腫瘤相關基因腫瘤相關基因1腫瘤相關基因癌基因抑癌基因腫瘤轉移基因腫瘤轉移相關基因腫瘤轉移抑制基因腫瘤相關基因癌基因2癌基因（oncogene）病毒癌基因

virusoncogene（v-onc）細胞癌基因

cellularoncogene（c-onc）原癌基因proto-onc癌基因（oncogene）病毒癌基因

virusoncog3病毒癌基因

virusoncogene（v-onc）1968年Duesberg等首次發現Rous肉瘤病毒基因組編碼酪氨酸蛋白激酶基因，證實它在細胞轉化中起關鍵作用來自病毒，因而被命名為病毒癌基因病毒癌基因

virusoncogene（v-onc）1964細胞癌基因

cellularoncogene（c-onc）1972年Bishop核酸分子雜交法證實：幾乎在所有高等動物細胞基因組中，都有和v-onc相似的DNA序列這些序列是細胞基因組的成員之一，其編碼的產物具有重要的功能細胞癌基因在正常情況下的表達有時間、空間限制，表達產物參與細胞分化、增殖細胞癌基因

cellularoncogene（c-onc）5原癌基因（proto-onc）未激活的細胞癌基因在人體正常細胞中存在是一種正常基因作用：調控細胞生長和分化廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細胞中都存在原癌基因（proto-onc）未激活的細胞癌基因6原癌基因的分類按原癌基因的結構、產物的功能、所在的位置分為下列四類：

1.蛋白激酶類

2.信息傳遞蛋白類

3.生長因子及其受體類

4.核內蛋白類原癌基因的分類按原癌基因的結構、產物的功能、所在的位置分為下7細胞癌基因與致癌癌基因在生物進化中具高度保守性正常細胞中的癌基因和腫瘤細胞中的癌基因的核苷酸順序十分相似，后者可使NIH3T3細胞惡性轉化，前者需經激活后才具有轉化能力說明：在正常情況下細胞癌基因不致癌，生理條件下內外環境中的某些刺激可激活癌基因，從而調節細胞的生長、分化和信息傳遞細胞癌基因與致癌癌基因在生物進化中具高度保守性8通常認為：癌基因并不是腫瘤所特有是細胞的正常基因能誘導正常細胞發生轉化，并使正常細胞獲得一個或多個新的生物特性的基因只有在被激活后發生異常表達時，才會導致細胞發生惡性轉化通常認為：癌基因并不是腫瘤所特有9細胞癌基因的生理功能主要表現為：①調節細胞生長②參與細胞分化和發育過程具有正常生理功能的同時又具有潛在致癌能力的原癌基因，其致癌潛能的發揮，首先需要被激活細胞癌基因的生理功能主要表現為：①調節細胞生長10常見的激活因素：病毒

化學物質

輻射常見的激活因素：病毒

11原癌基因的激活機理1.DNA重排2.基因放大3.點突變4.其它調控的異常原癌基因的激活機理1.DNA重排12DNA重排插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達負調控區的失活或丟失

DNA重排插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、13DNA重排

1插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達插入的啟動子或增強子來自細胞外（外源性）如：雞B淋巴細胞瘤由于ALV的LTR插入c-myc的旁側（5’或3’端），使c-myc過量表達插入的啟動子或增強子來自細胞內（內源性）如：內源性逆轉錄病毒的LTRDNA重排

1插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基14染色體易位是原癌基因DNA重排的典型例子人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因與c-myc的重排，使c-myc激活c-myc基因定位于8q24，Ig、Ig、Igλ鏈的基因位點分別定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位點的高活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生DNA重排

1插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持

久、過量地表達染色體易位是原癌基因DNA重排的典型例子DNA重排

115腫瘤相關基因課件16DNA重排

2負調控區的失活或丟失小鼠c-myc，c-fos，c-mos等原癌基因在旁側順序具有抑制轉錄啟動的負調控區人c-myc的負調控區在5’端428-1188bp處，而在B淋巴瘤中，該區有多點突變或部分丟失Duesberg提出：1號外顯子被切斷時，ras基因即被激活雖然這一結論還有待更多實驗證實；但是，原癌基因上游或下游旁側順序存在負調控區（并不是個別現象），因而使原癌基因被激活的可能性大為減少DNA重排

2負調控區的失活或丟失小鼠c-myc，c17點突變

在ras基因族，在人體腫瘤中已從膀胱、小細胞肺癌（Ha-ras，Kit-ras），胃（N-ras），乳腺（Ha-ras）等證明在12或61號編碼子出現點突變所導致一個氨基酸的置換突變（一個氨基酸置換）可使其編碼產物蛋白p21的GTPase活性明顯下降，從而影響p21的生物學活性點突變在ras基因族，在人體腫瘤中已從膀胱、小細胞肺18基因放大

基因擴增，可導致基因過量表達基因放大一般被認為與惡性演進有關，未必是惡性早期的改變在人體腫瘤中，如：人肝癌中出現N-ras重排及其基因放大小細胞肺癌中c-myc及L-myc基因放大與癌轉移可能有關神經母細胞瘤中N-myc基因放大明顯與病程發展有關基因放大基因擴增，可導致基因過量表達19其它調控的異常

反式（Trans）調控系統轉錄后的調控異常其它調控的異常反式（Trans）調控系統20反式（Trans）調控系統已證明某些基因產物可影響其它基因的轉錄，如：病毒HTLV-Ⅰ，Ⅱ中TAT（LOR）區SV40中的某些片段RSV的gag區原癌基因很可能會接受其它基因（包括病毒的基因產物）的控制或影響值得注意的是：v-myc進入細胞后，可關閉細胞本身c-myc的表達，同時，c-myc激活后亦可使另一個正常表達的c-myc等位基因關閉，提示：myc產物或由myc誘導產生的物質對c-myc的轉錄發生Trans的負控制反式（Trans）調控系統已證明某些基因產物可影響其它基因的21轉錄后的調控異常

成纖維細胞經生長因子處理后，結果：c-myc的mRNA量增高轉錄水平并不改變說明：mRNA轉錄后加工或穩定性的改變基因的轉錄后調控：當前了解甚少，原癌基因的轉錄后調控的異常了解的更少轉錄后的調控異常

成纖維細胞經生長因子處理后，結果：22抑癌基因

tumorsuppressorgene腫瘤抑制基因（抗癌基因）最早由A.KnudsonJr.提出細胞內一類抑制腫瘤發生、生長的基因，最近又發展為指能對抗癌基因作用的基因在生物體內與癌基因功能相抵抗，共同保持生物體內正負信號相互作用的相對穩定腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化過程的一部分抑癌基因

tumorsuppressorgene腫瘤抑23抗癌基因主要功能(1)誘導終末分化(2)維持基因穩定(3)觸發衰老，誘導細胞程序性死亡(4)調節細胞生長(5)抑制蛋白激酶活性(6)改變DNA甲基化酶活性(7)調節組織蛋白酶活性(8)調節血管形成(9)促進細胞間聯系抗癌基因主要功能(1)誘導終末分化24腫瘤細胞

轉移基因與轉移抑制基因腫瘤細胞轉移基因的激活和/或轉移抑制基因失活均可誘發腫瘤細胞轉移表型而導致轉移的發生原發部位腫瘤組織中具有轉移潛性的細胞群是腫瘤轉移的細胞生物學基礎

