昆醫分生蛋白質分子建模與設計昆醫分生蛋白質分子建模與設計1（優選）昆醫分生蛋白質分子建模與設計（優選）昆醫分生蛋白質分子建模與設計2ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsProteinFoldingoccursinthec3UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunctionUnrelatedproteinsassumesimi引言在人體的進化過程中蛋白質執行了在人體及體外的許多重要任務：酶是催化化學反應的蛋白質或者核酸分子；抗體起到防護的作用;……從生態角度，蛋白質也是非常理想的物質:生物合成不需要消耗很多能量專一性很強不產生副作用并且能很快降解引言在人體的進化過程中蛋白質執行了在人體及體外的許多重要任務5蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:(1)蛋白質分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學方法生產;(2)蛋白質的功能是在生理條件下揮發的，在其它條件下(如在有機溶劑中)是不穩定的;(3)專一性致使其應用范圍受到影響。

蛋白質應用受限的原因蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:蛋白質應用受限的6蛋白質設計目前存在的問題1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性2、三級結構的確定性較差蛋白質設計目前存在的問題7RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和無論是從設計或合成看，是簡單的；1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性異源專一性的計算機重新設計或者在結合腔內對一個已知的結構骨架進行化合物的衍生化。刪除一個或多個氨基酸殘基；改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。二、蛋白質結構的從頭設計抗DON單鏈抗體改體研究1．建立所研究蛋白質的結構模型Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。二、蛋白質結構的從頭設計依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較；10×TaqPCRBuffer5μL2．突變方法鑒定突變功能殘基計算機模擬突變蛋白質產品功能分析基因構建Pr設計循環第一節蛋白質分子設計原理RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例計算機模8蛋白質分子設計的流程天然蛋白質蛋白質結構預測蛋白質晶體學蛋白質三維結構結構與功能的關系蛋白質突變體設計及結構預測幾何優化及蛋白質動力學研究結果分析與原先的結構比較蛋白質合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質數據的輸入蛋白質分子設計的流程天然蛋白質蛋白質結構預測蛋白質晶體學蛋白9Pr突變體設計的3個步驟利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的aa利用能量優化及動力學方法預測修飾后的蛋白質結構預測的結構與原始的Pr結構比較，利用Pr結構-功能或結構穩定相關知識及理論計算機預測新Pr可能具有的性質Pr突變體設計的3個步驟利用計算機模擬技術確定突變位點及替換10英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分子上作了實驗(人源化抗體)VL(3)專一性致使其應用范圍受到影響。occursinthecytosol72℃40s，25個循環；制備感受態細胞無論是從設計或合成看，是簡單的；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。同時利用能量優化及蛋白質動力學方法預測修飾后的蛋白質結構，以修正所選擇的氨基酸位點和突變后的氨基酸種類。把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。differentlength二是在三維結構未知的情況下，借助一級結構序列信息及生物化學性質進行分子設計工作。（一）定位突變的設計目標及解決方法二、蛋白質結構的從頭設計從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.occursinthecytosol蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結合

英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分11在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結合

昆醫分生蛋白質分子建模與設計新版課件12

蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。（內部十分保守的區域）Pr內部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結合一個水分子或惰性氣體），沒有重疊蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白13所有內部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側鏈）。蛋白質的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質鍵所取代疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應的主要驅動力

蛋白質分子設計原理所有內部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側鏈）。蛋白質的氫鍵形成14金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數目的蛋白質側鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質主鏈的相互作用。

蛋白質分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心15最優的aa側鏈幾何排列。Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)結構及功能的專一性。這是Pr設計最困難的問題

蛋白質分子設計原理蛋白質分子設計原理16一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：

一是為有目的的蛋白質工程改造提供設計方案和指導性信息，如以此提高蛋白質的熱、酸穩定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：17二是探索蛋白質的折疊機理，如簡單蛋白質骨架的從頭設計是研究蛋白質內相互作用力的類型及本質的很好途徑，也為解決蛋白質折疊問題尋找定性和定量的規律。

