第五章

常用生物化學檢驗技術

第一節光譜分析技術第二節電化學分析第三節電泳技術第四節層析技術第五節自動生化分析技術

光譜分析技術是根據物質吸收或發射輻射能而建立起來的一類分析方法，因不同分子的原子和原子團，其發射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質在一定條件下，其發射光譜和吸收光譜的強度與該物質的含量成正比關系。因此可對物質進行定性和定量分析，此類技術稱為光譜分析技術。光譜分析技術是一種最常用的生化檢驗技術，它主要包括：

吸收光譜分析：可見、紫外、紅外分光光度法和原子吸收分光光度法

散射光譜分析：散射比濁法和透射比濁法

發射光譜分析：火焰光度法、原子發射光譜法和熒光光譜法

光是一種高速傳播的電磁波，光的波長（λ）的常用單位是納米（nm），可見光波長400～760nm，＜400nm稱為紫外光，＞760nm稱為紅外光，波長愈短，能量愈大。可見、紫外吸收光譜是由于多原子分子的價電子在電磁輻射的作用下，由基態躍遷到激發態，這種因物質分子對輻射能的選擇性吸收而得到的光譜稱為吸收光譜。第一節吸收光譜分析吸收光譜分析法包括可見、紫外、紅外和原子吸收分析法。其中最常用的是可見光分析法，也被不嚴格地稱為比色分析法，準確的名稱應是可見光分光光度法。

用于比色分析的光源與被測溶液的顏色應為互補色。可見、紫外吸收光譜用于定量分析的依據是光吸收定律，即Lambert-Beer定律，它是吸收光譜法的基本定律。

一、Lambert-Beer定律

1.Lambert定律當一束強度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，則透過的光線為It。當溶液濃度不變時，透過的液層愈厚，則光線強度的減弱愈顯著。ItI0用數學式表示為：

透光度隨溶液厚度增加而減少，其關系是透光度的負對數（－lgT，吸光度A）與溶液厚度成正比，即

2.Beer定律當一束強度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，若液層厚度不變，而濃度不同時，溶液的濃度愈大，則透過光的強度愈弱，其定量關系A=K·C。