腫瘤細胞

轉移基因與轉移抑制基因腫瘤細胞轉移基因的激活和/或25目前發現：癌基因有100多個抗癌基因有7個轉移基因（metastasisgene）有一些?直接促進轉移發生的關鍵基因，其存在或表達增強會引起侵襲轉移的發生轉移相關基因（metastasis-asscciatedgene）有一些?只涉及轉移的某個階段，并非參與整個轉移過程目前發現：癌基因有100多個26目前發現：轉移抑制基因（metastasissuppressorgene）有一些？Soble認為：凡是能抑制腫瘤轉移的基因均可命名為轉移抑制基因抑制腫瘤細胞的轉移表型研究表明，腫瘤的轉移與轉移基因激活或轉移抑制基因失活有關，是多種轉移相關基因及轉移抑制相關基因綜合作用的結果目前發現：轉移抑制基因（metastasissuppres27腫瘤相關基因的發現和深入研究的意義：——提高了人們的認識細胞增殖與分化的調控機制惡性腫瘤的發生，發展規律腫瘤浸潤轉移機制——為腫瘤的診斷提供了嶄新的途徑腫瘤的發生、轉移與某些特定的癌基因密切相關，對這些癌基因及其產物的檢測，為腫瘤的臨床診斷提供了一條嶄新的途徑，必將受到臨床實驗室技術人員和腫瘤工作者的重視腫瘤相關基因的發現和深入研究的意義：——提高了人們的認識28ras癌基因

—參與人類腫瘤的發生發展最初在急性轉化性逆轉錄病毒實驗中，從Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出的轉化基因自82年Weinberg等人發現人膀胱癌細胞系中有活化的H-ras基因后，對ras在人類腫瘤發生發展中所起的作用引起了極大關注目前研究認為：ras癌基因參與細胞生長和分化的調控參與多種腫瘤的形成與發展ras癌基因

—參與人類腫29ras基因家族家族中與人類腫瘤相關的特征性基因有：

H-ras定位于11號染色體是大鼠肉瘤病毒的轉化基因

K-ras定位于12號染色體是大鼠肉瘤病毒的轉化基因N-ras定位于1號染色體人神經母細胞瘤中分離得到ras基因家族家族中與人類腫瘤相關的特征性基因有：30ras基因家族ras家族的基因所共有的特征為：

1.基因組中有5個外顯子：4個編碼的外顯子和1個5’端非編碼外顯子

2.外顯子所編碼的蛋白為188-189個氨基酸殘基，分子量為21kD（p21蛋白），此蛋白具有高度特異性和同源性，尤其在氨基酸序列的前80個氨基酸殘基中，幾乎無種屬間差別，具有高度保守性ras基因家族ras家族的基因所共有的特征為：31正常ras蛋白具有以下特點：p21（ras蛋白）位于細胞膜的內側面，以軟脂酸共價鍵形式固定于脂質雙層膜的內表面對GTP和GDP具有高度親和力，并具有同源性GTP酶的活性

正常ras蛋白具有以下特點：p21（ras蛋白）位于細胞膜的32ras蛋白ras蛋白的生化性質與G蛋白非常類似G蛋白具有從膜結合受體到腺苷酸環化過程的信號傳導作用，提示：ras蛋白可能也具有信號傳導通路的作用目前，尚未發現ras蛋白作用的特異受體和靶細胞ras蛋白ras蛋白的生化性質與G蛋白非常類似33G蛋白G蛋白34G蛋白G蛋白35ras蛋白有人推測：在哺乳動物細胞中ras蛋白作用的靶分子：很可能是磷脂酶Cras蛋白有人推測：在哺乳動物細胞中36磷脂酶C

——信號傳遞途徑的一個重要成份被激活后的磷脂酶CPIP2

IP3+DGIP3和DG是促進細胞增殖的第二信使現已證實，在ras癌基因轉化的細胞中IP3，DG和PIP2的含量均明顯多于未轉化的細胞磷脂酶C

——信號傳遞途徑的一個重要成份被激活后的磷脂酶37腫瘤相關基因課件38腫瘤相關基因課件39ras基因激活機制：原癌基因的激活過程稱為活化活化后的ras基因能使NIH3T3細胞系轉化為腫瘤細胞ras基因活化的主要方式有：(1)編碼區內的突變(2)插入激活ras基因激活機制：原癌基因的激活過程稱為活化40突變激活

——ras基因家族的主要激活方式在實體瘤中占10～15%目前較公認：ras基因突變點位于三種ras基因的第12、13、59或61位氨基酸密碼子Seeburg等采用定點突變技術，對H-ras基因第12位密碼子——甘氨酸的所有置換氨基酸的可能性進行了分析，結果表明，此位點上，除置換氨基酸為脯氨酸外，其余的置換氨基酸均具有轉化潛能，但有程度差異到目前為止，在腫瘤中尚未發現二個或三個位點同時突變突變激活

——ra41插入激活ras基因附近插入一個強啟動子（promoter）或增強子（enhaner）可使ras基因表達增強插入激活ras基因附近插入一個強啟動子（promoter）42基因擴增，堿基缺失正常基因的擴增或非編碼外顯子的缺失也能使ras基因呈高表達但這兩種方式在ras基因激活中較少見

基因擴增，堿基缺失正常基因的擴增或非編碼外顯子的缺失也能使43ras蛋白目前認為：兩種形式活化非活化通常情況下，細胞內的ras蛋白分子處于非活化狀態ras蛋白目前認為：兩種形式44非活化狀態下的ras蛋白特征:具有GTP酶活性能夠與GDP結合當ras蛋白受到信號傳遞通道上游某一外界因子的刺激時，使GDP磷酸化變成GTP，隨后ras蛋白發生構象改變，成為活化狀態活化的ras蛋白與效應分子相互作用，實現生長信號的傳遞，而且這種作用發生，活化的ras蛋白會迅速失活，轉變為與GDP結合的非活化形式此過程主要是ras蛋白自身的GTP酶作用，它能催化GTP水解，使活化ras蛋白能立即轉變成為非活化狀態的ras蛋白非活化狀態下的ras蛋白特征:具有GTP酶活性45活化的ras蛋白的生化性質ras基因的任何突變使正常的ras蛋白轉變為能夠使NIH3T3細胞轉化的蛋白，從生化角度上講，這種突變激活可分為二種(1)突變失去內在的GTP酶活性(2)突變改變了對GDP和GTP的親和力ras蛋白功能取決于編碼蛋白的基因序列和與之密切相關的結構域突變激活的常見位點多集中在GTP、GDP結合的domain附近結構的改變導致了ras蛋白的功能異常活化的ras蛋白的生化性質ras基因的任何突變使正常的ras46ras基因的突變ras基因的突變：擾亂正常狀態下活化與非活化ras蛋白的這種平衡機制，使正常非活化的ras蛋白轉變成活化形式實際上，ras基因的12、13、61位密碼子的活化突變，并不影響p21蛋白與GDP和GTP的結合，但卻降低了p21蛋白自身GTP酶活性，使其水解GTP的速效大為降低，從而使ras蛋白維持于活化狀態，不斷激活靶分子，引起信號傳導的持續效應，導致細胞大量增殖，而發生惡性轉化ras基因的突變ras基因的突變：擾亂正常狀態下活化與非活47理論上

ras蛋白維持于活化狀態有三種可能機制(1)ras蛋白自身GTP酶活性降低，使GTP水解減少(2)GDP與GTP間的交換增加(3)誘導了不需與鳥苷酸結合的ras蛋白的活化構象有人推測：ras蛋白的調節機制可能與其本身所具有的一種“開放”、“關閉”構型有關，構型處于“開放”時，能活躍地傳導特定的生長信號；而“關閉”時則不能傳導。如關鍵位點（12、13或61位密碼子）發生了點突變，則使這種構型的開關不能再回轉到閉合狀態，使活化的ras蛋白持續傳導一種不適當的生長信號理論上

