任務5高效液相色譜法

分離原理液相色譜分析法模塊之任務5高效液相色譜法

分離原理液相色譜分析法模塊之1理解已知分析方法中采用的色譜類型能夠正確解釋色譜分離過程能夠根據組分性質選擇合適的色譜類型能力目標理解已知分析方法中采用的色譜類型能力目標2課程引入歸一化法測定分析純甲苯試劑的純度色譜柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動相:水:甲醇=15:85外標法測定葉酸片中葉酸的含量色譜柱:4.6mm×250mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動相:磷酸二氫鈉緩沖液:甲醇=80:20課程引入歸一化法測定分析純甲苯試劑的純度3

液相色譜是如何完成混合物的分離？

課程引入混合物中各組分在固定相和流動相之間會發生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱液相色譜是如何完成混合物的分離？4液液分配色譜法實例：歸一化法測定分析純甲苯試劑的純度色譜柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動相:水:甲醇=15:85液液分配色譜液液分配色譜法液液分配色譜5液液分配色譜法固定相將特定的液態物質涂于擔體表面化學鍵合于擔體表面而形成的有機鍵合層如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠固定相類型極性固定相：正相色譜以極性有機基團如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。液液分配色譜液液分配色譜法液液分配色譜6使用條件為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8）。太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。鍵合相色譜—固定相特點使用過程中不流失均一性和化學穩定性好重現性好分離效率高適于梯度洗脫傳質阻抗小使用條件鍵合相色譜—固定相特點7反相色譜常見流動相流動相洗脫強度順序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷（與水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動相，可用于分離極性化合物若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等常見固定相反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。鍵合相色譜—流動相反相色譜鍵合相色譜—流動相8疏溶劑理論：當溶質分子進入極性流動相后,即占據流動相中相應的空間，而排擠一部分溶劑分子；當溶質分子被流動相推動和固定相接觸時，溶質分子的非極性部分或非極性分子）會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，直接和非極性固定相上的烷基官能團相結合（吸附）形成締合物，構成單分子吸附層；當流動相極性減小時，這種疏溶劑斥力下降，會發生解締，并把溶質分子釋放而被洗脫下來反相色譜法的分離機理1疏溶劑理論：反相色譜法的分離機理19影響溶質保留的三個主要因素：溶質分子中非極性部分的總表面積溶質和固定相接觸的總表面積愈大，保留值愈大，所以溶質的極性愈弱，疏水性越強，保留值越大。鍵合相上的烷基總面積烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性的作用表面。隨著碳鏈的加長，烷基的疏水特性增強，溶質的保留值也隨烷基碳鏈長度的增加而增大。流動相的表面張力流動相的表面張力愈大，介電常數愈大，極性亦愈強；溶質和烷基鍵合相的締合作用愈強，流動相的洗脫強度弱，導致溶質的保留值大。反相鍵合相色譜法的分離機理2影響溶質保留的三個主要因素：反相鍵合相色譜法的分離機理210時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯例：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。分離機理實例時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶11正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環已烷

3.極性調節劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相

水或緩沖液3.極性調節劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出液液分配色譜正相色譜法反相色譜法1.極性固定相1.非12其他類型色譜法按分離機制分類：液固吸附色譜法離子色譜法凝膠色譜法（分子排阻色譜法）

（空間排阻色譜法）其他類型色譜法其他類型色譜法其他類型色譜法13

氯化噻吩嗪四種異構體的分離色譜圖氯化噻吩嗪四種異構體的分離異構體具有不同的空間排列方式，因此吸附劑對它們的吸附能力有所不同，從而得到了分離。液固吸附色譜實例氯化噻吩嗪氯化噻吩嗪四種異構體14液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動相：有機溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構體。液固吸附色譜各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸液固吸附色譜法液固吸附色譜各組分的出峰順序15吸附脫附再吸附再脫附…分離過程是一個吸附－脫附的平衡過程。液固吸附色譜法分離機理液固吸附色譜分離機理吸附液固吸附色譜法分離機理液固吸附色譜分離機理16離子交換色譜法油田水質中的陰離子分析固定相：薄殼型陰離子交換樹脂(3×250mm)流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3離子色譜法實例離子交換色譜法離子色譜法實例17離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基陽離子交換樹脂在表面未端芳環上接上季胺基陰離子交換樹脂流動相：電解質溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－離子交換色譜法離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－18離子交換色譜法分離原理樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。應用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。分析物質有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

離子交換色譜法分離機理離子交換色譜法離子交換色譜法分離機理19凝膠色譜（分子排阻色譜法）油田用驅油劑聚丙烯酰胺損失量的測定？色譜柱：150mm×46mm固定相：二醇基鍵合相，孔徑200A，粒徑5um流動相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4凝膠色譜法實例1-聚丙烯酰胺2-原油+石油磺酸鹽+氯化鈉凝膠色譜（分子排阻色譜法）凝膠色譜法實例1-聚丙烯酰胺20以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。凝膠色譜分離示意圖