當液層厚度不變時，吸光度與溶液濃度成正比，這就是Beer定律。

3.Lambert-Beer定律合并Lambert定律與Beer定律可得

A=K·L·C

說明吸光物質對單色光吸收的強度與物質的濃度和液層厚度成正比。

吸光系數K的物理意義是吸光物質在單位濃度及單位厚度時的吸光度，在給定條件下（波長、溶液性質、濃度）吸光系數是物質的特征常數，K值愈大，能測定的濃度C愈小，則靈敏度愈高。二、比色分分析儀器即可見光分分光光度計計，各類分分光光度計計的結構和和原理基本本相同，一一般包括光光源、單色色器、吸收收池、檢測測器和顯色色器五大部部分。1.光源可見光常用用鎢燈，現現用鹵鎢燈燈；紫外光光常用氫燈燈。2.單色器可用濾光片片、棱鏡、、光柵。3.吸收池(比色杯)4.檢測器光電管或光光電倍增管管5.顯示器指針式或數數字式三、比色分分析的特點點1.靈敏度高被測定物質質的最低濃濃度一般為為10－5～10－6mol/L。2.測定快速、、簡便。3.應用范圍廣廣一些無色物物質在一定定條件下與與顯色劑反反應，可生生成有色物物質。四、比色分分析的定量量方法（一）對比比法又稱標準對對比法，通通常在測定定未知濃度度樣品的同同時，測定定一已知濃濃度的標準準液作比較較，然后分分別測定兩兩者的吸光光度。AS=KLSCSAR=KLRCR因測定成分分相同，故故K值相同，比比色時用同同樣規格的的比色皿故故LS=LR，所以比色色分析中測測定標準液液與未知液液吸光度的的比值也就就等于其濃濃度的比值值，即若標準液與與樣品用量量不等時，，則再乘。。用對比法進進行定量時時，為了減減少誤差，，選用標準準液濃度應應盡可能接接近待測樣樣品濃度。。（二）標準準曲線法配制一系列列濃度不同同的標準液液，按一定定操作方法法顯色后，，用選定的的波長分別別測定它們們的吸光度度，然后以以吸光度為為縱坐標，，標準液濃濃度為橫坐坐標，在坐坐標紙上標標出各坐標標點，通過過連接各點點，使其成成一直線，，即A-C曲線?！ぁぁぁぁ0.60.50.40.30.20.124681012C注意事項1.測定條件發發生變化時時（如更換換標準品和和試劑等）），應重新新繪制。2.標準品應有有高的純度度，標準液液的配制應應準確。3.當待測液吸吸光度超過過線性范圍圍時，應將將標本稀釋釋后再測定定。4.標本測定的的條件應和和標準曲線線制作時的的條件完全全一致。用波長200～400nm的紫外光譜譜測定無色色物質的方方法稱為紫紫外分光光光度法。芳香族類類及含有共共軛雙鍵的的烯烴、炔炔烴等不飽飽和烴類，，在200～400nm波長范圍具具備光吸收收特性，故故不需經顯顯色反應就就能直接利利用紫外分分光光度法法測定，其其選擇性和和靈敏度均均高于比色色分析法。。五、紫外分分光光度法法（一）單組組分測定原原理其基本原理理與可見分分光光度法法相同，除除可采用前前述的標準準曲線法和和對比法外外，還可采采用：1.吸光系數法法對于單一組分的的純物質，只要已知知其摩爾吸吸光系數，，測得吸光光度（A）后，可直直接按下列列公式計算算物質的濃濃度。例：已知維生素素B12的水溶液在在361nm波長處的ε為28056，2ml維生素B12的水溶液用用蒸餾水稀稀釋到4ml，用1cm比色杯測得得溶液的吸吸光度為0.414，求該維生生素B12水溶液的濃濃度。（二）多組組分混合物物的測定原原理多組分指同同一試樣中中含兩種或或兩種以上上待測組分分，測定時時可根據各各組分吸收收光譜的重重疊程度來來確定定量量方法。1.各組分吸收收峰不相互互重疊按單組分測測定方法2.各組組分分吸吸收收峰峰相相互互重重疊疊可采采用用解解聯聯立立方方程程法法，，等等收收吸吸雙雙波波長長法法、、系系數數光光譜譜法法。。（一一））火火焰焰光光度度法法是利利用用火火焰焰使使金金屬屬元元素素激激發發，，能能發發射射出出特特征征譜譜線線的的特特點點進進行行測測定定的的一一種種方方法法。。1.基本原理理某些金屬屬元素的的基態原原子受到到火焰激激發后，，其外層層電子獲獲得能量量而從基基點躍遷遷到激發發態，接接著它們們又以發發射光譜譜的形式式釋放出出所獲得得的能量量，而返返回基態態，在相相同條件件下，同同一元素素所釋放放的單位位能量相相同，故故能形成成固定光光譜。六、其它它光譜分分析技術術如鈉發射光譜譜波長589nm，鉀發射光譜譜波長767nm。由于火焰焰供給的的能量不不強，只能激發發堿金屬和堿土金屬屬元素，生化檢檢驗中常常用于鉀鉀、鈉的的測定。。元素的發發射譜線線強度與與該元素素濃度的的關系可可表示為為I=a··c·ba是與試樣樣組成，，激發溫溫度，激激發電位位有關的的常數，b為自吸收系系數，當濃度度很低時時，b≈1，所以上上式可寫寫成I=a··c，即發射射譜線強強度與測測定元素素濃度成成正比。。2.干擾因素素（1）共存元元素的干干擾①共存元元素產生生的輻射射干擾由于火焰焰使標本本中其他他元素激激發，當當發射時時光譜接接近，甚甚至重疊疊時，可可產生干干擾，引引起誤差差，如鈣鈣對鋰、、鈉的測測定干擾擾明顯。。②陽離子子的干擾擾主要是通通過對待待測陽離離子的電電離度產產生影響響，造成成發射時時強度的的改變。。③陰離子子的干擾擾因陰離子子可與某某些被測測陽離子子在火焰焰溫度下下形成僅僅能緩慢慢蒸發的的化合物物而抑制制了原子子激發，，一般用用釋放劑劑來消除除干擾，，與干擾擾陰離子子牢固結結合。（2）火焰對對測定的的影響火焰是激激發光源源，火焰焰的純度度和燃燒燒狀態，，穩定性性，可直直接影響響分析結結果的準準確度，，因此，，要求所所用燃料料燃燒時時火焰背背景色淺淺，溫度度高，無無雜色。。