ras蛋白維持于活化狀態有三種可能機制(1)ras48ras基因與人類腫瘤82年以來，在膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系腫統瘤中，均檢出了ras癌基因的異常Pulciani等人研究表明，被檢腫瘤DNA中所含活化ras基因僅占10～20%（似乎ras癌基因在人類腫瘤發生發展中并非起主要作用）事實上，ras癌基因參與多種腫瘤的發生發展，只不過突變率相差很大ras基因與人類腫瘤82年以來，在膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、49ras基因與人類腫瘤不同腫瘤類型，ras基因的突變率相差明顯，如：最高的是在胰腺癌中（90%），其次是甲狀腺癌（53%）和結腸癌（47%）突變ras基因的種類與某些腫病類型密切相關，即有優勢激活現象。如胰腺癌、結腸癌、肺癌等以K-ras突變為主，造血系統腫瘤多發現N-ras的突變，泌尿系腫瘤則以H-ras突變為主ras基因與人類腫瘤不同腫瘤類型，ras基因的突變率相差明50ras基因與人類腫瘤目前的資料表明H-ras和K-ras的表達不僅與膀胱癌、腎盂癌、肺癌、結腸癌有密切的關系，而且也與膽囊癌、胰腺癌、腎母細胞癌、慢性淋巴細胞白血病、黑色素瘤形成密切相關N-ras表達水平上升主要發生在造血系統的惡性腫瘤中，如APL、AML、BL，但在神經母細胞瘤、纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤中的表達也有一定的上升，并認為是這些腫瘤形成的主要原因檢測ras突變對了解腫瘤的發生發展，以及監測惡性腫瘤的治療效果具有重大意義ras基因與人類腫瘤目前的資料表明51c-myc癌基因c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一c-myc基因是一種可易位基因是一種多種物質調節的可調節基因是一種可使細胞無限增殖，促進細胞分裂的基因myc基因參與細胞凋亡，c-myc基因與多種腫瘤發生發展有關c-myc癌基因c-myc基因是myc基因家族的重要成員之52人c-myc基因：定位于8q24Ig、Ig、Igλ鏈的基因位點分別定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位點的高活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生人c-myc基因：定位于8q2453腫瘤相關基因課件54c-myc癌基因結構c-myc與禽類髓細胞病毒（AMN）MC-29的v-myc同源c-myc基因由3個外顯子及2個內含子組成第一個外顯子不編碼，只起調節作用只有外顯子2和3與v-myc相對應，編碼一個439個氨基酸的蛋白質c-myc癌基因結構c-myc與禽類髓細胞病毒（AMN）M55c-myc癌基因結構c-myc基因由啟動子P1或P2起始轉錄，并在第一內含子中有一個潛在啟動子P，當第一個內含子發生斷裂時，P可被激活而成為一個異常轉錄起始點，但蛋白合成起始位點不變，并與正常c-myc基因產物相同不同的動物中，c-myc基因的第2、3外顯子具有高度保守性，而第1外顯子則有較大的差異小鼠和人的外顯子1有70%的同源性c-myc癌基因結構c-myc基因由啟動子P1或P2起始轉56c-myc癌基因的表達c-myc基因的表達與細胞的生長狀態有關：生長因子刺激成纖維細胞，c-myc表達增強相反，在細胞分化時c-myc表達降低在細胞培養過程中，用c-myc表達結構或反義寡脫氧核酸進行研究，發現c-myc在細胞G0期到S期的過程中也起作用表明c-myc表達的變化與細胞的增殖及分化狀態有關，其表達產物在調節細胞生長、分化或惡性轉化中發揮作用c-myc癌基因的表達c-myc基因的表達與細胞的生長狀態57c-myc基因表達產物的結構與功能c-myc基因的產物為磷酸化蛋白p62分子量為：62kD由c-myc基因的外顯子2和3共同編碼由439個氨基酸組成的蛋白質c-myc基因屬核蛋白基因，定位細胞核內，產物為核蛋白c-myc基因表達產物的結構與功能c-myc基因的產物為磷58c-myc基因表達產物的結構與功能具有轉化細胞的能力具有與染色體DNA結合的特性在調節細胞生長、分化及惡性轉化中發揮作用c-myc蛋白在結構上可分為：轉錄激活區，非特異DNA結合區，核靶序列，堿性區，螺旋-環-螺旋（HLH）及亮氨酸拉鏈區c-myc基因表達產物的結構與功能具有轉化細胞的能力59螺旋-環-螺旋（HLH）螺旋-環-螺旋（HLH）60亮氨酸拉鏈（leuzipper）亮氨酸拉鏈（leuzipper）61c-myc基因表達產物的結構與功能在c-myc蛋白中，螺旋-環-螺旋緊隨著堿性區，揭示其以特異性序列方式和DNA相互作用在以原核生物為實驗對象的研究表明：堿性區以一個自由環存在，當以特殊方式結合到DNA上時，則變成螺旋，該區是c-myc蛋白與DNA特異序列的結合部位c-myc基因表達產物的結構與功能在c-myc蛋白中，62c-myc基因表達產物的結構與功能c-myc中：還存在著與抑制細胞分化、自身抑制有關的區域腫瘤轉化所必需的區域Smith等研究了c-myc的亮氨酸拉鏈區，該區介導各種轉錄因子的二聚作用在亮氨酸重復部位的突變能顯著降低c-myc抑制鼠紅白血病（MEL）細胞分化能力此區的插入突變能消除c-myc的轉化活性認為：正是這些c-myc結構成分的表達阻止了細胞進入細胞周期，從而抑制許多細胞系的分化c-myc基因表達產物的結構與功能c-myc中：還存在著63c-myc基因表達產物的結構與功能Cronch等對c-myc亮氨酸拉鏈區的亮氨酸進行致突變研究發現：突變導致失去自身抑制說明：亮氨酸拉鏈區在自身抑制中具有重要作用c-myc基因表達產物的結構與功能Cronch等64c-myc基因表達產物的結構與功能Stone等研究認為：c-myc分子的中間1/3以及N-端，C-端是腫瘤轉化所必需的，是c-myc基因與腫瘤轉化有關的區段（功能區域）c-myc功能區域，促使c-myc在胞漿內合成后，與其它蛋白形成寡聚體，再轉移到核內，并結合到特異性的DNA序列上，從而激活和抑制許多靶基因的轉錄，引起細胞生長和分化的改變，發揮其生理調節功能及惡性轉化作用c-myc基因表達產物的結構與功能Stone等研究認為：65myc蛋白參與誘導細胞凋亡細胞凋亡（ProgrammedCelldeath，PCD）研究的深入，發現myc蛋白參與誘導細胞凋亡c-myc基因表達的失調是多種細胞凋亡的主要誘因細胞發生凋亡的速度及其對誘導因素的敏感性均依賴于c-myc蛋白的含量尚未成熟胸腺細胞中：myc基因的高表達是胚胎胸腺細胞凋亡的誘因，而且在凋亡細胞的死亡階段，也觀察到c-myc基因的高水平表達，如果用反義寡核苷酸阻斷c-myc基因的表達，則細胞凋亡受到嚴重干擾myc蛋白參與誘導細胞凋亡細胞凋亡（Programmed66myc蛋白參與誘導細胞凋亡Evan發現，c-myc表達的失調也會啟動去除生長因子后培養細胞的成熟前凋亡觀察了小鼠IL-3依賴性髓樣細胞株32D，發現在洗去IL-3后，可立即觀察到c-myc基因表達下調，結果使培養細胞停止于G1期將攜帶c-myc基因載體轉染32D細胞，獲得穩定表達c-myc基因的32D細胞克隆，結果這種細胞去除IL-3后，不停止于G1期，而是啟動以凋亡為特征的程序性細胞死亡結果揭示細胞凋亡是清除固定突變及細胞周期調控失衡的細胞的重要機制，一旦細胞發生障礙，c-myc基因會啟動凋亡程序，相反，則導致腫瘤形成myc蛋白參與誘導細胞凋亡Evan發現，c-myc表達的失67myc癌基因與人類腫瘤myc基因定位于染色體8q24Ig、Ig、Igλ鏈的基因位點分別在14q32、2p13和22q11在BL中：c-myc基因位點與Ig基因位點之間的易位，即c-myc易位到Ig位點的高活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生myc癌基因與人類腫瘤myc基因定位于染色體8q2468myc癌基因與人類腫瘤在不同的人體腫瘤細胞系中，已發現c-myc或c-myc相關序列的擴增粒細胞性白血病細胞系視網膜母細胞瘤細胞系某些神經母細胞瘤細胞系乳腺癌細胞系某些肺癌細胞系腸癌細胞系成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤myc癌基因與人類腫瘤在不同的人體腫瘤細胞系中，已發現c-69myc癌基因與人類腫瘤c-myc過量表達與腫瘤的早期復發有關在致瘤中，已發現ras與myc、sis與myc、myc與fos偶聯激活，協同致瘤等許多資料表明c-myc位點在所有受檢的B細胞腫瘤中有重排myc癌基因與人類腫瘤c-myc過量表達與腫瘤的早期復發有70myc癌基因與人類腫瘤Casares等：發現定位在8號染色體上的c-myc與定位在14號染色體上的Ig重鏈基因有同樣的14.2Kb的EcoRⅠ酶切片段，因而認為發生了8∶14易位8∶14易位可能是何杰氏淋巴瘤的一個標志N-myc在人神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤和小細胞肺癌中有擴增，擴增的程度與腫瘤的發病進程有關Schwab等報告20%的神經母細胞瘤有N-myc擴增，其中大多數是侵襲性腫瘤myc癌基因與人類腫瘤Casares等：發現定位在8號染色71myc癌基因與人類腫瘤Seeger等報告，myc基因拷貝數的多少預示疾病的進程c-myc與小細胞肺癌30%的病例c-myc擴增，復發病人中myc擴增者的生存期短于沒有擴增的病例接受化療的腫瘤病人易引起myc擴增myc基因擴增與其它腫瘤的關系也有許多報道目前認為胃癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌、何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴增或過度表達myc癌基因與人類腫瘤Seeger等報告，myc基因拷貝數72nm23基因nm23基因是腫瘤轉移抑制基因nm23編碼的產物具有抑制腫瘤轉移的功能nm23在分化良好的腫瘤中呈高水平表達，且nm23基因表達與淋巴結轉移呈負相關，與無病生存期，整個生存期呈正相關檢測nm23基因的表達高低，可以作為判斷腫瘤有無轉移的一個重要指標nm23基因nm23基因是腫瘤轉移抑制基因73nm23基因及表達nm23基因：Steeg（美國國立癌癥研究所，1988）等，從7個轉移潛力不同的K-1735鼠黑色素瘤細胞株中用消減雜交分離克隆獲得nm23基因：在低轉移細胞株中的表達強度是高轉移細胞株內的10倍，表明nm23基因在高轉移腫瘤中表達降低人基因組中存在著兩個nm23基因，即nm23-H1，和nm23-H2，定位于17q32.1、3nm23基因及表達nm23基因：Steeg（美國國立癌癥研74nm23基因及表達nm23-H1mRNA、nm23-H2mRNA：由兩個完全不同的基因轉錄nm23-H1、nm23-H2：受兩個獨立的調控系統調節nm23-H1的mRNA的水平與癌細胞轉移關系更密切nm23基因及表達nm23-H1mRNA、nm23-H75nm23基因及表達nm23-H2基因與myc基因之間功能性連接nm23蛋白：轉錄因子Postel等研究：多肽PUF，是myc轉錄的重要調節物，PUF可與c-myc啟動子特異區域相結合Postel等，從Hela細胞克隆了PUFcDNA，發現它的核苷酸序列實際上與人nm23-H2序列一致一系列的生化及免疫學研究證明：PUF與nm23-H2蛋白的一致性，該蛋白通過與啟動子序列特異地結合使mycDNA序列在體外轉錄nm23基因及表達nm23-H2基因與myc基因之間功能性76nm23基因及表達目前認為，nm23雖然不一定是myc的轉錄刺激物，但至少是myc的一個重要調節基因細胞死亡時，nm23可以誘導myc的表達nm23-H1喪失，有助于細胞永生化nm23基因及表達目前認為，nm23雖然不一定是myc的77nm23表達產物及功能nm23-H1和nm23-H2基因：編碼由152個氨基酸所組成的17kD蛋白，nm23-H1和nm23-H2的氨基酸序列同源性達88%其氨基酸序列在疏水性和電荷性上高度保守，有94%的氨基酸組成是相同的nm23蛋白（p17）與核苷二磷酸激酶（NDPK）的氨基酸序列高度同源nm23-H1蛋白與NDPK的同源性達89%nm23-H2蛋白與NDPK的同源性達97%nm23表達產物及功能nm23-H1和nm23-H2基因：78NDPK是一類廣泛存在的酶將5’NTP的一個磷酸基團轉移到5’NDP上，使蛋白變為活性狀態功能：在腫瘤的發生和發育上，至少參與兩個重要作用NDPK是一類廣泛存在的酶79NDPK功能之一：