二是探索蛋白質的折疊機理，如簡單蛋白質骨架的從頭設計是研究蛋18（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：一是在蛋白質三維結構已知基礎上的分子設計；二是在三維結構未知的情況下，借助一級結構序列信息及生物化學性質進行分子設計工作。（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：19（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法2．拼接組裝設計法3．從頭設計全新蛋白質（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法20二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計2．對專一性的設計3．Scaffold設計(框架)4．疏水基團與親水基團需合理分布5．最優的氨基酸側鏈幾何排列二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計21白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和（四）蛋白質中功能殘基的鑒定基于天然蛋白質結構的分子設計有兩類：利用蛋白質結構-功能或結構-穩定性相關知識及理論計算預測新蛋白質可能具有的性質；我們知道,蛋白質的空間結構受其氨基酸序列控制,而功能又與結構密切相關。0％的瓊脂糖電泳檢測。VH如組合化學方法應用到蛋白質生物合成不需要消耗很多能量Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)如果能夠找到構造蛋白質結構的方法,我們就能得到具有任意結構和功能的全新蛋白質,這就是蛋白質全新設計問題。依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。(A)β-sheetbarrel(紅色)（二）全新蛋白質設計目標的選擇非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。involveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.VH結構骨架模板、分級迭代算法插入一個或多個氨基酸殘基；異源專一性的計算機重新設計溶菌酶結構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計過程中，其中EFAEEAASF多肽能水解幾丁質和葡聚糖，但糖苷酶活性較低。

Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和溶菌酶結構例如:雞卵清22設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢測結構信息分析建立結構模型設計目標蛋白質數據庫設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢23序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設計全β結構時，應選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設計轉角時常選擇Pro-Asn殘基對。序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋24第二節基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子設計有兩類：一是進行蛋白質修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進行蛋白質分子裁剪拼接，即“中改”。

第二節基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子25一、定位突變

基于天然蛋白質結構的蛋白質分子“小改”是指對已知結構的蛋白質進行少數幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質修飾和基因定位突變兩類。一、定位突變26（一）定位突變的設計目標及解決方法

定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。（一）定位突變的設計目標及解決方法定位突變常見的27Hartley等于1986年完成了一個我們所要的設計目標及解決的辦法：熱穩定性對氧化的穩定性對重金屬的穩定性pH穩定性提高酶學性質引入二硫橋，增加內氫鍵數目，改善內疏水堆積把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉數，改變酸堿度Hartley等于1986年完成了一個我們所要的設計目標及解28（二）定位突變的種類

要進行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學合成、基因直接修飾法、盒式突變技術等。根據基因突變的方式，分為以下三類：插入一個或多個氨基酸殘基；刪除一個或多個氨基酸殘基；替換或取代一個或多個氨基酸殘基。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。（二）定位突變的種類要進行基因定位突29（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型

可以通過X射線晶體學、二維核磁共振等測定結構，也可以根據類似物的結構或其他結構預測方法建立起結構模型。（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型302．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當地選擇突變殘基是一個關鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質，同時還需要借助于已有的三維結構或分子模型。2．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當地選擇313．預測突變體的結構

根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較；利用蛋白質結構-功能或結構-穩定性相關知識及理論計算預測新蛋白質可能具有的性質；同時利用能量優化及蛋白質動力學方法預測修飾后的蛋白質結構，以修正所選擇的氨基酸位點和突變后的氨基酸種類。3．預測突變體的結構根據所選定的氨基324．構建突變體，獲得突變體蛋白