（3）標準品的的影響由于生物物樣品中中成分復復雜，定定量測定定中會互互相干擾擾影響測測定的準準確性，，所以，，如果以以單純的的被測物物質預制制標準液液則與血血清樣品品的結果果相差甚甚遠，故故應使用用血清作作為標準準以消除除影響。。（二）原原子吸收收分光光光度法1.基本原理理待測元素素經原子子蒸氣發發生器轉轉化成氣氣態原子子（處于于基態）），由空空心陰極極燈提供供的待測測元素的的共振線線經過待待測元素素的蒸氣氣，共振振輻射強強度被蒸蒸氣中待待測元素素的基態態原子吸吸收而減減弱，其其吸收規規律遵循循Beer定律。共振線：：電子從基基態躍遷遷至第一一電子激激發態的的最低振振動能級級所吸收收的譜線線為共振振吸收線線。簡稱為為共振線線。2.應用在醫學檢驗驗中主要用用于體液、、毛發、指指甲等組織織鈣、鎂、、鐵、鈉、、鋅、鋁、、汞、鉛、、砷等多種種元素的測測定。優點：①選擇性好好受干擾少，，原子吸收收是光的窄窄帶吸收，，僅0.001～0.01nm，而分子對對光的吸收收是寬帶吸吸收，達幾幾個nm。②靈敏度高高能測定10－9～10－6g的元素。③測定快速速、簡便④應用范圍圍廣只需更換不不同空心陰陰極燈，儀儀器昂貴。。（三）熒光光分析法利用某些物物質光致發發光的特性性，籍此對對物質進行行定性，定定量分析的的方法。1.基本原理某些物質的的分子吸收收了光能，，從基態躍躍遷至某一一電子激發發態中的某某一振動能能級，處于于激發態的的振動能級級中的分子子通過運動動或與其他他分子的碰碰撞而將吸吸收過多的的能量輸給給其他分子子，并返回回到第一激激發態的最最低振動能能級，同時時發射熒光光，躍遷到到基態發射射熒光，在在一定濃度度范圍內，，其熒光強強度與溶液液濃度呈線線性關系。。2.影響熒光強強度的因素素（1）溶劑增大溶劑的的極性，可可時電子躍躍遷的能量量降低，熒熒光增強。。（2）溫度、pHT↑分子碰撞頻頻率↑，因因此熒光強強度隨溫度度升高而減減弱。pH可影響化合合物電離或或使熒光物物質水解，，如苯胺在在pH7～12溶液中主要要以分子形形式存在，，產生藍色色熒光，而而在pH<7或>13的溶液中以以離子形式式存在，不不能產生熒熒光。（3）激發光和和發射光在定量測定定時，一般般應選擇熒熒光物質的的最大激發波波長（λex）和最大熒光波波長（λem），但有些熒熒光物質化化學性質不不穩定，受受激發光照照射后易分分解，縮短短樣品照射射時間，改改變激發光光波長。（4）物質濃度度的影響熒光分析品品適合稀溶溶液，因熒光物質濃濃度高，分分子間碰撞撞增加，使使熒光強度度減弱，這這種現象稱稱為自熄滅滅，自熄滅現現象隨濃度度增加而增增強。3.儀器與測定定方法作為熒光分分析的儀器器有光電熒熒光計和熒熒光分光光光度計光電熒光計計的結構與與光電比色色計很相似似，不同之之處是檢測測器與光線線成直角，，并多一塊塊濾光片。。如濾光片改改為棱鏡或或光珊作單單色器，就就和可見紫紫外發光光光度計相似似而成熒光光分光光度度計。儀器的組成成部件的比比光源單單色色器測測定池光光敏元件件檢檢測測器光電比色計計鎢鎢燈濾濾光片玻玻璃光光電池池檢檢流計(二面面透透光光)光電電管管光電電熒熒光光計計鹵鹵鎢鎢燈燈濾濾光光片片玻玻璃璃光光電電管管檢檢流流計計(300～700nm)兩塊塊(四面面透透光光)檢流流計計可見見紫紫外外鎢鎢燈燈光光柵柵或或棱棱鏡鏡分光光光光度度計計(400～760nm)玻璃璃光光電電管管檢檢流流計計氫燈燈石石英英光光電電倍倍增增管管自自動動記記錄錄(200～400nm)熒光光分分光光氙氙弧弧燈燈光光柵柵或或棱棱鏡鏡玻玻璃璃光光電電倍倍增增管管自自動動記記錄錄光度度計計(200～700nm)石英英氙弧弧燈燈發發射射的的強強烈烈紫紫外外線線對對人人眼眼有有害害。。熒光光分分析析優優點點：：①靈靈敏敏度度高高比可可見見紫紫外外吸吸收收光光譜譜高高103～104倍。。②特異異性強強通過選選擇合合適的的激發發光波波長和和熒光光波長長可避避開其其它物物質干干擾。。③操作作簡便便、快快速、、重現現性好好④樣品品用量量少不足之之處：：①應用用范圍圍有一一定局局限性性，因許許多物物質不不能產產生熒熒光。。②對測測定條條件要要求嚴嚴格，如試試劑、、溶劑劑不應應含有有熒光光物質質。③儀器器價格格較貴貴熒光分分析法法在醫醫學檢檢驗中中可用用于測測定類類固醇醇激素素（腎腎上腺腺皮質質激素素）及及代謝謝產物物，單單胺類類神經經遞質質（兒兒茶酚酚胺，，5-HT）某些些維生生素（（VitA，B族）。。電化學學分析析是一一種以以溶液液電化化學性性質為為基礎礎測定定物質質含量量的分分析方方法。。按測定定量的的電化化學參參數的的不同同，可可分為為電位法法、電導法法、庫侖侖法、、極譜譜法和和伏安法法等，下下面主主要介介紹電電位法法中的的離子子選擇擇電極極法。。第二節節電電化學學分析析是一種種電化化學敏敏感器器，它它的電勢與與溶液液中給給定離離子的的濃度度的對對數成成線性性關系系，故可可以通通過簡簡單的的電位位測量量，直直接測測定定溶液液中離離子活活度。。離子濃濃度與與離子子活度度的關關系a=f.c在稀溶溶液中中（10－4mol/L以下））活度度系數數接近近1。離子選選擇電電極（ionselectiveelectodeISE）ISE分析法法的優優點：：1.是一種種直接接的非非破壞壞性分分析方方法，可反反復進進行，，不受受樣品品溶液液顏色色、渾渾濁等等因素素的干干擾。。2.分析速速度快快，單次次分析析通常常只1～2min3.測量范范圍寬寬，4～5個數量量級4.操作簡簡便5.測量特特定離離子活活度，對臨臨床醫醫學和和基礎醫醫學學更更有有實實用用意意義義ISE大都都屬于于膜膜電電極極，膜膜中中含含有有與與待待測測離離子子相相同同的的離離子子。。