——微管的聚合一方面可能使微管聚合異常而引起減數分裂時紡綞體的異常，從而導致癌細胞染色體非整倍體的形成，進而促進腫瘤的發展另一方面它可能通過影響細胞骨架而引起細胞運動，從而參與浸潤轉移過程和發育過程NDPK功能之一：

——微管的聚合一方面可能使微管聚合異常80NDPK功能之二：

——G蛋白介導的信號傳導在信號轉導過程中，使GDP還原為GTP，從而使G蛋白激活Nm23蛋白以這種方式能調節大量的G蛋白介導的細胞信號傳導反應，進而參與發育和腫瘤的發展NDPK功能之二：

——G蛋白介導的信號傳導在信號轉導過81nm23基因與腫瘤轉移SteegPS，等——nm23基因表達與乳原癌轉移和預后的關系17份腫瘤標本，原位雜交技術檢測nm23mRNA含量結果：瘤細胞（來自有淋巴結轉移的病人）：均含有低水平的nm23mRNA瘤細胞（來自無淋巴結轉移的病人）：含有較高水平的nm23mRNAnm23基因與腫瘤轉移SteegPS，等82nm23基因與腫瘤轉移進一步，對71例原發性乳腺癌患者進行研究（nm23基因的表達）方法Northernblot免疫細胞化學的方法結果表明：nm23在分化良好的腫瘤呈高水平表達，nm23表達與淋巴轉移呈負相關，與無病生存期，整個生存期呈正相關目前認為nm23基因產物，在抑制表型中起重要作用nm23基因與腫瘤轉移進一步，對71例原發性乳腺癌患者進行研83nm23基因與腫瘤轉移nm23低表達與人胃癌的轉移密切相關到目前為止，nm23已在胃癌、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、腸癌等具有轉移潛能的腫瘤細胞中呈低表達在大腸癌中nm23在低表達與腫瘤狀態和遠距離轉移緊密相關檢測nm23表達程度可以判斷腫瘤有無轉移，對臨床治療具有普遍意義，國外已在91年開展這項常見檢查。國內？nm23基因與腫瘤轉移nm23低表達與人胃癌的轉移密切相關84mdm2癌基因1992年，從一個含有雙微體（murinedoublemimut，DM）的自發轉化的BALB3T3DM細胞中克隆出來的一個高度擴增的基因位于小鼠的第10號染色體的C1-C3區已在多種腫瘤中發現其突變與擴增，而且mdm2突變與p53突變不共存mdm2擴增與腫瘤轉移密切相關目前研究表明，mdm2參與細胞基本生理過程。因此，mdm2癌基因的變化對闡明腫瘤發病機理以及轉移機理具有重大意義，對臨床也具有指導意義mdm2癌基因1992年，從一個含有雙微體（murine85mdm2癌基因mdm2基因在進化上比較保守，在許多動物細胞的染色體上都有同源序列核苷酸序列己測定，由2372個堿基組成，在3’端和5’端各有數百個堿基組成的非編碼區起始密碼AUG從第311個堿基處開始，編碼區全長1473個堿基，編碼一個長度為491個氨基酸的蛋白質mdm2癌基因mdm2基因在進化上比較保守，在許多動物細胞86

