CELLENGINEERING細(xì)胞工程CELL細(xì)胞工程1第一章緒論4個學(xué)時

第二章實驗室配置及基本技術(shù)2個學(xué)時

第三章植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)4個學(xué)時

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)6個學(xué)時

第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)3個學(xué)時

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交3個學(xué)時

第七章人工種子及植物種質(zhì)資源保存2個學(xué)時

第八章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)2個學(xué)時第九章動物細(xì)胞培養(yǎng)4個學(xué)時

第十章動物細(xì)胞融合與單克隆抗體4個學(xué)時

第十一章動物組織與胚胎工程1個學(xué)時

第十二章試管動物與克隆動物1個學(xué)時

課程初步安排：36學(xué)時

第一章緒論2第七章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞是什么ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)及建系技術(shù)ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化ES/EG細(xì)胞技術(shù)學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用ES/EG細(xì)胞技術(shù)學(xué)面臨的問題和研究趨勢第七章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞是什么3一、干細(xì)胞（stemcells）是什么?具有無限的或延長的自我更新能力的細(xì)胞?能產(chǎn)生至少一種類型的高度分化的細(xì)胞一、干細(xì)胞（stemcells）是什么?具有無限的或延4

從具有的分化潛能上講：--專能干細(xì)胞--多能干細(xì)胞--全能干細(xì)胞從具有的分化潛能上講：5從組織發(fā)生即來源上講：

--胚胎性干細(xì)胞--成體干細(xì)胞/組織干細(xì)胞從組織發(fā)生即來源上講：6胚胎性干細(xì)胞是一類來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞等源于胚胎的干細(xì)胞，基本特征是有穩(wěn)定地在體外自我更新、穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能夠分化為屬于三胚層范疇的各種類型分化細(xì)胞，甚至參與個體發(fā)育。--來自早期胚胎：胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES）--來自胚胎生殖嵴中的原始生殖細(xì)胞：胚胎生殖細(xì)胞（embryonicgermcells,EG）--來自畸胎瘤組織：胚胎性癌細(xì)胞（embryonalcarcinomacells,EC）胚胎性干細(xì)胞是一類來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞等源于胚胎的干細(xì)7－－1981年，Evens和Martin分別成功的分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細(xì)胞；－－1995年，Thomson等人分離建立了第一株靈長類動物的胚胎干細(xì)胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細(xì)胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細(xì)胞；－－2002年3月，美國麻省理工學(xué)院科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細(xì)胞培育出毛細(xì)血管，證明了胚胎干細(xì)胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力；－－目前已有報導(dǎo)，ES細(xì)胞在離體適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞等。－－1981年，Evens和Martin分別成功的分離和體外8成體干細(xì)胞（adultstemcells,AS），也叫作組織干細(xì)胞（tissuestemcells）是指一群分布在成體組織中處于尚未分化的、具有自我更新并負(fù)有構(gòu)建和補充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞。如骨髓的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞；肝干細(xì)胞；骨骼肌干細(xì)胞等。--造血干細(xì)胞可分化為血液系統(tǒng)的各種細(xì)胞；小腸和皮膚中的干細(xì)胞具有分化、補充和更新小腸和皮膚組織的能力。--骨髓干細(xì)胞除了形成各種血細(xì)胞和衍生于間質(zhì)細(xì)胞的各類細(xì)胞外，還可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨和肝細(xì)胞等不同分化細(xì)胞。成體干細(xì)胞（adultstemcells,AS），也叫9細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件10二、ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)建系技術(shù)

分離囊胚的內(nèi)細(xì)胞群與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，ES細(xì)胞非分化增殖分離胚胎生殖腺細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的鑒定定向誘導(dǎo)分化功能細(xì)胞二、ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)建系技術(shù)11細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件121、ES/EG細(xì)胞的來源(1)發(fā)育良好的囊胚，從中分離ICM，進(jìn)一步分離培養(yǎng)ES細(xì)胞(2)從胚胎生殖腺中分離出EG細(xì)胞從畸胎瘤中分離出EC細(xì)胞治療性克隆即體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（SCNT）途徑分離培養(yǎng)ES細(xì)胞