依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。4．構建突變體，獲得突變體蛋白332、三級結構的確定性較差<3aa本實驗將能夠各自產生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達出能同時與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結合的雙特異性單鏈抗體。研究蛋白質質折疊規律的重要手段。蛋白質全新設計不僅使我們有可能得到定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。二、蛋白質分子設計的原則蛋白質全新設計不僅使我們有可能得到能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。2、三級結構的確定性較差（一）全新蛋白質設計程序1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設計74aaββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.12345678VLT1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。5．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的序列、三維結構、穩定性、催化活性等，并與對應的天然蛋白質進行比較，檢驗突變設計的效果，同時進一步修正設計方案。2、三級結構的確定性較差5．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的34蛋白質中功能殘基的鑒定根據結構信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質中功能殘基的鑒定蛋白質中功能根據結構信息利用蛋白質同源性（四）蛋白質中功能殘351．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的絲氨酸所取代后的結構，發現Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。1．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法362．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進另外一種突變來檢測隨機突變技術刪除分析及連接片段掃描突變2．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進另外一種突變來檢測373．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結構有關。非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。探測突變蛋白質的結構整體性質，以鑒定突變殘基。3．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白38（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的39二、蛋白質分子拼接例如，有一種和癌癥的發病有關的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個大小和形狀都非常相似的結構域拼接構成的，各結構域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發現，癌胚抗原的這種多結構域特征有利于它的細胞識別和粘合作用。二、蛋白質分子拼接40而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。2、三級結構的確定性較差要求圍繞金屬中心放置合適數目的蛋白質側鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。M12根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。Anti-DONgene改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化質折疊規律的認識還不夠,所以蛋白質全新二、蛋白質結構的從頭設計differentlength插入一個或多個氨基酸殘基；（二）蛋白質結構的從頭設計實例能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。Anti-DONgene如組合化學方法應用到蛋白質Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結合金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。VH和VL的PCR擴增結果ββα型異源四聚體的設計歷程探測突變蛋白質的結構整體性質，以鑒定突變殘基。白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分子上作了實驗(人源化抗體)而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾41單鏈抗體scFv結構（抗體工程)抗DON單鏈抗體改體研究DON:小麥鐮刀菌毒素單鏈抗體scFv結構（抗體工程)抗DON單鏈抗體改體研究DO42

單鏈抗體的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL單鏈抗體的linker改造43

單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH單鏈抗體的改體模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥44

Linker

XhoⅠSalISalⅠSalⅠXhoⅠ雙酶切EcoRIXhoⅠ雙酶切EcoRISalI雙酶切differentlength連接ＶＨＶＬ

技術路線EcoRILinkerXhoⅠSalⅠEcoRIEcoRIdi45轉化篩選、檢測

蛋白質的誘導生成

表達載體構建

感受態細胞的制備純化親和力初步測定轉化篩選、檢測蛋白質的誘導生成表達載體構建感受態細46PCR擴增重鏈、輕鏈策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2PCR擴增重鏈、輕鏈策略47PCR反應體系及反應條件50L反應體系如下：10×TaqPCRBuffer5μLdNTP(2.5mM)3μLForwardPrimer(20mM)1μLReversePrimer(20mM)1μLTemple1μLrTaq0.3μL

AddddH2Otoafinalvolumeof50μLPCR循環條件為：94℃5min，1個循環；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31個循環；72℃40s，25個循環；72℃7min，1個循環。取PCR產物5μL，1.0％的瓊脂糖電泳檢測。PCR反應體系及反應條件50L反應體系如下：

48VH

和VL的PCR擴增結果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000VH和VL的PCR擴增結果１２３４５９６７８7500149

菌落PCR重組子驗證123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100菌落PCR重組子驗證150

改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化151

改體抗體的ELISA初步測定312456789101112改體抗體的ELISA初步測定3124567891011152在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；1．建立所研究蛋白質的結構模型XhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ一、全新蛋白質設計方法Temple1μL（一）全新蛋白質設計程序基于天然蛋白質結構的蛋白質分子“小改”是指對已知結構的蛋白質進行少數幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質修飾和基因定位突變兩類。T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的絲氨酸所取代后的結構，發現Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。（二）全新蛋白質設計目標的選擇AddddH2Otoafinalvolumeof50μLTemple1μL能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。<3aa如組合化學方法應用到蛋白質PCR擴增Anti-DON基因單鏈抗體抗體：是體液免疫應答的主要效應分子。由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）組成。雙特異性單鏈抗體的構建與表達在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及53單鏈抗體（scFv）：抗體可變區的重鏈（VH）與輕鏈（VL）通過一段約15-25個氨基酸殘基構成的彈性短肽（Linker）相連，融合表達出來的抗體片斷。

單鏈抗體（scFv）：54雙特異性單鏈抗體能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。本實驗將能夠各自產生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達出能同時與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結合的雙特異性單鏈抗體。玉米赤霉烯酮(ZEN)雙特異性單鏈抗體玉米赤霉烯酮(ZEN)55技術路線

DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設計

PCR擴增目的片段

制備感受態細胞

酶切目的片段、載體，linker連接

轉化連接產物

酶切驗證重組子

表達、純化蛋白技術路線DON和ZEN抗體基因的提取目的基因56載體的構建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ連接

Linker載體的構建Anti-ZENgeneAnti-DONgen57PCR擴增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500PCR擴增Anti-DON基因158PCR擴增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bpPCR擴增Anti-ZEN基因M59重組驗證重組驗證60PCR驗證以重組質粒為模板，進行Anti-DON基因的PCR分析。PCR驗證以重組質粒為模板，進行Anti-DON基因的PCR61取PCR產物5μL，1.AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的絲氨酸所取代后的結構，發現Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。與數目達到最大；一、全新蛋白質設計方法穩定相關知識及理論計算機預測新Pr可能具有的性質（一）定位突變的設計目標及解決方法插入一個或多個氨基酸殘基；替換或取代一個或多個氨基酸殘基。5．突變體蛋白質的檢驗3、評價：使用特定的評分系統將構建的分子與活性位點的匹配性進行排序，可以選擇其中優良的結果作為合成實驗的對象。Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。VL最優的aa側鏈幾何排列。T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。酶切目的片段、載體，linker連接ββαT2異源四聚體衍生物ββαhetT1的X-射線結構(Alietal.最優的aa側鏈幾何排列。改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化如果能夠找到構造蛋白質結構的方法,我們就能得到具有任意結構和功能的全新蛋白質,這就是蛋白質全新設計問題。如組合化學方法應用到蛋白質（一）蛋白質分子設計的層次雙特異性抗體的表達取PCR產物5μL，1.雙特異性抗體的表達62

我們知道,蛋白質的空間結構受其氨基酸序列控制,而功能又與結構密切相關。

如果能夠找到構造蛋白質結構的方法,我們就能得到具有任意結構和功能的全新蛋白質,這就是蛋白質全新設計問題。第三節全新蛋白質設計我們知道,蛋白質的空間結構受其氨基酸序列控制,63

蛋白質從頭設計概念

從頭設計能夠根據生物分子的活性位點特征產生一系列的結構片段，通過連接這些結構片段可以構成一個全新分子；或者在結合腔內對一個已知的結構骨架進行化合物的衍生化。

從頭設計方法可以生成全新的分子結構。蛋白質從頭設計概念從頭設計能夠根據生物分子的活64全新蛋白質設計包括

一、全新蛋白質設計方法二、蛋白質結構的從頭設計全新蛋白質設計包括

65

全新蛋白質設計過程設計目標序列生成結構預測合成構建模型檢測設計目標序列生成結構預測合成構建模型檢測66（一）全新蛋白質設計程序模擬分析設計實驗一、全新蛋白質設計方法（一）全新蛋白質設計程序模擬分析設計實驗一、全新蛋白67（二）全新蛋白質設計目標的選擇依據設計的目的可以分為：從頭結構設計從頭功能設計（二）全新蛋白質設計目標的選擇依據設計的目的可以分為：68從頭結構設計

中心問題：穩定及獨特的三維結構序列；基本障礙：線性聚合構象熵；解決方法：（1）使相互作用的強度與數目達到最大；（2）共價交叉連接。從頭結構設計

中心問題：穩定及獨特的三維結構69從頭設計方法包含的步驟1、活性位點分析：對結合位點的具體的化學信息進行掃描、分析和歸類。這些信息的三維空間相互關系都必須充分考慮。