mdm2基因1992年，Momand等人，首次分離和證明了大鼠的mdm2基因產物是一種分子為90kD的蛋白質同年Baraby等人測定的分子量約95kD該蛋白質的分子量是90kD或95kD，故稱為p90或p95p90是一種高度酸性的蛋白質，等電點非常低p90結構：一級結構己根據mdm2基因的核苷酸序列推測出來，高級結構的研究目前尚未見報道氨基酸序列分析發現：具有1個核定位信號和2個鋅指蛋白，提示著它是一種DNA結合蛋白，可能具有轉錄調節作用mdm2基因1992年，Momand等人，首次分離和證明87人mdm2基因Oliner等人，對人mdm2基因進行了克隆，并定位于12q13-4正常情況下，人體許多器官都有mdm2mRNA（5.5kb）的表達，以骨胳肌最高在小鼠的許多器官組織中也有mdm2mRNA的表達，以睪丸、胸腺和腦中最高mdm2在哺乳動物中有如此廣泛的表達，說明它在細胞的基本生理過程中有一定作用，根據對mdm2癌基因產物分析也提示：mdm2癌基因在控制細胞生長上有一定作用人mdm2基因Oliner等人，對人mdm2基因進行了克88mdm2癌基因的成瘤性研究mdm2癌基因在自發轉化的BALB/3T3DM細胞系有高度擴增，其擴增程度是正常的50倍以上，而且這些轉化的細胞在軟瓊脂上可以生長，并在裸鼠皮下可以成瘤，成瘤速度非常快，在1-2周內就可以出現一個快速生長的腫瘤mdm2癌基因的成瘤性研究mdm2癌基因在自發轉化的B89mdm2癌基因的成瘤性研究用mdm2基因，轉染NIH3T3細胞和大鼠的Rat細胞，可以使轉染細胞的mdm2mRNA水平增高10-15倍過度表達的程度與mdm2在這些細胞內的擴增程度有直接關系將轉染的細胞接種到16只裸鼠皮下，裸鼠均發生了腫瘤，但出現腫瘤的時間要晚于3T3DM細胞，這可能與3T3DM細胞的mdm2的表達程度較高有關動物實驗說明：mdm2癌基因，可以使細胞轉化和具有成瘤性，并可以促進移植瘤的快速出現mdm2癌基因的成瘤性研究用mdm2基因，轉染NIH3T390mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達1992年Oliner等首次報道mdm2癌基因在人體的軟組織和骨的肉瘤中有擴增47例肉瘤中有17例擴增（7例脂肪肉瘤、7例惡性纖組織細胞瘤、3例骨肉瘤）擴增程度從5-50倍不等，在有高度擴增的肉瘤細胞中有高水平的mdm2癌基因產物p90的表達mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達1992年Oliner等91mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Ladanyi等人，研究了28例骨肉瘤（16例原發、11例轉移、1例局部復發）的mdm2癌基因的擴增情況，結果：4例（3例轉移和1例復發）有mdm2癌基因擴增在原發性骨肉瘤中未見有mdm2癌基因的擴增Ladanyi認為mdm2癌基因的擴增可能與骨肉瘤的發展和轉移有關mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Ladanyi等人，研究92mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Reifenferger等，最近發現：mdm2癌基因在人腦腫瘤中有擴增對157例人腦腫瘤檢測發現：8-10%的膠質母細胞瘤和變型星型細胞瘤有mdm2癌基因擴增擴增程度從8-70倍不等mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Reifenferger93mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Sheikh等發現：在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞系中，mdm2mRNA表達水平是雌激素受體陰性細胞系的30倍在良性軟組織腫瘤（脂肪瘤）和結腸、直腸、腎、宮頸癌中未發現有mdm2癌基因的擴增mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Sheikh等發現：94mdm2癌基因研究的展望mdm2癌基因的研究才剛剛起步，初步的研究結果己顯出來，在膠質瘤、骨肉瘤和軟組織肉瘤中有一定關系在骨肉瘤中檢測mdm2的擴增有可能成為一個估計預后的指標mdm2在乳腺癌細胞系中的擴增，但在胃腸道和宮頸癌中未發現有擴增在其它腫瘤的表達情況及與臨床病理學特征的關系有待進一步探討mdm2癌基因研究的展望mdm2癌基因的研究才剛剛起步，初95mdm2癌基因研究的展望

mdm2癌基因表達產物在人類為p90p90可以與p53蛋白形成復合物（p90-p53），使p53失活mdm2的精確功能尚不清楚，因此它的過度表達是否可以通過其它機理，而不是通過滅活p53而促進腫瘤生長?對其表達產物的氨基酸序列分析發現，具有與DNA結合特定模序mdm2癌基因研究的展望

mdm2癌基因表達產物在人類為p96mdm2癌基因研究的展望mdm2基因位于12q，在這個區域還有其它兩個基因sas和gil，這兩個基因在一些惡腫瘤中也有擴增在膠質瘤、軟組織和骨肉瘤中位于染色體同一區域的mdm2、sas和gil會不會同時擴增，擴增程度等仍是值得探討的問題mdm2癌基因研究的展望mdm2基因位于12q，在這個區97p16基因1994年（美國冷泉實驗室Kamb等）新發現的抗癌基因又叫MTS（multipletumorsuppressor1）基因是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調控，負調節細胞增殖及分裂在人類50%腫瘤細胞株中發現有純合子缺失，突變，認為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因有人把它比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導致細胞惡性增殖，導致惡性腫瘤發生p16基因1994年（美國冷泉實驗室Kamb等）新發現的98p16基因在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發現：p16基因純合子缺失，無義、錯義移碼突變，表明p16基因以缺失，突變方式廣泛參與腫瘤形成檢測p16基因有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預測腫瘤的預后，具有十分重要的臨床意義p16基因在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、99p16基因結構及表達p16基因定位于人染色體9p21，由2個內含子及3個外顯子組成第1外顯子由126bp組成第2外顯子由307bp組成第3外顯子由bp組成p16基因是細胞周期中的一種基本基因，其表達產物直接參與細胞增殖的負調節p16基因如何調整起始轉錄？其相關調節因子有哪些？如何調節？尚不清楚p16基因結構及表達p16基因定位于人染色體9p21，由2個100p16基因的表達產物及功能p16基因編碼產物是p16蛋白，定位于細胞核內DavidBeach等證明：p16蛋白是作用于細胞分裂周期（celldivisioncycle，cdc）的關鍵酶之一是CDK（cyclin-dependentkinase）的抑制因子p16基因的表達產物及功能p16基因編碼產物是p16蛋白，定101p16基因的表達產物及功能cdc基因編碼產物是蛋白激酶，參與調控G1-S，G2-M的關鍵點轉換控制細胞分化的機制涉及到多種組成成分，最重要的是細胞周期素（cyclin）Cyclin：周期性累積與分解對細胞周期時程的調控作用CDK與cyclin復合體分別在細胞周期的不同時相發揮作用，啟動DNA復制及誘發有絲分裂CDK可能是調控細胞周期裝置的核心，通過對一系列關鍵底物磷酸化作用來調節細胞周期p16基因的表達產物及功能cdc基因編碼產物是蛋白激酶，參與102CellcycleCellcycle103p16基因的表達產物及功能CDK與cyclin復合體參與G1-S轉換的調控p16蛋白抑制CDK活性，最終阻止細胞進入S期p16基因（因缺失，突變等原因）功能缺失，則不能抑制CDK，最終導致細胞進入惡性增殖，加速腫瘤發生p16基因的表達產物及功能CDK與cyclin復合體參與G1104p16基因的表達產物及功能CDK-cyclin可作用于多種癌基因產物，如：pp60c-syc，c-abl產物，對其進行磷酸化修飾調節，CDK-cyclin亦可作用于某些抗癌基因產物，如：Rb蛋白磷酸化后則生長抑制功能喪失，在G1/S交界處，CDK-G1cyclin，使Rb磷酸化而失活，細胞從靜止態進入增殖態可見，p16基因是一種非常重要的抗癌基因，p16基因失活，則會引起細胞惡性增殖p16基因的表達產物及功能CDK-cyclin可作用于多種癌105p16基因與腫瘤Gianic等：定量PCR檢測了32例惡性神經膠質瘤的p16外顯子2發現：59%惡性神經膠質瘤中，p16基因的量有改變，根據光密度掃描，24%的病人是因p16基因純合子缺失所致p16基因與腫瘤Gianic等：106p16基因與腫瘤JenJ，等：PCR技術檢測57例腦腫瘤p16基因發現26例出現純合子缺失p16基因與腫瘤JenJ，等：107p16基因與腫瘤Kamb等從肺癌、乳腺癌、囊腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、淋巴瘤等中檢測出50%以上的p16基因純合子缺失在黑色素瘤中，還檢出無義錯義，移碼突變研究表明：p16基因參與了各種組織的腫瘤形成檢測p16基因的突變與缺失，是判斷腫瘤的性質及預后的一項重要指標p16基因與腫瘤Kamb等108p16基因與腫瘤p16基因體積小，只有p53的1/10p16基因用于基因診療、更易操作，對臨床腫瘤治療更具有現實意義研究p16基因正是目前及今后一段時期的熱點p16基因與腫瘤p16基因體積小，只有p53的1/10109抗腫瘤基因的實驗證據