膜膜的的內內表表面面與與具具有有相相同同離離子子的的固固定定濃濃度度溶溶液液接接觸觸，，其其中中插插入入一一內內參參比比電電極極，，當當膜膜的的外外表表面面與與待待測測離離子子溶溶液液接接觸觸時時，，引引起起膜膜電電位位的的改改變變。。由由于于電電極極膜膜材材料料、、制制備備方方法法不不同同，，使使電電板板的的穩穩定定性性、、選選擇擇性性和和靈靈敏敏度度也也不不同同。。一、ISE分析法的基基本原理一、ISE分析法的基基本原理膜電位的產產生：將電極插入入待測離子子溶液中時時，由于離離子的交換換和擴散作作用，改變變了兩相中中原有的電電荷分布，，因而存在在一定的電電位差，因因為內充溶溶液中有關關離子的濃濃度恒定，，內參比電電極的電位位固定，所所以ISE的電位（E）只隨離子子活度不同同而改變，，其電位可可用Nernst方程式表示示。ISE的E值不能直接接測定，必必須將ISE與參比電極極浸入被測測溶液中組組成原電池池，然后通通過電動勢勢來測定E值。參比電極：：是指在溫度度、壓力恒恒定的條件件下，當被被測溶液離離子濃度有有所改變時時，電極電電位保持不不變的電極極。離子選擇電極晶體膜電極均相膜電極非均相膜電極剛性基質電極流動載體電極非晶體膜電極基本電極氣敏電極敏化電極酶電極二、離子選選擇電極的的分類（一）晶體體膜電極其敏感膜為為金屬微溶溶鹽，經加加壓成片，，制成單晶晶、多晶或或混晶體電電極敏感膜膜，如氟電電極，其敏敏感膜為LaF3單晶片。（二）非晶晶體膜電極極1.剛性基質電電極其敏感膜為玻玻璃，故稱為玻玻璃電極。。成分一般般為Na2O-AI2O3-SiO2改變這三種種成分的配配合比例，，分別制出出對Li+、Na+、K+、Ag+的離子選擇擇電極。2.流動載體電電極其敏敏感感膜膜是是由由溶溶解解在在與與水水不不相相混混溶溶的的有有機機溶溶劑劑中中的的離離子子締締合合劑劑或或混混合合劑劑作作為為離離子子交交換換體體，，再再將將此此溶溶液液滲滲透透在在具具有有惰惰性性，，微微孔孔性性和和疏疏水水性性的的塑塑料料薄薄膜膜內內。。（三））氣敏敏電極極是基于于界面面化學學反應應對氣氣體敏敏感的的電極極，它它是在在一般般的離離子選選擇電電極的的基礎礎上，，再覆覆蓋一一層疏疏水的的透氣氣膜（（如聚聚四氟氟乙烯烯），，如CO2、NH3電極。。（四））酶電電極它由離離子敏敏感膜膜和覆覆蓋在在表面面含有有酶的的酶涂涂層膠膠組成成，敏敏感膜膜對待待測物物的酶酶促反反應有有選擇擇性響響應，，如尿尿素酶酶電極極。1.響應范范圍及及檢測測下限限：響應范范圍是是指電電極對對待測測離子子的響響應符符合Nernst式的線線性區區，此此范圍圍越寬寬越好好，一一般在在4～7個數量量級之之間，，檢測測F限是指指能夠夠檢測測被檢檢離子子的最最低濃濃度一一般在在10-5～10-7mol/L。2.選擇性性是指電電極對對待測測離子子和共共存干干擾離離子的的響應應程度度的差差異。。常用選選擇性性系數數或選選擇比比系描描述，，選擇擇性系系數越越小，，表示示電極極選擇擇性越越強。。三、離離子選選擇電電極的的性能能3.響應斜斜率和和轉換換系數數ISE在Nevnet響應范范圍內內被測測離子子活度度變化化10倍所引引起的的電報報電位位變化化的數數值，，即響響應斜斜率（（S）。從理論論上說說，但對某某一ISE來說，，實際際S值與理理論S值并不不完全全相符符，其其偏差差用轉轉換系系數表表示，，一般般轉換換系數數達到到理論論值90％以上上的電電極性性能較較好。。4.電極壽壽命取決于于電極極制作作材料料，結結構和和使用用保管管情況況。1.標準曲曲線法法配制一一系列列不同同濃度度標準準溶液液，測測定其其電位位值Es，繪制Es-lgc標準曲線線，在相相同條件件下測定定樣品溶溶液電位位值Ex。2.電極校正正法用標準溶溶液校正正ISE，制成直直讀式電電儀表。。四、IES的分析定定量方法法1.電動勢測測量，對于一價離子子的響應，，電勢測測量每差差1mV引起濃度度的相對對誤差為為4％，對于二價離子子則為8％，因此對對于測量量電勢的的儀器精精度要求求達到0.1mV。2.溫度Nernst公試中的的斜率，，內參比比電極的的電信號號，以及及離子活活度等都都與溫度度有關，，因此在在整個測測量過程程中應保保持溫度度恒定。。五、ISE分析方法的的誤差3.pH溶液pH值可影響被被測離子在在溶液中的的存在形式式，從而影影響相應離離子的活度度，如LaF3電極測定F－時，如pH＜5，F－則會生成HF，使結果偏偏低。4.滯后效應使用ISE若先測濃溶溶液后，再再測稀溶液液時電位平平衡緩慢并并出現誤差差，這一現現象稱為““滯后效應應”。一、電泳的的基本原理理（一）電電泳的的概念溶液中帶電電顆粒在直直流電場中中向電荷相相反方向移移動的現象象稱為電泳泳。利用電電泳現象對對物質進行行分離的技技術叫電泳泳技術。第三節電電泳泳技術電泳技術的的應用始于于1937年，瑞典Tiselius利用界面電電泳將血清清蛋白質分分離成五種種成分。1948年Wieland發明紙紙電泳泳，使使電泳泳技術術大為為簡化化。此此后，，電泳泳技術術發展展迅速速，特特別是是電泳泳技術術與層層析法法，免免疫學學方法法的結結合，，使其其分辨辨率達達到mg/ml水平，，成為為醫學學檢驗驗的一一種重重要分分析技技術。。（二））溶溶液中中粒子子的帶帶電狀狀態蛋白質質分子子電離離時有帶正正電荷荷的氨氨基，也有有電離離帶負電電荷的的羧基基，故蛋蛋白質質是一一種兩兩性電電解質質。在酸性性條件件下，，羧基基電離離受抑抑制，，－NH2→-NH3+帶正電電在堿堿性性條條件件下下，，羧羧基基電電離離增增強強，，－－COOH→→－COO－帶負電電。