凝膠色譜：（分子排阻色譜法）分離機理凝膠色譜分離機理以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比21正確地選擇色譜類型盡可能多的了解樣品性質化學結構極性和穩定程度水中和有機溶劑中溶解度相對分子質量的大小熟悉各種色譜類型主要特點應用范圍色譜類型選擇正確地選擇色譜類型色譜類型選擇22色譜類型選擇色譜類型選擇23液相色譜法實例按固定相與流動相相對極性的不同，液液分配色譜可分為哪兩類方法？現在有A、B兩物質，極性A＞B，問在兩種液液分配色譜上的出峰順序如何？分離下述化合物，宜選用何種色譜方法？（A）聚苯乙烯相對分子量分布（B）多環芳烴（C）氨基酸（D）Ca2+，Ba2+，Mg2+液相色譜法實例按固定相與流動相相對極性的不同，液液分配色譜可24下次課程問題三種組分苯、萘、聯苯，如何選擇一個最佳的色譜分離條件，既能達到良好的分離度，又能在短時間內完成分析任務？下次課程問題三種組分苯、萘、聯苯，如何選擇一個最佳的色譜分離25任務5高效液相色譜法

分離原理液相色譜分析法模塊之任務5高效液相色譜法

分離原理液相色譜分析法模塊之26理解已知分析方法中采用的色譜類型能夠正確解釋色譜分離過程能夠根據組分性質選擇合適的色譜類型能力目標理解已知分析方法中采用的色譜類型能力目標27課程引入歸一化法測定分析純甲苯試劑的純度色譜柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動相:水:甲醇=15:85外標法測定葉酸片中葉酸的含量色譜柱:4.6mm×250mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動相:磷酸二氫鈉緩沖液:甲醇=80:20課程引入歸一化法測定分析純甲苯試劑的純度28

液相色譜是如何完成混合物的分離？

課程引入混合物中各組分在固定相和流動相之間會發生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱液相色譜是如何完成混合物的分離？29液液分配色譜法實例：歸一化法測定分析純甲苯試劑的純度色譜柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動相:水:甲醇=15:85液液分配色譜液液分配色譜法液液分配色譜30液液分配色譜法固定相將特定的液態物質涂于擔體表面化學鍵合于擔體表面而形成的有機鍵合層如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠固定相類型極性固定相：正相色譜以極性有機基團如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。液液分配色譜液液分配色譜法液液分配色譜31使用條件為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8）。太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。鍵合相色譜—固定相特點使用過程中不流失均一性和化學穩定性好重現性好分離效率高適于梯度洗脫傳質阻抗小使用條件鍵合相色譜—固定相特點32反相色譜常見流動相流動相洗脫強度順序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷（與水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動相，可用于分離極性化合物若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等常見固定相反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。鍵合相色譜—流動相反相色譜鍵合相色譜—流動相33疏溶劑理論：當溶質分子進入極性流動相后,即占據流動相中相應的空間，而排擠一部分溶劑分子；當溶質分子被流動相推動和固定相接觸時，溶質分子的非極性部分或非極性分子）會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，直接和非極性固定相上的烷基官能團相結合（吸附）形成締合物，構成單分子吸附層；當流動相極性減小時，這種疏溶劑斥力下降，會發生解締，并把溶質分子釋放而被洗脫下來反相色譜法的分離機理1疏溶劑理論：反相色譜法的分離機理134影響溶質保留的三個主要因素：溶質分子中非極性部分的總表面積溶質和固定相接觸的總表面積愈大，保留值愈大，所以溶質的極性愈弱，疏水性越強，保留值越大。鍵合相上的烷基總面積烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性的作用表面。隨著碳鏈的加長，烷基的疏水特性增強，溶質的保留值也隨烷基碳鏈長度的增加而增大。流動相的表面張力流動相的表面張力愈大，介電常數愈大，極性亦愈強；溶質和烷基鍵合相的締合作用愈強，流動相的洗脫強度弱，導致溶質的保留值大。反相鍵合相色譜法的分離機理2影響溶質保留的三個主要因素：反相鍵合相色譜法的分離機理235時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯例：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。分離機理實例時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶36正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環已烷

3.極性調節劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相

水或緩沖液3.極性調節劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出液液分配色譜正相色譜法反相色譜法1.極性固定相1.非37其他類型色譜法按分離機制分類：液固吸附色譜法離子色譜法凝膠色譜法（分子排阻色譜法）

（空間排阻色譜法）其他類型色譜法其他類型色譜法其他類型色譜法38

氯化噻吩嗪四種異構體的分離色譜圖氯化噻吩嗪四種異構體的分離異構體具有不同的空間排列方式，因此吸附劑對它們的吸附能力有所不同，從而得到了分離。液固吸附色譜實例氯化噻吩嗪氯化噻吩嗪四種異構體39液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動相：有機溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構體。液固吸附色譜各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸液固吸附色譜法液固吸附色譜各組分的出峰順序40吸附脫附再吸附再脫附…分離過程是一個吸附－脫附的平衡過程。液固吸附色譜法分離機理液固吸附色譜分離機理吸附液固吸附色譜法分離機理液固吸附色譜分離機理41離子交換色譜法油田水質中的陰離子分析固定相：薄殼型陰離子交換樹脂(3×250mm)流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3離子色譜法實例離子交換色譜法離子色譜法實例42離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基陽離子交換樹脂在表面未端芳環上接上季胺基陰離子交換樹脂流動相：電解質溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－離子交換色譜法離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－43離子交換色譜法分離原理樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。應用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能