1、ES/EG細(xì)胞的來源(1)發(fā)育良好的囊胚，從中分離ICM13細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件14細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件152、ES/EG細(xì)胞的分化抑制培養(yǎng)目前常用的細(xì)胞分化抑制物主要有三種:--飼養(yǎng)層細(xì)胞(feederlayer)--特殊細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)細(xì)胞條件培養(yǎng)液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitoryfactor,LIF)2、ES/EG細(xì)胞的分化抑制培養(yǎng)目前常用的細(xì)胞分化抑制物主16飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法：常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有下列兩種：（1）MEF細(xì)胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各種品系小鼠的12dpc胚胎。經(jīng)剪碎和胰蛋白酶消化，常規(guī)分散細(xì)胞培養(yǎng)為單層散布的成纖維細(xì)胞。（2）STO細(xì)胞，來自SIM小鼠(S)胚胎的對硫代鳥嘌呤(T)和烏本苷(O)有抗性的成纖維細(xì)胞系，能分泌干細(xì)胞生長因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法：常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有下列兩種：17無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備在一定程度上使ES/EG細(xì)胞培養(yǎng)顯得較繁雜。近來以添加LIF生長因子或某些特定細(xì)胞的條件培養(yǎng)液至含F(xiàn)CS的正常培養(yǎng)液，借此替代飼養(yǎng)層細(xì)胞：（1）直接在ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入重組LIF（2）Buffalo大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液(RH-CM)無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備在一定程度上使ES/EG細(xì)胞183、ES/EG細(xì)胞系的特性和鑒定（1）形態(tài)學(xué)特征（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定（3）嵌合體動物3、ES/EG細(xì)胞系的特性和鑒定（1）形態(tài)學(xué)特征（2）發(fā)育全19（1）形態(tài)學(xué)特征

體外培養(yǎng)小鼠ES/EG細(xì)胞在抑制分化培養(yǎng)中呈現(xiàn)一個或幾個核仁、且核質(zhì)比高的圓形或卵圓形細(xì)胞，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長形態(tài)，組成克隆的細(xì)胞彼此界限不清楚，粘連性強。

人ES與EG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征有所不同，與小鼠ES/EG也有所不同。單層培養(yǎng)時，人體ES細(xì)胞呈扁平狀群落，且細(xì)胞界限清楚。（1）形態(tài)學(xué)特征體外培養(yǎng)小鼠ES/EG細(xì)胞在抑制分化培養(yǎng)中20（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定

小鼠和包括人在內(nèi)的靈長類動物全能或多能性胚胎性干細(xì)胞，具有特有的表達(dá)標(biāo)志以及在體內(nèi)外的分化特點。（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定小鼠和包括人在21干細(xì)胞標(biāo)記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++？+小鼠與人類多能干細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)譜干細(xì)胞標(biāo)記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGS22SSEAs(stage-specificembryonicantigen):時期專一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:腫瘤排斥抗原AKP：堿性磷酸酶在小鼠及靈長類的ES細(xì)胞中活性較高，在已分化細(xì)胞中活性明顯降低；

Oct-4:是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子。作為和胚胎發(fā)育全能/多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Oct-4通過多種調(diào)控機制激活或抑制不同靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞的全能/多能性及未分化狀態(tài)的調(diào)控和維持中發(fā)揮重要作用。端粒酶(telomerase):一類核糖核蛋白，與維持真核細(xì)胞染色體末端的端粒長度和控制細(xì)胞壽命有關(guān)。人ES細(xì)胞的端粒酶活性高，而分化細(xì)胞一般難以檢測到；胚胎干細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)志：SSEAs(stage-specificembryoni23ES/EG細(xì)胞在體外被刺激分化為各種類型細(xì)胞是其最基本的屬性;ES/EG細(xì)胞接種于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股溝、眼窩、腹腔等可以形成由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層細(xì)胞構(gòu)成的畸胎瘤。胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)、外分化特點：ES/EG細(xì)胞在體外被刺激分化為各種類型細(xì)胞是其最基本的胚24

