噬菌體展示系統

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噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡介噬菌體及淘選過程?噬菌體展示應用?淘選過程中常見問題及解決方案噬菌體展示系統

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噬菌體展示原理噬菌體展示系統

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Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。噬菌體表面展示技術：是一種將外源多肽或蛋白質的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白的一個結構基因的適當位置上,外源基因將隨著外殼蛋白的表達而表達,從而使多肽或蛋白以與外殼蛋白融合表達的形式展示在噬菌體表面。

什么是噬菌體表面展示技術3

Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌

根據噬菌體不同：溫和噬菌體---M13烈性噬菌體---T7根據文庫不同：肽庫CDNA文庫抗體庫噬菌體展示系統的分類4

根據噬菌體不同：噬菌體展示系統的分類4M13噬菌體的組成和結構絲狀噬菌體：M13。單鏈DNA病毒,6407bp。基因組編碼11種蛋白質，其中5種為結構蛋白質。與展示密切相關的有pIII、pVIII兩種結構蛋白質。DNA在細菌內滾環復制，細菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。5M13噬菌體的組成和結構絲狀噬菌體：M13。5M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結合于E.Coli的F纖毛細菌的Tol蛋白復合體解聚噬菌體的外殼蛋白，ssDNA轉運至胞漿病毒ssDNA進入細菌的胞漿合成dsDNA以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環復制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現在培養液中感染后1小時內平均每個細胞分泌1000個噬菌體6M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結合于E.Coli的F纖次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個功能區組成：N1穿膜區：作用于E.coli細胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關。N2受體結合區：負責結合F菌毛。CT疏水區：組裝前黏附在細菌內膜上；與噬菌體組裝終止有關。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性7次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個拷貝，位于噬菌主要外殼蛋白pVIII每子個病毒含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽。以pIII融合子方式表達的是單價的，而以pVIII融合子方式表達的則是多價的。這種多價pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而單價pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。8主要外殼蛋白pVIII每子個病毒含約2700個拷貝，約10pIII展示和pVIII展示的區別pVIII展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示更大的多肽及蛋白。絲狀噬菌體展示系統一般是在外殼蛋白pIII或pVIII的N端融合表達外源多肽及蛋白。pVIII展示pIII展示多價展示單價展示篩選到的分子親和力相對低親和力高高拷貝數增加了抗原性應用于肽庫主要應用于抗體庫9pIII展示和pVIII展示的區別pVIII展示的多肽比較噬菌體展示技術流程10噬菌體展示技術流程10噬菌體抗體庫的構建建庫：[例子]11噬菌體抗體庫的構建建庫：[例子]111212噬菌體質粒-phagemid噬菌體質粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，沒有其他噬菌體基因。有包裝序列信號。（packingsignal）有供篩選的抗生素標記基因。Helperphage：提供噬菌體質粒復制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。13噬菌體質粒-phagemid噬菌體質粒特征：13篩選的方法－親和淘選

直接包被淘選法：直接將靶分子包被在固相表面優點：簡單直接。缺點：偶爾會導致配體結合位點難以進入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相淘選法：將靶蛋白與噬菌體抗體庫先結合，之后再親和捕獲靶分子-噬菌體復合物。優點：克服直接包被的出現的問題缺點：容易篩到與親和素（或者鏈酶親和素）結合的克隆。14篩選的方法－親和淘選直接包被淘選法：14噬菌體抗體庫淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫與靶分子相互作用洗滌去未結合的或非特異性結合的噬菌體將特異性結合的噬菌體洗脫下來，并擴增，用擴增產物進行下一輪篩選三輪淘選后，克隆測序15噬菌體抗體庫淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫與靶分子相互作第一步：生物素化抗體與磁珠結合

BindtoStreptavidincoatedmagnetic

bead

biotin

-antigen

噬菌體抗體庫淘選示意圖

液相法16第一步：生物素化抗體與磁珠結合

BindtoStrep第二步：磁珠生物素化抗原復合物與抗體庫結合17第二步：磁珠生物素化抗原復合物與抗體庫結合17第三步：洗滌—洗去非特異和弱結合的噬菌體18第三步：洗滌—洗去非特異和弱結合的噬菌體18第四步：洗脫—將特異性結合的噬菌體洗脫下來19第四步：洗脫—將特異性結合的噬菌體洗脫下來19第五步：擴增—將洗脫的噬菌體擴增E.coli感染和擴增擴增產物進行下一輪篩選后面的篩選逐步加大篩選壓力多克隆和單克隆噬菌體ELISAELISA陽性克隆測序，最終得到特異性結合的克隆序列20第五步：擴增—將洗脫的噬菌體擴增E.coli感染擴增產物進行噬菌體展示系統

Phageondisplay噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡介噬菌體及淘選過程?噬菌體展示應用?淘選過程中常見問題及解決方案21噬菌體展示系統

Phageondisplay噬菌體展示噬菌體展示的應用

抗原表位分析?發現特異性抗體?新疫苗、多價疫苗的開發22噬菌體展示的應用抗原表位分析22淘選過程中常見問題及解決方案23淘選過程中常見問題及解決方案23謝謝24謝謝24噬菌體展示系統