（三三））電電泳泳遷遷移移率率指帶帶電電粒粒子子在在單單位位電電場場強強度度作作用用下下的的電電泳泳速速度度，通通常常用用μ表示示μ=V/EV為粒粒子子移移動動速速度度（（cm/s）E為電電場場強強度度（（V/cm）遷移移率率取取決決于于帶帶電電粒粒子子的的性性質質（（粒粒子子所所帶帶電電量量Q，粒子大小小r形狀）介質質粘度η，對于球狀狀分子，根根據Stoke定律V=QE/6πrηU=Q/6πrη在實際測定定中，電泳泳速度V以單位時間間t（秒）內移移動的距離離d（厘米）表表示V=d/t（cm/s）電場強度E以單位長度度I（厘米）上上所施加的的電勢差V（伏特）表表示E=V/I（V/cm）故u=V/E=（d/t）/（V/I）=d×I/V×t（cm2/v.s）通過測量d,l,v,t便可計算出出顆粒的遷遷移率。由于不同的的帶電粒子子其遷移率率的不同，，因此在同同一電場中中的移動距距離不同，，故能將其其分離，根根據公式dA=V.t/l×μAdB=V.t/l×μBA、B移動距離差差為Δd=(dA——dB)=（dA—dB）×V.t/l分離距離與與電壓和電電泳時間成成正比，與與支持物長長度成正比比。二、電泳泳的分類和和電泳儀（一）電電泳的分類類1.根據被分離離樣品的多多少分析電泳，，制備電泳泳。2.根據電泳電電壓的高低低常壓電泳，，高壓電泳泳。3.根據是否使使用支持介介質自由電泳，，區帶電泳泳。4.根據電泳系系統的組成成是否均一一連續電泳，，不連續電電泳。（二）電泳泳儀由直流電源源和電泳槽槽兩部分組組成。1、直流電源源將交流電源源經整流，，濾波后獲獲得。分為為（1）恒壓電源源電泳過程中中的電壓恒恒定不變。。但電泳過過程中的熱熱效應，降降低外周電電路的電阻阻，使電流流慢慢增大大。（2）恒流電泳泳電泳過程中中的電流恒恒定不變。。用這種電電流的輸出出電壓可隨隨外周阻力力減少而減減少，從而而保持電流流恒定。（3）恒功率電電源電泳中輸出出功率恒定定不變。主主要用于等等電聚焦電電泳。2.電泳槽盛裝緩沖液液和進行電電泳分析的的場所，一一般用塑料料和有機玻玻璃制成，，它包括電電極，緩沖沖液槽，電電泳支架，，透明蓋組組成。電泳泳槽的外形形有水平式式，垂直式式，圓盤式式等多種。。電極應具有有良好的導導電性，抗抗腐蝕性和和抗電解作作用。以鉑鉑金材料最最為理想，，最好貫穿穿整個緩沖沖液槽。三、影響電電泳的因素素（一）緩沖沖液維持電泳介介質pH恒定，并起起導電作用用。1.組成由由弱酸和和弱酸鹽組組成，常用用的有磷酸酸鹽，硼酸酸鹽，巴比比妥鹽和三三羥甲基氨氨基甲烷（（Tris）等，其中中巴比妥緩緩沖液用的的最多，由由巴比妥鈉鈉和巴比妥妥組成。選擇緩沖液液時應考慮慮的因素：：（1）化學性能能穩定，不不易水解。。（2）緩沖液的的pH應與弱酸的的pK值接近，有有較強緩沖沖能力。（3）緩沖液中中正負離子子應有相近近的遷移率率，避免電電暈出現正正負離子分分布不均。。（4）緩沖液的的離子應該該是一價的的，多價離離子有較厚厚的雙電層層，移動性性差。（5）緩沖液的的電導率要要低，避避免通電時時產生較多多的熱。2.pH緩沖液pH決定了蛋白白質的帶電電狀態，電電泳時應選選擇一個合合適pH，使各種蛋蛋白質在這這一pH時凈電荷差差別最大以以利于分離離。血清蛋蛋白醋酸纖纖維薄膜電電暈常用pH8.6的巴比妥緩緩沖液。各各種蛋白質質均帶負電電荷，電泳泳時向正極極移動。緩沖沖液液pH的計計算算pH=pKa+lg([鹽]/[酸])電泳泳過過程程水水會會發發生生電電離離。。正極極：：2OH－→H2O＋1/2O2↑↑＋2epH↓↓負極極：：2H＋＋2e→→H2↑↑pH↑↑故電電泳泳2～4次后后應應將將緩緩沖沖液液正正極極交交換換，，減減少少這這種種影影響響。。3.離子子強強度度是指指溶溶液液中中各各種種離離子子的的摩摩爾爾濃濃度度（（Ci）與與其其電電荷荷數數平平方方（（Zi2）乘乘積積總總和和的的1/2。即即I=1/2∑∑CiZi2I的單單位位是是mol/L。如0.1mol/LNaCLI=0.1mol/L0.2mol/LMgCL2I=0.6mol/L對于于緩緩沖沖液液I計算算，，由由于于弱弱酸酸的的電電離離度度很很低低，，一一般般只只計計算算鹽鹽的的。。I愈大大，，緩緩沖沖能能力力越越大大，，pH越穩穩定定，但但緩緩沖沖液液所所載載分分電電流流增增加加，，樣樣品品所所栽栽的的電電流流減減少少，，電電泳泳速速度度減減慢慢，，導導電電能能力力增增加加，，產產熱熱增增加加。。I過小，緩沖沖能力小，，pH不穩定，緩沖液所所載分電流流減少，樣樣品所載分分電流增加加，緩沖液液粘度系數數降低，電電泳速度加加快。但樣樣品在支持持物上擴散散嚴重，分分辨率降低低。兼顧兩方面面的影響，，一般在0.05~0.1mol/L。（二）支持持介質對支持介質質的基本要要求是具有有化學惰性性，不與被被分離的樣樣品或緩沖沖液起化學學反應，并并具有一定定的堅韌度度。1.吸附使被分離樣樣品滯留，，而降低電電泳速度，，造成拖尾尾而使分辨辨率降低。。2.電滲電泳過程中中液體對固固體支持物物的相對移移動稱為電電滲。實實際上是電電泳材料表表面的電荷荷引起水的的定向移動動。當電滲作用用方向與電電泳方向一一致，電泳泳速度加快快，順水行行舟。當電滲作用用方向與電電泳方向相相反，電泳泳速度減慢慢，逆水行行舟。四、常用電電泳技術區帶電泳是是目前應用用最廣泛的的一種電泳泳技術，區區帶電泳的的支持介質質常用的有有濾紙，醋醋酸纖維薄薄膜，凝膠膠等。（一）濾濾紙電泳（（PE）是應用最早早的支持介介質。優點：材料價廉易易得，有一一定機械強強度。缺點：電泳時間長長，8～10h，吸附作用用大，造成成拖尾而降降低了分辨辨率，目前前已淘汰。。（二）醋醋酸纖維薄薄膜電泳（（CAE）1957年Kohn首先采用，，醋酸纖維維素是將纖纖維素分子子中葡萄糖糖單體上的的羥基乙酰?