1．遺傳性腫瘤中某些基因的丟失早在70年代已經證明：某些遺傳性腫瘤中染色體的某些位點可發生專一的丟失視網膜母細胞瘤的40％屬先天性這些遺傳性病例（大多為雙側性）的患兒，約5％可見13q14的一個等位基因位點的缺失，而且腫瘤發生時，腫瘤細胞中另一個等位基因也發生了缺失，成為純合體提示：第一次的缺陷屬先天性，第二次屬體細胞突變（A.Kmudson，提出了“兩次突變”學說）抗腫瘤基因的實驗證據

1．遺傳性腫瘤中某些基因的丟失110只有兩個等位基因同時缺失時才發生視網膜母細胞瘤，因此這種抗視網膜母細胞瘤的原癌基因（Rb基因）具有顯著性的意義根據酯酶D的測定和與染色體13有關的限制性內切片段長并多態性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）證明：至少50％的視網膜母細胞瘤細胞中存在純合體的13q14、20缺失經治療后痊愈的兒童，以后易患肉瘤，而這種瘤細胞中也發現了13號染色體標志位點的缺失只有兩個等位基因同時缺失時才發生視網膜母細胞瘤，因此這種抗視111另一個相似的例子是腎母細胞瘤（Wilm瘤），在腫瘤細胞中出現純合子的11q13的缺失11p標記位點的缺少還與肝母細胞瘤，小兒橫紋肌肉瘤、腎上腺皮須癌有關另一個相似的例子是腎母細胞瘤（Wilm瘤），在腫瘤細胞中出現112抗腫瘤基因的實驗證據

2.正常和惡性細胞雜交中正常染色體對惡性行為的抑制應用體細胞雜交技術，正常細胞與惡性細胞雜交后所形成的雜體細胞，其惡性程度降低，但隨著正常染色體被逐－排斥，惡性度又恢復正常小鼠成纖維細胞和惡性轉化細胞雜交后，抑制惡性生長的基因位于小鼠染色體4正常人成纖維細胞與中國倉鼠或金倉鼠惡性轉化細胞雜交時，抑制惡性行為的基因分別位于染色體2或1正常人成纖維細胞和人HeLa細胞雜交時，這種“阻抑基因”位于染色體11及14不同種屬，不同種類惡性細胞的抗腫瘤基因的種類不相同抗腫瘤基因的實驗證據

2.正常和惡性細胞雜交中正常染色113抗腫瘤基因的性質和生物學意義由于對抗腫瘤基因編碼的產物尚不了解，所以目前仍難以說明抗腫瘤基因的性質和確切的生物學功能R.Sager推測：抗腫瘤基因的產物包括不少抑制細胞生長的物質，其中有抑素（chalone）生長抑制因子（GIF）細胞MHC-1抗原（有助于機體免疫系統的有效識別）抗腫瘤基因的性質和生物學意義由于對抗腫瘤基因編碼的產物尚不了114抗腫瘤基因可能包括：1．編碼抑制細胞生長的一些物質

2．基因表達的調節控制序列，包括trans調節或cis調節的負控制區

3．調控基因組穩定性的某些基因以上僅僅是根據現有材料的一些推測，將有待于實驗的證實抗腫瘤基因可能包括：1．編碼抑制細胞生長的一些物質

2．基因115最近，有三方面的實驗室結果，比較直接提供存在抗瘤基因的證據Rb基因的分離：美國哈佛大學麻省理工學院加州大學分別分離出Rb基因的cDNA及其DNA序列分析最近，有三方面的實驗室結果，比較直接提供存在抗瘤基因的證據R116證據Friend.S.H.等人用一個定位于13q14、11，以前用于Rb基因限制性內切酶長度多態性研究的DNA片段H3-8為探針，從人胎盤cDNA文庫中篩選出一個4.7kb的cDNA片段，并同時分離出相應的基因片段的克隆，用上述cDNA為探針，可在正常人的組織DNA中看到雜交信號，而在部分的視網膜母細胞瘤的DNA中則可看到信號的缺失證據Friend.S.H.等人用一個定位于13q14、11，117證據如果用Nouthern吸印雜交的技術來檢測正常人某些組織及視網膜母細胞瘤的mRNA，可發現在前才有4.7kb的信號，而在后者則此mRNA缺失目前該cDNA的全部DNA序列已經測出

證據如果用Nouthern吸印雜交的技術來檢測正常人某些組織118證據李文華（WH.Lee）等人，利用酯酶D的基因，通過染色體移步（chromosomalwalking）應用cDNA和單一順序DNA片段向兩側延伸，終于分離到Rb基因的cDNA及基因片段此cDNA長4.6kb，涉及到的基因大于100kb，由27個外顯子組成。從cDNA序列分析，預計可翻譯出816個氨基酸組成的多肽在視網膜母細胞瘤中，不僅可見基因的部分丟失，而且可看到mRNA轉錄物的缺失或異常證據李文華（WH.Lee）等人，利用酯酶D的基因，通過染色體119另一方面，對Wilm瘤的研究也有所突破：Stambridge等人，應用微細胞雜交技術，首次證明了將11號染色體短臂片段導入Wilm瘤細胞，可使細胞喪失在軟瓊脂中生長的能力和在裸鼠體內的成瘤能力。但對瘤細胞的形態、c-myc、N-myc及c-sis的表達均無影響用其它染色體片段如13號染色體對Wilm瘤的成瘤能力并無作用實驗結果表明，11號染色體上的抗瘤基因產物與腫瘤形成后期存在某種聯系