Phageondisplay25噬菌體展示系統

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噬菌體展示原理–噬菌體展示定義、分類–簡介噬菌體及淘選過程?噬菌體展示應用?淘選過程中常見問題及解決方案噬菌體展示系統

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噬菌體展示原理噬菌體展示系統

Phageondis

Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。噬菌體表面展示技術：是一種將外源多肽或蛋白質的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白的一個結構基因的適當位置上,外源基因將隨著外殼蛋白的表達而表達,從而使多肽或蛋白以與外殼蛋白融合表達的形式展示在噬菌體表面。

什么是噬菌體表面展示技術27

Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌

根據噬菌體不同：溫和噬菌體---M13烈性噬菌體---T7根據文庫不同：肽庫CDNA文庫抗體庫噬菌體展示系統的分類28

根據噬菌體不同：噬菌體展示系統的分類4M13噬菌體的組成和結構絲狀噬菌體：M13。單鏈DNA病毒,6407bp。基因組編碼11種蛋白質，其中5種為結構蛋白質。與展示密切相關的有pIII、pVIII兩種結構蛋白質。DNA在細菌內滾環復制，細菌不被裂解，但生長速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒。29M13噬菌體的組成和結構絲狀噬菌體：M13。5M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結合于E.Coli的F纖毛細菌的Tol蛋白復合體解聚噬菌體的外殼蛋白，ssDNA轉運至胞漿病毒ssDNA進入細菌的胞漿合成dsDNA以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環復制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現在培養液中感染后1小時內平均每個細胞分泌1000個噬菌體30M13噬菌體的生命周期PIII蛋白結合于E.Coli的F纖次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個功能區組成：N1穿膜區：作用于E.coli細胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關。N2受體結合區：負責結合F菌毛。CT疏水區：組裝前黏附在細菌內膜上；與噬菌體組裝終止有關。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個功能域之間的靈活性31次要外殼蛋白pIII406aa組成，5個拷貝，位于噬菌主要外殼蛋白pVIII每子個病毒含約2700個拷貝，約10%能有效地融合外源多肽。以pIII融合子方式表達的是單價的，而以pVIII融合子方式表達的則是多價的。這種多價pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而單價pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。32主要外殼蛋白pVIII每子個病毒含約2700個拷貝，約10pIII展示和pVIII展示的區別pVIII展示的多肽比較小，如果太大會影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示更大的多肽及蛋白。絲狀噬菌體展示系統一般是在外殼蛋白pIII或pVIII的N端融合表達外源多肽及蛋白。pVIII展示pIII展示多價展示單價展示篩選到的分子親和力相對低親和力高高拷貝數增加了抗原性應用于肽庫主要應用于抗體庫33pIII展示和pVIII展示的區別pVIII展示的多肽比較噬菌體展示技術流程34噬菌體展示技術流程10噬菌體抗體庫的構建建庫：[例子]35噬菌體抗體庫的構建建庫：[例子]113612噬菌體質粒-phagemid噬菌體質粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，沒有其他噬菌體基因。有包裝序列信號。（packingsignal）有供篩選的抗生素標記基因。Helperphage：提供噬菌體質粒復制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶。37噬菌體質粒-phagemid噬菌體質粒特征：13篩選的方法－親和淘選

直接包被淘選法：直接將靶分子包被在固相表面優點：簡單直接。缺點：偶爾會導致配體結合位點難以進入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相淘選法：將靶蛋白與噬菌體抗體庫先結合，之后再親和捕獲靶分子-噬菌體復合物。優點：克服直接包被的出現的問題缺點：容易篩到與親和素（或者鏈酶親和素）結合的克隆。38篩選的方法－親和淘選直接包被淘選法：14噬菌體抗體庫淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫與靶分子相互作用洗滌去未結合的或非特異性結合的噬菌體將特異性結合的噬菌體洗脫下來，并擴增，用擴增產物進行下一輪篩選三輪淘選后，克隆測序39噬菌體抗體庫淘選示意圖

直接包被法噬菌體抗體庫與靶分子相互作第一步：生物素化抗體與磁珠結合

BindtoStreptavidincoatedmagnetic

bead

biotin

-antigen

噬菌體抗體庫淘選示意圖

液相法40第一步：生物素化抗體與磁珠結合

BindtoStrep第二步：磁珠生物素化抗原復合物與抗體庫結合41第二步：磁珠生物素化抗原復合物與抗體庫結合17第三步：洗滌—洗去非特異和弱結合的噬菌體42第三步：洗滌—洗去非特異和弱結合的噬菌體18第四步：洗脫—將特異性結合的噬菌體洗脫下來43第四步：洗脫—將特異性結合的噬菌體洗脫下來19第五步：擴增—將洗脫的噬菌體擴增E.coli感染和擴增擴增產物進行下一輪篩選后面的篩選逐步加大篩選壓力多克隆和單克隆噬菌體ELISAELISA陽性克隆測序，最終得到特異性結合的克隆序列44