；纬沙衫w維素醋醋酸酯，然然后用丙酮酮和水的混混合溶劑溶溶解，涂成成均勻薄膜膜。優點：對蛋白質吸吸附作用很很小，分辨辨率高，區區帶清晰，，不吸附燃燃料，區帶帶周圍燃料料可完全清清掉，檢測測靈敏度較較高，樣品品用量少0.3~2μl，電泳時間間短20min~1小時，可透透明，便于于用光密度度掃描儀定定量。缺點：有輕度電滲滲作用，吸吸水性較差差，較脆。。（三）瓊脂脂糖凝膠電電泳（AGE）瓊脂糖糖是從從瓊脂脂中分分離得得到的的一種種多糖糖。主主要由由半乳乳糖和和L-3，6-脫水半半乳糖糖構成成。常常用濃濃度0.5~1.0%。優點：：吸附作作用，，電滲滲作用用很小小，故故分辨辨率重重現性性好，，應用用廣，，同工工酶，，脂蛋蛋白，，免疫疫電泳泳，樣樣品用用量少少0.6~3.0μl，電泳泳時間間短30min~1h。透明明度好好，電電泳后后可直直接掃掃描定定量，，也可可烘干干制成成薄膜膜。缺點：：電泳完完畢后后區帶帶易擴擴散，，可及及時固固定。。點樣樣方法法，挖挖孔法法，濾濾紙插插入法法。（四））聚聚丙烯烯酰胺胺凝膠膠電泳泳（PAGE）是一種人工工合成的高高分子材料料，60年代新用于于電泳分析析，能將血血清蛋白分分為20多種組成。。優點：1.具有分子篩篩作用，分分離效果好好。2.化學穩定性性高，是一一種穩定的的親水膠體體。3.幾乎沒有吸吸附和電滲滲作用。4.機械強度好好，無色透透明，可直直接光密度度掃描。5.可調節凝膠膠孔徑以適適合不同分分子量的分分離。1.聚合丙烯酰胺＋＋甲叉丙烯烯酰胺聚聚丙丙烯酰胺（Acr）單體（（Bis）交聯劑化學摧化過硫酸銨-TEMED（四甲基乙乙二胺）系系統加速劑TEMED促使引發劑劑過硫酸銨銨形成自由由基，自由由基與Acr接能，使Acr單體形成自自由基而活活化，從而而引發聚合合，聚合速速度與pH，單體濃度度，溫度有有關。催化系統引發劑加加速劑劑光催化核黃素-TEMED系統，核黃黃素經光照照被還原成成無色核黃黃素，在和和痕量氧的的條件下，，無色核黃黃素又被氧氧化成核黃黃素自由基基，使Acr活化，從而而引發聚合合。優點：核黃素用量量少（10mg/L），對樣品品分析無影影響，聚合合時間可通通過調節光光照時間，，強度來控控制。2.孔徑與機械械強度凝膠孔徑由由凝膠總濃濃度和交聯聯度決定。。凝膠總濃濃度T（g/dl）表示100ml凝膠中Acr和Bis的總克數，，T值越大，孔孔徑越小。。交聯度C（%）表示交聯聯劑Bis占凝膠總濃濃度T的百分比，C值越大，孔孔徑越小。。T值固定不變變時，C值在5%時，凝膠孔孔徑最小，，大于或小小于5%，孔徑都會會增大。常用標準膠膠T=7.5g/dl，孔徑約5nm。凝膠的機械械強度、彈彈性、透明明度全要取取決于T及Acr與Bis的比值。通常要求求：T為2%~5%Acr/Bis=205%~10%Acr/Bis=4015%~20%Acr/Bis=125~2003.分類圓柱型根據凝膠膠的形狀狀水水平式平板型垂直式根據凝膠膠系統和和緩沖液液組成：：連續（均均相），，操作方方便。不連續（（多相）），分離離效果好好。4.分離原理理聚丙烯酰酰胺凝膠膠電泳大大多屬于于不連續續電泳。。（1）兩種不同孔孔徑的凝膠膠系統（2）電泳過程程中形成不不均勻不連連續系統上層大孔孔徑濃縮膠膠T2~3g/dl、Tris-HCl、pH6.7。下層小孔孔徑分離膠膠，T5~10g/dl，Tris-HCl，pH8.9。電極緩沖沖液Tris-甘氨酸pH8.3。（3）電極槽兩層凝膠中中的緩沖液液pH和組成不同同。高分辨率主主要是由于于下面三種種效應1.樣品濃縮效效應Cl－遷移率最大大，快離子子，解離度度最小的甘甘氨酸離子子遷移率最最小，慢離離子。蛋白白質離子介介于兩者之之間，快離離子與慢離離子之間形形成低導電電區，有較較高的電位位梯度，促促進蛋白質質和慢離子子的移動，，使蛋白質質樣品被壓壓縮為一薄薄層。2.分子篩效應應蛋白質進入入分離膠，，由于凝膠膠有一定的的孔徑，不不同的蛋白白質分子大大小不同，，受到的阻阻力不同，，小分子受受阻力小，，走在前面面，大分子子受阻力大大，走在后后面。3.電荷效應同一般電荷荷。五、蛋白質質區帶的定定性和定量量分析（一）蛋白質質區帶的染染色蛋白質電泳泳分離后可可以直接用用紫外光密密度掃描儀儀定量（利利用蛋白質質對280nm紫外光的吸吸收），但但需專門的的儀器，故故臨床上一一般采用染染色來進行行定性或定定量分析。。蛋白質染色色劑大多是是陰離子燃燃料，易與與蛋白質陽陽離子結合合，因此在在pH＜pI的酸性溶液液中較強。。常用的染色色劑有氨基基黑10B，溴酚藍，，麗春紅S。（二）蛋白白質區帶的的定性分析析經染色后，，首先應仔仔細觀察有有無異常區區帶。如多多發性骨髓髓瘤病人有有大量單克克隆蛋白質質（主要是是IgG或IgA）電泳時可可在β和γ之間呈現一一條區帶，，稱為M區帶。（三）蛋白白質區帶的的定量分析析蛋白質電泳泳的定量分分析通常以以各區帶占占總量的百百分率表示示如如同時測測定了蛋白白質總量，，也可換算算成各組分分的絕對量量（g/L）表示?？偟鞍?5g/LA:66%α1:3%α2:7%β:10%γ:15%49.5g/L2.25g/L5.25g/L7.25g/L11.25g/L1.光密密度度儀儀直直接接掃掃描描法法透明明的的電電泳泳圖圖譜譜可可用用光光密密度度儀儀直直接接掃掃描描得得出出各各組組分分的的百百分分率率。。操操作作簡簡便便，，迅迅速速，，誤誤差差小小，，結結果果較較準準確確。。2.洗脫比色法法染色后將各各區帶分別別剪下侵入入適當的溶溶劑中，將將蛋白質吸吸附的染料料全部洗脫脫然后進行行比色，求求出各組分分的百分含含量。操作繁瑣，，費時，準準確度不如如光密度儀儀直接掃描描法。