鎖基因圖譜，最終建立整個人類的基因圖譜。6.篩選遺傳病病人或疑有與基因有關的疾病的病人；7.克隆病變基因8.比較正?；蚝彤惓；虻牟顒e推測正常異常基因產物（蛋白質）在細胞中定位以及生理病理效應。（六）基因診斷的思維程序：72第二套拿來主義1.您診斷/研究的疾病是否：與/有/知道1）基因有關；2）該基因的正常/異常序列；3）該基因結構/表達異常的類型；4）特異性探針/PCR引物；5）轉錄物；6）表達產物/表達產物功能/表達產物功能測定方法。2.

據1設計基因診斷方案。第二套拿來主義73第二節基因診斷的分子生物學基礎一、基因診斷的理論（一）生物大分子結構和功能（二）基因組結構和功能（三）遺傳信息的復制和表達（四）基因表達的調控（五）細胞通訊與細胞信號轉導的分子機制（六）癌基與抑癌基因（七）基因與疾病第二節基因診斷的分子生物學基礎74二、基因診斷的技術

（一）核酸分子雜交，在這些方法中，1.Southern印跡法是最經典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進行定位和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。2.Northern印跡法可用于組織細胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析。3.斑點雜交

可用基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。4.原位雜交

可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷；原為雜交的結果是顯示有