2、配體分子構建：采用不同的片段選擇和分子構建方法，產生相應的分子結構。

3、評價：使用特定的評分系統將構建的分子與活性位點的匹配性進行排序，可以選擇其中優良的結果作為合成實驗的對象。也可以將之做新一輪計算的起點進行進一步的優化。從頭設計方法包含的步驟1、活性位點分析：對結合位點的具體的化70二、蛋白質結構的從頭設計（一）蛋白質結構的從頭設計原則1．二級結構的設計原則α螺旋β折疊片轉角2．超二級結構和三級結構的設計原則二、蛋白質結構的從頭設計（一）蛋白質結構的從頭設計原則71(1)蛋白質分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學方法生產;Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)（二）蛋白質結構的從頭設計實例根據基因突變的方式，分為以下三類：非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的aa穩定相關知識及理論計算機預測新Pr可能具有的性質二、蛋白質分子設計的原則AddddH2Otoafinalvolumeof50μL,1996,1998)；把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或TyrVLGGGGSGGGGSGG進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。利用能量優化及動力學方法預測修飾后的蛋白質結構VLVLVL生物合成不需要消耗很多能量或者在結合腔內對一個已知的結構骨架進行化合物的衍生化。α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-(1)蛋白質分子量非常大(10000-1000000)72β折疊片

(HPHPH或PHPHP，5-10aa)β折疊片(HPHPH或PHPHP，5-10aa)73轉角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）

轉角（Pro、Gly中斷α螺旋，Glu中斷β折疊）74蛋白質的幾種超二級結構

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β蛋白質的幾種超二級結構

αα、ββ、β-α-β、β75從頭設計的三股式β折疊

從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白質結構的從頭設計實例結構骨架模板、分級迭代算法從頭設計的三股式β折疊從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β76ββα型異源四聚體的設計歷程結構域替換寡聚化策略

異源專一性的計算機重新設計23個氨基酸自動折疊成的鋅指結構（ββα5）的核磁共振（NMR）結構(Struthersetal.,1996,1998)；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.,2004)；ββαT2異源四聚體衍生物ββαhetT1的X-射線結構(Alietal.,2005).ββα型異源四聚體的設計歷程結構域替換異源專77α/β-筒狀蛋白質的全新設計(Offredi1,etal.2003)(A)β-sheetbarrel(紅色)(B)四周環繞α-helixbarrel(藍色)(C)二者由簡單結構域αβ1、αβ3和βABα（灰色）連接(D)全新α/β-筒狀蛋白質。α/β-筒狀蛋白質的全新設計(Offredi1,etal7874aaDegrado設計四螺旋束74aaDegrado設計四螺旋束79四螺旋束四螺旋束80舉例Hodges設計（周期性重復七肽）23

coiled-coil疏水性aa舉例疏水性aa81coiled-coil

from:coiled-coil

from:82二級模塊單元的自組裝最簡單、最直接的策略—合成單一二級結構單元優點無論是從設計或合成看，是簡單的；容易合成。缺點涉及蛋白質的穩定性；結構的簡單重復。二級模塊單元的自組裝最簡單、最直接的策略—合成單一二級結構單83測定新蛋白質的序列、三維結構、穩定性、催化活性等，VH結果分析與原先的結構比較3-12aa2．找出對所要求的性質有重要影響的位置ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.AddddH2Otoafinalvolumeof50μL蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。一、全新蛋白質設計方法（一）定位突變的設計目標及解決方法插入一個或多個氨基酸殘基；對于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。從生態角度，蛋白質也是非常理想的物質:進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr（二）蛋白質分子設計的分類ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.2、三級結構的確定性較差10×TaqPCRBuffer5μL或者在結合腔內對一個已知的結構骨架進行化合物的衍生化。制備感受態細胞T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。蛋白質全新設計的現狀和前景

現狀

蛋白質全新設計不僅使我們有可能得到自然界不存在的具有全新結構和功能的蛋白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和研究蛋白質質折疊規律的重要手段。由于我們對蛋白質全新設計的理論基礎即蛋白質折疊規律的認識還不夠,所以蛋白質全新設計還處在探索階段。測定新蛋白質的序列、三維結構、穩定性、催化活性等，蛋白質全新84前景