六、特殊電電泳技術（一）等電電聚焦電泳泳（IFE）是利用具有有線性pH梯度的兩性性電解質為為載體，分分離等電點點不同的蛋蛋白質等兩兩性分子的的一種電泳泳新技術。。其分辨率率可達0.01pH單位，，特別別適用用于分分離分分子量量相近近而等等電點點不同同的蛋蛋白質質分子子。正正常人人血清清蛋白白質采采用此此法可可分出出50多條區區帶。。1.基本原原理在電泳泳系統統中建建立一一個從從正極極到負負極，，pH由低到到高的的連續續而穩穩定的的pH梯度。。處于于這一一系統統的各各種蛋蛋白質質，根根據各各自pI與所處處環境境pH值的差差別帶帶上正正電或或負電電，電電泳時時逐漸漸靠近近與其其pI相同的的pH位點，，而不不斷失失去凈凈電荷荷，直直至達達到pH=pI，凈電電荷為為零時時，不不再受受電場場力的的作用用，而而達到到聚焦焦。2.基本條條件①建立一一個穩穩定、、重復復性良良好的的連續續pH梯度。。②有一個個抗對對流的的材料料，防防止已已分離離樣品品重新新混合合。③電泳后后有適適當的的方法法來鑒鑒定分分離的的區帶帶。3.pH梯度的的建立立能建立立穩定定pH梯度的的兩性性電解解質是是一種種多羧羧基、、多氨氨基的的脂肪肪族化化合物物。如如瑞典典LKB公司生生產的的商品品名為為“Ampholine”的，它它由丙丙烯酸酸和多多乙烯烯多胺胺合成成。理想的的兩性性電解解質載載體應應具備備以下下特點點：（1）各成分分的導導電能能力彼彼此相相近。。（2）各成分分的pI彼此接接近，，并在在pI附近有有良好好的緩緩沖能能力。。（3）分子量量小，，易于于與樣樣品分分離。。（4）對280nm紫外光光沒有有或僅僅有很很低的的吸光光度，，不干干擾樣樣品測測定。。（二））雙雙向電電泳是先把把樣品品從一一個方方向進進行電電泳分分離，，然后后在與與其成成90。方方向上上進行行第二二次電電泳分分離。。如第第一次次電泳泳可以以其電電荷性性質為為基礎礎；第第二次次電泳泳則以以分離離量不不同進進行分分離。。通常常將等等電聚聚焦電電泳為為第一一相電電泳，，以SDS-聚丙烯烯酰胺胺凝膠膠為第第二相相電泳泳。（三））轉轉移電電泳又稱印印跡轉轉移電電泳。。此項項技術術是1975年由Southern在進行行DNA片段的的研究究中首首先使使用。。將凝凝膠電電泳所所得區區帶經經吸附附作用用轉移移到硝硝酸纖纖維薄薄膜（（NC膜）上上，由由于轉轉移過過程類類似于于將墨墨跡吸吸到吸吸水紙紙上，，故稱稱為(Southernbolt印跡法法)。1977年Alwine將此法法應用用于RNA研究，，取名名Nerthernblot。1979年Towbin又將其其擴展展到蛋蛋白質質研究究，將將其風風趣的的稱為為Westernblot.1981年，Reinhart等將等等電聚聚焦電電泳后后的蛋蛋白質質轉移移到NC上，取取名為為Easternblot.轉移電電泳技技術包包括三三個步步驟1.采用凝凝膠電電泳分分離蛋蛋白質質或核核酸，，電泳泳方式式有單單向，，雙相相，梯梯度，，等電電聚焦焦等。。2.轉移電電泳，，將已已分離離的蛋蛋白質質或核核酸經經電泳泳轉移移到NC或重氮氮芐氨氨基甲甲基紙紙上，，前者者為非非共價價吸附附，后后者為為共價價結合合。3.鑒定膜膜上的的蛋白白質或或核酸酸，，方法法有，，放射射自顯顯影，，酶標標免疫疫化學學等。。轉移電電泳的的優點點:對分離離蛋白白質的的鑒定定，比比在凝凝膠上上的操操作要要簡便便，轉轉移電電泳實實際上上是將將凝膠膠電泳泳的高高分辨辨率與與放射射標記記或酶酶標等等免疫疫化學學法的的高靈靈敏度度結合合起來來。第四節節層層析技技術層析法法又稱稱色譜譜法、、色層層分離離法，，1906年由俄俄國植植物學學Jauett首先用用于植植物色色素的的分離離提取取而得得名。。目前前，層層析技技術發發展迅迅速已已成為為生物物化學學、分分子生生物等等及生生物工工程等等學科科常用用的分分離分分析方方法，，如氣氣體、、無機機離子子、AA、糖類類、脂脂類、、Vit、藥物物，以以及大大分子子物質質、蛋蛋白質質、核核酸等等物質質的分分析。。一、層層析的的概念念與分分類（一））基本本概念念層析法法是利利用待待分離離物質質中不不同組組分的的某些些理化化性質質（在在兩相相中溶溶解、、吸附附、紊紊和作作用等等）的的差異異而建建立起起來的的一種種分離離技術術。所有的的層析析系統統均由由因定定相和和流動動相組組成，，固定定相是是固體體物質質或固固定于于固體體物質質的液液體，，流動動相是是可以以流動動的物物質。。如水水、某某些溶溶劑和和氣體體。當待分分離的的混合合物隨隨流動動相通通過固固定相相時，，由于于混合合物中中各組組分的的理化化性質質的差差異，，它們們在固固定相相和流流動相相中的的分配配比不不同，，隨溶溶媒的的向前前移動動，各各組分分不斷斷地在在兩相相中進進行再再分配配，與與固定定相作作用力力越弱弱的組組分，，隨流流動相相移動動時受受到的的阻滯滯作用用小，，向前前移動動速度度快，，反之之，與與固定定相作作用強強的組組分，，則向向前移移動速速度慢慢。如如紙層層析、、薄層層層析析、薄薄膜層層析、、層析析移動動的速速度用用比移移值或或阻滯滯因子子（Rf）來表示。。（二）層析析法分類1.按兩相所處處的狀態不不同分類按流動相的的狀態不同同，再按固固定相的狀狀態不同。。氣相層析液相層析氣固層析氣液層析液固層析液液層析層析法2.按層析分離離機制（分分離原理））分類（1）吸附層析析法（AC）固定相是固固體吸附劑劑，利用各各組化吸附附劑表面吸吸附能力的的差別而分分離。（2）分配層析析法（PC）固定相是液液體利用各各組分化流流動相和預預止液相同同（固定相相）中的分分配系數不不同的分離離。