另一方面，對Wilm瘤的研究也有所突破：120對癌基因與抗癌基因的評論如果說癌基因是一個涵義混亂不確切的命名，抗癌基因是同樣的模糊不清所謂癌基因與抗癌基因都是一大類控制細胞生長和分化的基因，對其單個基因來說，它的產物所具有的功能因細胞種類甚至細胞發育階段而異對癌基因與抗癌基因的評論如果說癌基因是一個涵義混亂不確切的命1211．癌基因與抗癌基因的相對意義同一種癌基因及其產物，在不同細胞中可起完全相反的作用最典型的例子是ras基因及其產物p21。在成纖維細胞中已有充分證據說明，微量注入p21蛋白能使細胞迅速進入S期和開始分裂。人ras基因可使成纖維細胞和某些上皮細胞惡變。但對點突變的嗜鉻細胞瘤pc12細胞，將ras基因引入或微量注射p21使惡性細胞停止分裂并開始分化。src基因對雞成纖維細胞中的致癌作用是確定無疑的，但在胚胎發育過程中，src基因的表達神經系統的分化密切相關，估計這樣的例子可能不盡是個別的1．癌基因與抗癌基因的相對意義同一種癌基因及其產物，在不同細122從生物學意義上來說，ras基因對成纖維細胞來說是癌基因，對交感神經切來源的pc12來說是抗癌基因。同一基因的產物，是促進生長或抑制生長，是抗癌還是致癌，似乎不取決于該基因的本身，而決定于細胞類別的差異。同時提示不同細胞中以ras基因產物的效應系統不同，因此最后的生物學功能也不同。從生物學意義上來說，ras基因對成纖維細胞來說是癌基因，對交1232.促進和抑制生長物質的雙重性顧名思義，應將生長因子列入癌基因的范疇，而生長抑制因子則應屬抗癌基因之列。事實上，生長因子對不同細胞的作用差別很大，除了受體的因素外，生長因子既可促進細胞生長，也可抑制細胞生長。同樣，生長抑制因子既可抑制細胞生長，也可促進細胞生長。因此，不區別細胞的種類即判斷哪些基因是促進或抑制生長，顯然是不合理的2.促進和抑制生長物質的雙重性顧名思義，應將生長因子列入1243．腫瘤是一種異常生長早在上一世紀，Virchow已提出腫瘤是一種異常生長的疾病。癌細胞是一種以自主的，帶有分化缺陷的持續生長的細胞癌基因與抗癌基因的研究，尤其是前者，從基因水平揭開了控制細胞生長和分化的物質基礎，應該既不受癌基因或抗癌基因的概念所束縛，同時也充分利用上述研究的大量材料，來揭示腫瘤發生3．腫瘤是一種異常生長早在上一世紀，Virchow已提出腫瘤125評論：癌基因研究的戰略及具體技術目前癌基因的研究，極需在概念和技術上有所突破概念問題現從戰略角度來討論目前癌基因研究技術路線的得與失，并提出當前需要發展的技術路線及其可行性問題評論：癌基因研究的戰略及具體技術目前癌基因的研究，極需在概念126傳統的研究技術路線—1各實驗室用于分離癌基因的技術路線大體上有以下幾個方面：

1．癌細胞的基因組DNA，通過DNA轉染后導入某些受體細胞。發生惡性轉化后，組建轉化細胞株的基因文庫，從中分離出癌基因的克隆具體分以下幾個環節：

傳統的研究技術路線—1各實驗室用于分離癌基因的技術路線大體上127傳統的研究技術路線—1

環節之一：癌細胞的材料來源，文獻報道，多數直接癌的體外細胞株作為材料，其優點是材料易得而且單純，易于提取到較完整的高分子DNA。缺點是體外培養過程中，癌細胞的某些原癌基因可發生突變，新的原癌基因也可被激活，因此與體內原發性腫瘤的癌基因譜不一定相同。所以，對某種特定的癌來說，材料來源奕以原發性腫瘤為主，可以癌細胞株的研究提供相互驗證。但原發性腫瘤的材料不均一，常伴有壞死，提取高分DNA有時會遇到一定困難，因此在提取DNA時應注意防止DNA的降解

傳統的研究技術路線—1

環節之一：癌細胞的材料來源，文獻報道128傳統的研究技術路線—1

環節之二：高分子DNA的提取用于DNA轉染的DNA，要求并不高。在轉染前，還將用針筒吸抽或其它機械方法將DNA分子撕裂至60kb左右，以利于導入細胞。由于這樣的處理，使用DNA轉染技術獲得的轉化基因一般在50kb以下。這是DNA轉染在技術上的限制傳統的研究技術路線—1

環節之二：高分子DNA的提取用于DN129傳統的研究技術路線—1

環節之三：受體細胞的選擇基因轉移的常用的受體細胞為小鼠NIH3T3細胞，大鼠RAT-1細胞，倉鼠CHEF細胞。上述細胞都屬成纖維細胞。少數實驗已開始用小鼠腎上皮細胞。上述細胞中，NIH3T3對接受外源轉化基因而發生惡性極為敏感，但自發生轉化率高。過去不少作者提出責難：NIH3T3細胞為一種“非整倍體”細胞，已屬非正常細胞，所以應用NIH3T3作為受體細胞大多獲得的轉化基因仍多屬ras族。因此認為，為什么獲得上述結果，另有原因。這是由于DNA轉染技術本身的局限性傳統的研究技術路線—1

環節之三：受體細胞的選擇基因轉移的常130傳統的研究技術路線—1

環節之四：DNA轉染目前最常用的基因轉移方法是DNA轉染，即將DNA直接放入培液，通過一定方式，使它進入受體細胞傳統的研究技術路線—1

環節之四：DNA轉染目前最常用的基因131DNA導入的技術有—1：

——磷酸鈣沉淀法原理：利用pH7.01磷酸鈣形成細顆粒，DNA吸附于顆粒而被導入細胞優點：方法簡便、易于重復缺點：轉移導入的效率低，均在10-6-10-7之間DNA導入的技術有—1：

——磷酸鈣沉淀法原理：利用pH7.132DNA導入的技術有—2：

——電穿孔技術原理：利用高壓電場，對細胞進行脈沖式處理，使細胞表面通透性改變，有利于DNA分子進入細胞其效率一般比磷酸鈣方法提高二個數量級或更多DNA導入的技術有—2：

——電穿孔技術原理：利用高壓電場，133DNA導入的技術有—3：

——抗藥基因的共轉染由于DNA導入的效率很低（最高僅10-3），因此如果共同導入抗藥基因，可通過藥物去除大量未被轉染的細胞，在具有抗藥性的細胞中選擇出惡性轉化細胞，而且會顯著降低自發轉化灶的背景數常用的抗藥基因為pSV2-neo。用G418進行篩選的缺點是G418價格昂貴DNA導入的技術有—3：

——抗藥基因的共轉染由于DNA導134傳統的研究技術路線—1

環節之五：

轉化細胞的篩選經典的方法是通過G418篩選后，在轉染后21在左右，收集轉化細胞灶，分別擴增。然后將轉化細胞通過軟瓊脂生長，推測其生長能力。若獲得細胞集落，將其收集后，再度擴增。達到一定細胞數后，按106-107細胞．鼠接種裸鼠，鑒定其在體內的成瘤能力。若獲得陽性結果，從上述細胞株或裸鼠腫瘤中提取出DNA，經Southern轉移雜交，確定是否有人的DNA順序整合入鼠類的基因組。探針一般應用人的總DNA或Alu序列。若結果為陽性，說明獲得了第一輪轉化細胞株。必要時，還需用上述轉化細胞株的DNA，再次轉染受體細胞，進行第二輪、第三輪DNA轉染，以純化具有轉化活性的人DNA序列。傳統的研究技術路線—1

環節之五：轉化細胞的篩選經典的方法135最近二年來，G.VandeWoude及D.Blair的實驗室，采用了簡化的篩選方法：經藥物G418篩選后，將大量擴增的細胞直接種裸鼠，觀察是否有腫瘤形成。這樣可明顯節省時間和人力。上述方法存在的共同問題是：在DNA轉染后，細胞經藥物篩選、擴增、裸鼠內生長的不同階段中，外源導入的DNA序列可發生突變和DNA重排。因此有可能會發現原癌基因的重排或實變，即人為的激活。例如trk和mas這兩個癌基因是在DNA轉染中所發生的兩個基因片段的重排和拼接的結果。因此，對結果的分析必須極為謹慎。最近二年來，G.VandeWoude及D.Blair的實驗室136傳統的研究技術路線—1

環節之六：

轉化細胞株基因文庫的建立基因文庫的組建技術，可參考分子克隆技術的專著（T.Maniatis等）。但在技術上提出幾點，可供讀者參考：1）基因組DNA的部分酶切：按T.Maniatis的步驟，用不同酶量，先小樣后放大在量，很難重復，往往失敗，浪費得之不易的DNA樣品。我們采用定量酶（一般以0.2U/μgDNA），酶切不同時間，從而選出獲得不完全酶切的最佳時間和條件，然后放大樣進行反應，其優點是重復性強。該方法已成為本實驗室的常規方法。傳統的研究技術路線—1