隨著新實驗技術的發展,蛋白質全新設計的速度和效率必將得到極大的提高。如組合化學方法應用到蛋白質全新設計中必然能夠大大地縮短設計的周期,并將徹底改變蛋白質全新設計的面貌。前景隨著新實驗技術的發展,蛋白質全85昆醫分生蛋白質分子建模與設計昆醫分生蛋白質分子建模與設計86（優選）昆醫分生蛋白質分子建模與設計（優選）昆醫分生蛋白質分子建模與設計87ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsProteinFoldingoccursinthec88UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunctionUnrelatedproteinsassumesimi引言在人體的進化過程中蛋白質執行了在人體及體外的許多重要任務：酶是催化化學反應的蛋白質或者核酸分子；抗體起到防護的作用;……從生態角度，蛋白質也是非常理想的物質:生物合成不需要消耗很多能量專一性很強不產生副作用并且能很快降解引言在人體的進化過程中蛋白質執行了在人體及體外的許多重要任務90蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:(1)蛋白質分子量非常大(10000-1000000)，不能通過化學方法生產;(2)蛋白質的功能是在生理條件下揮發的，在其它條件下(如在有機溶劑中)是不穩定的;(3)專一性致使其應用范圍受到影響。

蛋白質應用受限的原因蛋白質沒有像化學試劑那樣被普遍應用，其原因:蛋白質應用受限的91蛋白質設計目前存在的問題1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性2、三級結構的確定性較差蛋白質設計目前存在的問題92RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和無論是從設計或合成看，是簡單的；1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性異源專一性的計算機重新設計或者在結合腔內對一個已知的結構骨架進行化合物的衍生化。刪除一個或多個氨基酸殘基；改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。二、蛋白質結構的從頭設計抗DON單鏈抗體改體研究1．建立所研究蛋白質的結構模型Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。二、蛋白質結構的從頭設計依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較；10×TaqPCRBuffer5μL2．突變方法鑒定突變功能殘基計算機模擬突變蛋白質產品功能分析基因構建Pr設計循環第一節蛋白質分子設計原理RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例計算機模93蛋白質分子設計的流程天然蛋白質蛋白質結構預測蛋白質晶體學蛋白質三維結構結構與功能的關系蛋白質突變體設計及結構預測幾何優化及蛋白質動力學研究結果分析與原先的結構比較蛋白質合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質數據的輸入蛋白質分子設計的流程天然蛋白質蛋白質結構預測蛋白質晶體學蛋白94Pr突變體設計的3個步驟利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的aa利用能量優化及動力學方法預測修飾后的蛋白質結構預測的結構與原始的Pr結構比較，利用Pr結構-功能或結構穩定相關知識及理論計算機預測新Pr可能具有的性質Pr突變體設計的3個步驟利用計算機模擬技術確定突變位點及替換95英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分子上作了實驗(人源化抗體)VL(3)專一性致使其應用范圍受到影響。occursinthecytosol72℃40s，25個循環；制備感受態細胞無論是從設計或合成看，是簡單的；ββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。同時利用能量優化及蛋白質動力學方法預測修飾后的蛋白質結構，以修正所選擇的氨基酸位點和突變后的氨基酸種類。把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。differentlength二是在三維結構未知的情況下，借助一級結構序列信息及生物化學性質進行分子設計工作。（一）定位突變的設計目標及解決方法二、蛋白質結構的從頭設計從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.occursinthecytosol蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。從頭設計的20個氨基酸殘基的三股式β折疊（KortemmeT,etal.在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結合

英國劍橋大學的Winter等人利用分子剪裁技術成功地在抗體分96在上述的設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及表征后得到所要求的新Pr；Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結合

昆醫分生蛋白質分子建模與設計新版課件97

蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白質內核中殘基的相互作用決定。（內部十分保守的區域）Pr內部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結合一個水分子或惰性氣體），沒有重疊蛋白質分子設計原理內核假設。蛋白質的獨特的折疊形式是由蛋白98所有內部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側鏈）。蛋白質的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質鍵所取代疏水及親水基團需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應的主要驅動力

蛋白質分子設計原理所有內部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側鏈）。蛋白質的氫鍵形成99金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數目的蛋白質側鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。對于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質主鏈的相互作用。

蛋白質分子設計原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心100最優的aa側鏈幾何排列。Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)結構及功能的專一性。這是Pr設計最困難的問題