組織和器官的細(xì)胞由含有兩個或兩個以上基因型構(gòu)建而成的完整個體稱為嵌合體動物（chimaera）。把ES/EG細(xì)胞注入胚泡或與桑椹胚聚集，使其與正常胚胎結(jié)合在一起，并參與宿主胚胎發(fā)育，可形成嵌合體動物的各種組織和器官，包含生殖系嵌合體動物可通過毛色、皮膚顏色等外觀指標(biāo)進(jìn)行判定或是取器官組織進(jìn)行同功酶檢測(3)嵌合體動物組織和器官的細(xì)胞由含有兩個或兩個以上基因型構(gòu)建而成的完整25三、ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化三、ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化261、基本原理細(xì)胞誘導(dǎo)分化是一個細(xì)胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又精密協(xié)調(diào)的分子細(xì)胞學(xué)過程，是胚胎正常發(fā)育過程中重要而基本的現(xiàn)象；

ES細(xì)胞是體外研究誘導(dǎo)分化的較理想模型，在體外被誘導(dǎo)分化的途徑可能與在體胚胎細(xì)胞的不完全相同；在體胚胎的細(xì)胞分化過程中，誘導(dǎo)作用的結(jié)果不只是決定于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和專一性，同時也決定于被誘導(dǎo)細(xì)胞的反應(yīng)能力(competence)。后者受遺傳、發(fā)育潛能等內(nèi)在因素的限制；1、基本原理細(xì)胞誘導(dǎo)分化是一個細(xì)胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又27

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化實驗中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)繁多，誘導(dǎo)模式不盡相同，按其作用機理大致分為兩類：--使被誘導(dǎo)細(xì)胞可逆性輕度損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞分化無機物、有機酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物等--誘導(dǎo)物通過其與被誘導(dǎo)細(xì)胞表面的受體結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞分化類固醇激素、維甲酸衍生物、多肽生長因子等

同一種誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)出不同類型細(xì)胞或變化多端的構(gòu)造，不僅涉及誘導(dǎo)劑的濃度差別、誘導(dǎo)作用模式和微環(huán)境的未知因素等，而且可能與被誘導(dǎo)細(xì)胞本身的發(fā)育潛能和對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)性等差別有關(guān)。ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化實驗中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)繁多，誘導(dǎo)模式同28

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化途徑可分為：--譜系分化（lineagedifferentiation），有利于認(rèn)識組織譜系細(xì)胞分化機理和全過程。ES細(xì)胞譜系祖細(xì)胞譜系定型細(xì)胞終末分化細(xì)胞--定向分化（committeddiffereniation），需設(shè)法控制導(dǎo)向產(chǎn)生單一類型的分化細(xì)胞。對ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因、細(xì)胞分化因子結(jié)合報告基因和誘導(dǎo)條件選擇等手段，探索定向誘導(dǎo)分化途徑ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化途徑可分為：29細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件30細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件312、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化：較難分化為單一類型的細(xì)胞ES細(xì)胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化：相對誘導(dǎo)分化細(xì)胞類型較單一,具體方法有：（1）軟瓊脂培養(yǎng)（2）懸滴培養(yǎng)

2、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化32制備ES單細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋蓋上帶有懸浮細(xì)胞小滴的蓋子培養(yǎng)皿內(nèi)加PBS培養(yǎng)皿邊緣用膜封置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)移擬胚體至含細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)皿或微孔板進(jìn)一步培養(yǎng)然后,移放入鋪有0.1%白明膠的培養(yǎng)皿或微孔板內(nèi)在培養(yǎng)液中再培養(yǎng)可被誘導(dǎo)分化為不同類型細(xì)胞ES細(xì)胞體外懸滴培養(yǎng)制備ES單細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm333、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化舉例造血細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞與血管神經(jīng)細(xì)胞脂肪細(xì)胞心肌和其他肌肉細(xì)胞軟骨細(xì)胞胰島細(xì)胞3、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化舉例造血細(xì)胞34小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)并分化產(chǎn)生各種造血系統(tǒng)的細(xì)胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES細(xì)胞擬胚體成單個細(xì)胞，經(jīng)干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和條件培養(yǎng)液處理，誘導(dǎo)其定向分化為造血干細(xì)胞；②用原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞作飼養(yǎng)層和SCF及IL-6細(xì)胞因子處理可進(jìn)一步使ES細(xì)胞來源的造血干細(xì)胞分化為B淋巴細(xì)胞系。造血細(xì)胞小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣35內(nèi)皮細(xì)胞與血管小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)，其中也有內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)：①利用經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因轉(zhuǎn)染的小鼠ES細(xì)胞在含RA培養(yǎng)液中經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體；②再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)擬胚體周圍呈輻射狀長出許多血管樣結(jié)構(gòu)。將外源重組TGF-β1添加至培養(yǎng)液，同樣也能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組成的血管樣結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞與血管小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚36心肌和其它肌肉細(xì)胞

懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞擬胚體在RA誘導(dǎo)條件下貼壁生長數(shù)天，常出現(xiàn)某些分化細(xì)胞集落具有節(jié)律性自發(fā)收縮的現(xiàn)象，顯然是肌細(xì)胞：DMSO誘導(dǎo)ES細(xì)胞擬胚體可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多種類型肌細(xì)胞，用肌肉專一性的調(diào)節(jié)因子MyoD基因轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞并結(jié)合DMSO誘導(dǎo)處理，額外表達(dá)MyoD基因的ES細(xì)胞主要分化為骨骼肌且常融合成肌管。心肌和其它肌肉細(xì)胞懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞擬胚體在RA37ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是至今仍未解決、正在探索中的問題。根據(jù)國外少數(shù)報道和國內(nèi)的經(jīng)驗，對ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因或是有關(guān)細(xì)胞分化因子等遺傳操作，并結(jié)合誘導(dǎo)條件選擇等手段，是一條可能的探索ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的途徑。ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是至今仍未解決、正在探索中的問題。根據(jù)國38四、ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化

尋找建立ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的分化細(xì)胞永生化途徑是目前ES/EG細(xì)胞研究領(lǐng)域待解決的問題。四、ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化尋39五、ES/EG培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的意義哺乳類發(fā)育的體外模型人體的基因和細(xì)胞治療組織工程的種子細(xì)胞來源五、ES/EG培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的意義哺乳類發(fā)育的體外模型人體40細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件41哺乳動物早期胚胎一般體積很小，又在宮內(nèi)發(fā)育，在體內(nèi)研究胚胎發(fā)育和各類細(xì)胞分化及其機理幾乎不可能；ES細(xì)胞具有完整的發(fā)育潛能性，而且對所有調(diào)節(jié)正常發(fā)育的信號具有應(yīng)答能力。雖然ES細(xì)胞體外分化途徑和機制與在體胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之處，是研究特定類型細(xì)胞分化、某些前體細(xì)胞起源和細(xì)胞譜系演變較理想的實驗體系；許多國家在法律上禁止以克隆或復(fù)制人為目的的前提下，已允許將人ES細(xì)胞類似于小鼠ES細(xì)胞體外實驗一樣，用于研究人類胚胎發(fā)育、分化和調(diào)節(jié)信號等事件。哺乳類發(fā)育的體外模型哺乳動物早期胚胎一般體積很小，又在宮內(nèi)發(fā)育，在體內(nèi)研究胚胎發(fā)42人體的基因和細(xì)胞治療

這里的基因治療是指用遺傳改造過的人體細(xì)胞直接移植或輸入病人體內(nèi)，達(dá)到控制和治愈疾病為目的的治療手段，又稱細(xì)胞治療。人體的基因和細(xì)胞治療這里的基因治療是指用遺傳43目前常說的基因治療技術(shù)雖然能把編碼正常序列的基因?qū)胪蛔兗?xì)胞而使突變基因的功能得到糾正，但導(dǎo)入基因的整合和表達(dá)難以精確控制，特別是基因插入后對其他基因產(chǎn)生的效應(yīng)尚無法預(yù)知。更大問題是，許多被用作基因操作的細(xì)胞在體外不易穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)染和增殖傳代；ES細(xì)胞是基因治療的較理想的靶細(xì)胞，經(jīng)遺傳操作后一般仍能穩(wěn)定地在體外增殖傳代，克服了目前基因治療中需要大量靶細(xì)胞來源的主要問題。目前常說的基因治療技術(shù)雖然能把編碼正常序列的基因?qū)?4定向誘導(dǎo)分化，選擇治療因子基因表達(dá)