環節之六：轉化細胞株基因文庫的建立137傳統的研究技術路線—1

環節之六：

2）載體的選擇：目前最常用的是EMBL3或EMBL4噬菌體系統。其優點是：可用雙酶切（EcoRI及BamHI），使噬菌體載體難以重組，因此不需對噬菌體雙臂加以純化；應用的受體菌為Spi-，大大降低了非插入性噬菌體的背景3）應用上述載體系統，在包裝后，可按1×105pfu/平皿的滴度用平板進行擴增，獲得>108-109pfu/ml的基因文庫重組噬菌體（一般為50ml以上）。這樣的基因文庫可儲存一年以上，供上百次的篩選。傳統的研究技術路線—1

環節之六：2）載體的選擇：目前最常138傳統的研究技術路線—1

環節之七：

基因的篩選及克性化若為未千的癌基因，可用人總DNA作為探針進行篩選；若為已千的癌基因，則用相應的癌基因探針。選摜的噬菌體密度增加至105pfu/15cm直徑平皿。這樣可前顯增加篩選出陽性克隆的機率，經過三輪篩選，可期獲得純化的分子克隆。傳統的研究技術路線—1

環節之七：基因的篩選及克性化若為未139傳統的研究技術路線—2對已知的有染色體易位的癌基因進行分離：如：慢性髓細胞白血病中有abl與bcr的重排，形成ph1染色體。由于abl基因大于100kb，不可能通過DNA轉染或從基因文庫中分暾出c-ablBaltimore實驗室從cRNA文庫中獲得了全長的c-abl的cDNA。從c-abl的cDNA同時可獲得重排的bcr基因采用這種方法要有兩個前提：一是這種染色體易位要有代表性；二是其中一個癌基因是已知的傳統的研究技術路線—2對已知的有染色體易位的癌基因進行分離：140傳統的研究技術路線—3分析癌基因或原癌基因的轉錄產物即mRNA；由于過量表達也是原癌基因被激活的一種形式，同時過量的表達產、物，即使沒有突變，同樣可導致細胞的惡性轉化，如Ha-ras原癌基因在上游區安裝強的啟動子后同樣可以使NIH3T3細胞發生惡性轉化，因此分析腫瘤的mRNA表達，也可提供原癌基因被激活的證據。但是必須注意幾點：傳統的研究技術路線—3分析癌基因或原癌基因的轉錄產物即mRN141傳統的研究技術路線—3

注意點：1.必須有相應的正常組織和癌旁的增生組織為對照。以肝癌為例，應以肝癌的周圍肝組織作為對照2.用β－actin或其它基因作為內對照，以排除mRNA制備過程中降解所造成的差異

傳統的研究技術路線—3

注意點：1.必須有相應的正常組織和142傳統的研究技術路線—3

注意點：3.用Northern轉移和雜交的結果說明的是mRNA的水平，它代表轉錄水平、轉錄后加工以及mRNA的代謝速度（半衰期長短）的總和，但并不等于轉錄水平的高低4.如果用細胞核和32P-UTP摻入，然后進行分子雜交，則反應了轉錄階段mRNA延伸的速度及數量，一般說來，可提示轉錄水平，但不等于最后成熟的mRNA水平。因此，在解釋以上3)、4)兩個方面的實驗結果時，必須注意其實際的內容傳統的研究技術路線—3

注意點：3.用Northern轉移143新的戰略的探索1．應用癌細胞的cDNA基因文庫進行DNA轉染：由于在轉染過程中應用的基因組，能進入細胞并完整地整合于受體細胞基因組的外源DNA片段，一般僅在50kb以下，因此應考慮采用cDNA文庫作為轉染的DNA來源。但存在問題是，必須獲得所謂全長cDNA文庫。在技術上來講這是有相當難度的，同時，cDNA整合后，能否持久表達，也還在不少未知因素，但是，這仍是值得設法采用的技術。新的戰略的探索1．應用癌細胞的cDNA基因文庫進行DNA轉染144新的戰略的探索2．應用細胞融合來代替DNA轉染：存在問題是該技術只能限于人癌細胞和異種細胞（NIH3T3或RAT-1）的融合。若用人－人細胞雜交，對外源的基因難以選擇。新的戰略的探索2．應用細胞融合來代替DNA轉染：存在問題是該145新的戰略的探索3．應用人體細胞作為受體細胞這更接近于人體腫瘤癌變模型，但存在的問題是：（1）只適用物已知的癌基因，并需帶有質粒載體，后者可用來作為選擇的標記（2）用人癌細胞或其DNA來轉染，由于缺乏選擇的標記，無法辨認外源的基因（3）人體細胞對一般已知的癌基因如ras、myc均具有抗性，即不出現惡性的表型新的戰略的探索3．應用人體細胞作為受體細胞這更接近于人體腫瘤146腫瘤相關基因腫瘤相關基因147腫瘤相關基因癌基因抑癌基因腫瘤轉移基因腫瘤轉移相關基因腫瘤轉移抑制基因腫瘤相關基因癌基因148癌基因（oncogene）病毒癌基因

virusoncogene（v-onc）細胞癌基因

cellularoncogene（c-onc）原癌基因proto-onc癌基因（oncogene）病毒癌基因

virusoncog149病毒癌基因

virusoncogene（v-onc）1968年Duesberg等首次發現Rous肉瘤病毒基因組編碼酪氨酸蛋白激酶基因，證實它在細胞轉化中起關鍵作用來自病毒，因而被命名為病毒癌基因病毒癌基因

virusoncogene（v-onc）196150細胞癌基因

cellularoncogene（c-onc）1972年Bishop核酸分子雜交法證實：幾乎在所有高等動物細胞基因組中，都有和v-onc相似的DNA序列這些序列是細胞基因組的成員之一，其編碼的產物具有重要的功能細胞癌基因在正常情況下的表達有時間、空間限制，表達產物參與細胞分化、增殖細胞癌基因

cellularoncogene（c-onc）151原癌基因（proto-onc）未激活的細胞癌基因在人體正常細胞中存在是一種正常基因作用：調控細胞生長和分化廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細胞中都存在原癌基因（proto-onc）未激活的細胞癌基因152原癌基因的分類按原癌基因的結構、產物的功能、所在的位置分為下列四類：

1.蛋白激酶類

2.信息傳遞蛋白類

3.生長因子及其受體類

4.核內蛋白類原癌基因的分類按原癌基因的結構、產物的功能、所在的位置分為下153細胞癌基因與致癌癌基因在生物進化中具高度保守性正常細胞中的癌基因和腫瘤細胞中的癌基因的核苷酸順序十分相似，后者可使NIH3T3細胞惡性轉化，前者需經激活后才具有轉化能力說明：在正常情況下細胞癌基因不致癌，生理條件下內外環境中的某些刺激可激活癌基因，從而調節細胞的生長、分化和信息傳遞細胞癌基因與致癌癌基因在生物進化中具高度保守性154通常認為：癌基因并不是腫瘤所特有是細胞的正常基因能誘導正常細胞發生轉化，并使正常細胞獲得一個或多個新的生物特性的基因只有在被激活后發生異常表達時，才會導致細胞發生惡性轉化通常認為：癌基因并不是腫瘤所特有155細胞癌基因的生理功能主要表現為：①調節細胞生長②參與細胞分化和發育過程具有正常生理功能的同時又具有潛在致癌能力的原癌基因，其致癌潛能的發揮，首先需要被激活細胞癌基因的生理功能主要表現為：①調節細胞生長156常見的激活因素：病毒

化學物質

輻射常見的激活因素：病毒

157原癌基因的激活機理1.DNA重排2.基因放大3.點突變4.其它調控的異常原癌基因的激活機理1.DNA重排158DNA重排插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達負調控區的失活或丟失

DNA重排插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、159DNA重排

1插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達插入的啟動子或增強子來自細胞外（外源性）如：雞B淋巴細胞瘤由于ALV的LTR插入c-myc的旁側（5’或3’端），使c-myc過量表達插入的啟動子或增強子來自細胞內（內源性）如：內源性逆轉錄病毒的LTRDNA重排

1插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基160染色體易位是原癌基因DNA重排的典型例子人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因與c-myc的重排，使c-myc激活c-myc基因定位于8q24，Ig、Ig、Igλ鏈的基因位點分別定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位點的高活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生DNA