蛋白質分子設計原理蛋白質分子設計原理101一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：

一是為有目的的蛋白質工程改造提供設計方案和指導性信息，如以此提高蛋白質的熱、酸穩定性，增加活性，降低副作用，提高專一性等；

一、蛋白質分子設計的分類設計的目的主要有兩個：102二是探索蛋白質的折疊機理，如簡單蛋白質骨架的從頭設計是研究蛋白質內相互作用力的類型及本質的很好途徑，也為解決蛋白質折疊問題尋找定性和定量的規律。

二是探索蛋白質的折疊機理，如簡單蛋白質骨架的從頭設計是研究蛋103（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：一是在蛋白質三維結構已知基礎上的分子設計；二是在三維結構未知的情況下，借助一級結構序列信息及生物化學性質進行分子設計工作。（一）蛋白質分子設計的層次分為兩個層次：104（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法2．拼接組裝設計法3．從頭設計全新蛋白質（二）蛋白質分子設計的分類1．定點突變或化學修飾法105二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計2．對專一性的設計3．Scaffold設計(框架)4．疏水基團與親水基團需合理分布5．最優的氨基酸側鏈幾何排列二、蛋白質分子設計的原則1．活性設計106白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和（四）蛋白質中功能殘基的鑒定基于天然蛋白質結構的分子設計有兩類：利用蛋白質結構-功能或結構-穩定性相關知識及理論計算預測新蛋白質可能具有的性質；我們知道,蛋白質的空間結構受其氨基酸序列控制,而功能又與結構密切相關。0％的瓊脂糖電泳檢測。VH如組合化學方法應用到蛋白質生物合成不需要消耗很多能量Pr側鏈構象由空間兩個立體因素所決定(一是立體勢壘，二是aa的位置)如果能夠找到構造蛋白質結構的方法,我們就能得到具有任意結構和功能的全新蛋白質,這就是蛋白質全新設計問題。依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。(A)β-sheetbarrel(紅色)（二）全新蛋白質設計目標的選擇非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。involveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.VH結構骨架模板、分級迭代算法插入一個或多個氨基酸殘基；異源專一性的計算機重新設計溶菌酶結構例如:雞卵清蛋白溶菌酶活性分子的設計過程中，其中EFAEEAASF多肽能水解幾丁質和葡聚糖，但糖苷酶活性較低。

Cutte成功設計了一個具有明顯的核酸酶活性的34肽，該肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚體；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和溶菌酶結構例如:雞卵清107設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢測結構信息分析建立結構模型設計目標蛋白質數據庫設計步驟蛋白質分子設計步驟圖修正設計獲得目標蛋白質序列合成檢108序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋的殘基；設計全β結構時，應選擇Val、Ile等易于形成β折疊片的殘基；而在設計轉角時常選擇Pro-Asn殘基對。序列設計設計α螺旋時，應選擇象Leu、Glu等易于形成α螺旋109第二節基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子設計有兩類：一是進行蛋白質修飾或基因定位突變，即“小改”；二是進行蛋白質分子裁剪拼接，即“中改”。

第二節基于天然蛋白質結構的分子設計基于天然蛋白質結構的分子110一、定位突變

基于天然蛋白質結構的蛋白質分子“小改”是指對已知結構的蛋白質進行少數幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質修飾和基因定位突變兩類。一、定位突變111（一）定位突變的設計目標及解決方法

定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。（一）定位突變的設計目標及解決方法定位突變常見的112Hartley等于1986年完成了一個我們所要的設計目標及解決的辦法：熱穩定性對氧化的穩定性對重金屬的穩定性pH穩定性提高酶學性質引入二硫橋，增加內氫鍵數目，改善內疏水堆積把Cys轉換為Ala或Ser，把Trp轉換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團，His、Cys以及Tyr的置換專一性的改變，增加逆轉數，改變酸堿度Hartley等于1986年完成了一個我們所要的設計目標及解113（二）定位突變的種類

要進行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學合成、基因直接修飾法、盒式突變技術等。根據基因突變的方式，分為以下三類：插入一個或多個氨基酸殘基；刪除一個或多個氨基酸殘基；替換或取代一個或多個氨基酸殘基。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。（二）定位突變的種類要進行基因定位突114（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型