（3）離子交換換層析法（（IEC）固定相是離離子交換劑劑，利用各各組分對離離子交換劑劑親和力的的不同而分分離。（4）凝膠層析析法（GPC）固定相為多多孔性凝膠膠，利用各各組分分子子大、形狀狀不同在凝凝膠中受阻阻滯的程度度不同而分分離。（5）親和層析析法利用各組分分生物學特特殊性不同同而建立的的一種層析析方法，固固定相工能能和一種待待分離成分分類一結合合，使其與與其他物質質分離，如如利用抗原原、抗體的的結合來分分離相應的的抗原或抗抗體。3.按操作形式式不同分類類（1）柱層析析法（CC）固定相裝裝于柱內內，使樣樣品沿一一個方向向移動向向到分離離。（2）薄層層層析法（（TLC）將顆粒狀狀的固定定均勻地地鋪在薄薄板上，，點樣后后用流動動相展開開。（3）紙層析析法（PC）用濾紙作作為液體體的載體體，點樣樣后用流流動相展展開。（4）薄膜層層析法（（TFC）用高分子子有機吸吸附劑制制成薄膜膜，以類類似紙層層析的方方法進行行物質的的分離。。二、層技技術在生生化檢驗驗中的應應用（一）薄薄層層析析在生化化檢驗中中的應用用薄層層析析根據固固定相的的不同有有吸附、、分化和和離子交交換等技技術，以以吸附薄薄層層析析為例說說明其基基本方法法。1.固定相與與流動相相及選擇擇（1）固定相相為吸附劑劑，常用用的有硅硅膠、氯氯化鋁、、硅薄土土纖維素素等，固固定相選選擇時應應考慮的的因素。。①吸附劑劑如硅膠是是弱酸性性吸附劑劑，適合合于酸性性和中性性物質的的分離，，氫化鋁鋁是微堿堿性吸附附劑，適適合于堿堿性和中中性物質質分離，，硅薄土土、纖維維素、屬屬性吸附附劑。②吸附能能力常稱為活活度，主主要受吸吸附劑含含水量的的影響，，含水量量高活度度低，從從強到弱弱分為I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5級，活度度強吸附附作用強強，一般般分離水水溶性物物質活度度弱些，，而分離離脂溶性性物質活活度要強強些。③顆顆粒粒狀狀大大小小為了了使使每每次次測測定定的的Rf值恒恒定定，，吸吸附附劑劑要要求求顆顆粒粒大大小小均均勻勻、、適適當當，，顆顆粒粒細細、、吸吸附附能能力力強強，，展展開開慢慢、、顆顆粒粒粗粗、、吸吸附附能能力力弱弱，，展展開開快快、、分分離離放放開開差差，，一一般般顆顆粒粒直直徑徑為為無無機機類類0.07～0.1mm（70～140目）。（2）流動相相即展開劑劑，展開開劑的選選擇是薄薄層層折折中又一一關鍵，，一般極極性大的的化合物物需用極極性大的的展開劑劑。2.薄層層折折法操作作技術（1）制板常用方法法有三種種。干法、濕濕法和燒燒結法。。干法制板板（軟板板），常常用厚度度0.25～3.0mm，方法簡簡便，但但不堅固固易吹散散，只能能水中放放置，點點樣，顯顯色需加加小心，，濕法制制板（硬硬板）加加入一定定粘合劑劑（石膏膏、羧甲甲基纖維維素鈉、、淀粉等等），燒燒結法制制板吸附附劑，加加入一定定量無水水乙醇調調成糊狀狀制板，，然后放放入高溫溫爐中加加熱至750℃、60～75mm，機械強度度好，可反反復使用。。制成的板要要求涂布均均勻，晾干干、活化。。（2）點樣用毛細玻管管點樣，斑斑點直徑均均2mm，板板據據需需要要可可點點2-3次，，點點樣樣處處距距下下端端1.5cm。（3）展展開開將層層折折板板放放入入加加有有展展開開劑劑點點層層折折槽槽中中，，立立即即蓋蓋嚴嚴，，展展開開距距離離10cm取出出，，劃劃出出溶溶劑劑前前沿沿線線。。（4）顯顯色色等溶溶劑劑揮揮發發后后，，用用相相應應顯顯色色劑劑顯顯色色。。3.薄層層層層折折法法的的定定性性及及定定量量定性性分分析析主主要要依依據據Rf值，，與與標標準準液液的的Rf比較較，，定定量量，，采采用用專專用用的的薄薄層層掃掃描描儀儀，，測測量量斑斑點點的的薄薄線線大大小小，，并并與與標標準準液液斑斑點點比比較較。。4.應用用主要要用用于于AA、肽肽、、核核苷苷酸酸、、糖糖類類、、脂脂類類和和激激素素等等物物質質的的分分離離和和鑒鑒定定。。（二二））凝凝膠膠層層折折在在生生化化檢檢驗驗中中的的應應用用又稱稱凝凝膠膠過過濾濾、、分分子子篩篩層層折折、、排排阻阻層層折折。。固固定定相相是是多多孔孔凝凝膠膠，，商商品品凝凝膠膠是是干干燥燥顆顆粒粒，，當當吸吸收收一一定定量量液液體體后后溶溶脹脹成成一一種種柔柔軟軟而而富富有有彈彈性性、、不不帶帶電電荷荷、、不不與與溶溶質質互互作作用用的的惰惰性性物物質質，，由由于于凝凝膠膠有有一一定定孔孔徑徑，，對對分分子子大大小小不不同同的的組組分分的的阻阻滯滯作作用用不不同同。。在在被被分分離離物物質質中中，，大大分分子子組組分分由由于于直直徑徑大大，，不不當當進進入入凝凝膠膠孔孔徑徑內內，，隨隨流流動動相相向向前前移移快快，，小小分分子子組組分分則則能能進進入入凝凝膠膠微微孔孔內內，，向向前前移移動動慢慢，，而而達達到到分分離離。。1.凝膠的的種類類和性性能常用的的凝膠膠有葡葡聚糖糖、凝凝膠、、聚丙丙烯酰酰凝膠膠和瓊瓊脂糖糖凝膠膠。（1）葡聚聚糖凝凝膠將右旋旋葡萄萄糖的的線性性聚合合長鏈鏈間，，用交交聯劑劑1-氯代-2、3-環氯丙丙烷通通過醚醚橋交交聯而而成。。穩定定性好好，不不溶于于水，，但在在酸性性條件件下糖糖易水水解，，由于于分子子中會會有大大量羥羥基，，因此此有很很大的的吸水水性，，吸水水后溶溶脹成成透明明，而而且有有三維維空間間網狀狀結構構的彈彈性顆顆粒，，孔徑徑的大大小與與交聯聯度有有關，，交聯聯度大大，孔孔徑小小、吸吸水量量小，，商品品膠型型號多多以吸吸水量量10倍表示示，如如每克克干膠膠吸水水量為為2.5g，即為為G-25型，最最常用用的交交聯葡葡聚糖糖商品品名為為Sephadex。（2）聚丙丙烯