可以通過X射線晶體學、二維核磁共振等測定結構，也可以根據類似物的結構或其他結構預測方法建立起結構模型。（三）定位突變的程序1．建立所研究蛋白質的結構模型1152．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當地選擇突變殘基是一個關鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質，同時還需要借助于已有的三維結構或分子模型。2．找出對所要求的性質有重要影響的位置在改造中如何恰當地選擇1163．預測突變體的結構

根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較；利用蛋白質結構-功能或結構-穩定性相關知識及理論計算預測新蛋白質可能具有的性質；同時利用能量優化及蛋白質動力學方法預測修飾后的蛋白質結構，以修正所選擇的氨基酸位點和突變后的氨基酸種類。3．預測突變體的結構根據所選定的氨基1174．構建突變體，獲得突變體蛋白

依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。4．構建突變體，獲得突變體蛋白1182、三級結構的確定性較差<3aa本實驗將能夠各自產生抗DON毒素和抗ZEN毒素的單鏈抗體基因，連接融合，表達出能同時與DON和ZEN兩種毒素抗原特異性結合的雙特異性單鏈抗體。研究蛋白質質折疊規律的重要手段。蛋白質全新設計不僅使我們有可能得到定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構-功能關系的研究等。二、蛋白質分子設計的原則蛋白質全新設計不僅使我們有可能得到能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。要達到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術或PCR方法。2、三級結構的確定性較差（一）全新蛋白質設計程序1、與天然的蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性進行基因測序驗證突變體后，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。DON和ZEN抗體基因的提取目的基因片段引物的設計74aaββα5同源四聚體衍生物ββαT2的X-射線結構（Alietal.12345678VLT1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。白質,并且已經成為檢驗蛋白質折疊理論和T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。5．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的序列、三維結構、穩定性、催化活性等，并與對應的天然蛋白質進行比較，檢驗突變設計的效果，同時進一步修正設計方案。2、三級結構的確定性較差5．突變體蛋白質的檢驗測定新蛋白質的119蛋白質中功能殘基的鑒定根據結構信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質同源性鑒定功能殘基（四）蛋白質中功能殘基的鑒定蛋白質中功能根據結構信息利用蛋白質同源性（四）蛋白質中功能殘1201．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等測定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的絲氨酸所取代后的結構，發現Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3’羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。1．根據結構信息確定殘基的突變最有效最直接的方法1212．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進另外一種突變來檢測隨機突變技術刪除分析及連接片段掃描突變2．突變方法鑒定突變功能殘基通過引進另外一種突變來檢測1223．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結構有關。非保守殘基是分析的靶位點，特別是對于專一性研究。探測突變蛋白質的結構整體性質，以鑒定突變殘基。3．利用蛋白質同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白123（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的一個成功實例T1核糖核酸酶含有104個氨基酸殘基，這個天然酶有兩對二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大學的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三個二硫鍵，熱穩定性增加。（五）定位突變的應用RNaseT1的結構改造是分于設計中的124二、蛋白質分子拼接例如，有一種和癌癥的發病有關的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七個大小和形狀都非常相似的結構域拼接構成的，各結構域之間由柔韌性較大的“鉸鏈”片段相連。研究發現，癌胚抗原的這種多結構域特征有利于它的細胞識別和粘合作用。二、蛋白質分子拼接125而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。2、三級結構的確定性較差要求圍繞金屬中心放置合適數目的蛋白質側鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。M12根據所選定的氨基酸殘基位點及突變后的氨基酸種類，利用相關軟件進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較；而天然核酸酶僅消化polyC、polyU、polyA，特別傾向于水解polyC的3’端。Anti-DONgene改體抗體在大腸桿菌BL21中的表達及其純化質折疊規律的認識還不夠,所以蛋白質全新二、蛋白質結構的從頭設計differentlength插入一個或多個氨基酸殘基；（二）蛋白質結構的從頭設計實例能識別兩種抗原并能與之結合的單鏈抗體（或抗體復合物）稱為雙特異性單鏈抗體。Anti-DONgene如組合化學方法應用到蛋白質Pr設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密相結合金屬Pr中配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。VH和VL的PCR擴增結果ββα