人ES細(xì)胞基因操作（克服免疫學(xué)障礙）

多種MHC組合的ES細(xì)胞庫

組織譜系干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞）

功能性分化細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）移植移植

不同類型疾病的宿主

基因組被改造的ES細(xì)胞異源性基因表達(dá)基因修飾

基因敲除、敲入定向誘導(dǎo)分化選擇

組織譜系干細(xì)胞或功能性分化細(xì)胞移植圖2-2-1用于基因和細(xì)胞治療的人ES細(xì)胞工程示意圖基本策略1定向誘導(dǎo)分化，選擇治療因子基因表達(dá)人ES細(xì)胞基因操作45基本策略2欲接受細(xì)胞治療患者的體細(xì)胞核導(dǎo)入去核卵細(xì)胞體外發(fā)育胚泡期專用ES細(xì)胞特化細(xì)胞分離培養(yǎng)體外誘導(dǎo)分化回輸基本策略2欲接受細(xì)胞治療患者的導(dǎo)入去核卵細(xì)胞體外發(fā)育46細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用前景神經(jīng)系統(tǒng)疾病骨和軟骨疾病血液病肝病細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用前景神經(jīng)系統(tǒng)疾病47神經(jīng)系統(tǒng)疾病

根據(jù)小鼠ES/EG細(xì)胞研究資料，由于各種類型神經(jīng)細(xì)胞因某種原因死亡而成熟神經(jīng)細(xì)胞又不能分裂、補充和替代死亡細(xì)胞引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多發(fā)性硬化癥等，有望通過人ES/EG細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療。新近，產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞已能從小鼠ES細(xì)胞衍生而來，為細(xì)胞治療Parkinson’s病的ES細(xì)胞來源問題提供實驗依據(jù)。神經(jīng)系統(tǒng)疾病根據(jù)小鼠ES/EG細(xì)胞研究資料，由于各種類型神48骨和軟骨疾病ES/EG細(xì)胞可能在體外被誘導(dǎo)為骨和軟骨，這些細(xì)胞被導(dǎo)入骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)域，或因骨折、手術(shù)而引起的較大骨隙中，這類從ES細(xì)胞衍生的骨和軟骨細(xì)胞在被移植部位自我修復(fù)的優(yōu)點遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)行的組織移植。骨和軟骨疾病ES/EG細(xì)胞可能在體外被誘導(dǎo)為骨和軟骨，這些細(xì)49血液病ES和造血干細(xì)胞研究有助于產(chǎn)生供細(xì)胞移植用的、不含有鐮刀狀血球突變的血細(xì)胞。血液病ES和造血干細(xì)胞研究有助于產(chǎn)生供細(xì)胞移植用的、不含有50肝病利用肝干細(xì)胞移植治療肝病取得了重要進(jìn)展。肝病利用肝干細(xì)胞移植治療肝病取得了重要進(jìn)展。51

組織工程的種子細(xì)胞來源人體ES細(xì)胞技術(shù)學(xué)的發(fā)生和發(fā)展，有望解決目前組織或器官修復(fù)中的難題。組織工程的種子細(xì)胞來源人體ES細(xì)胞技術(shù)學(xué)的發(fā)生和發(fā)52

設(shè)想是選擇與人體細(xì)胞兼容性較好的生物材料，按缺損組織或器官的要求設(shè)計制成模型或支架放在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，使ES細(xì)胞或其定向誘導(dǎo)分化細(xì)胞沿著模型或支架不斷地生長擴增，構(gòu)建成新的組織或器官。但ES細(xì)胞定向分化和構(gòu)成組織和器官中細(xì)胞類型的復(fù)雜性等諸多問題尚待解決；

目前工作是著重于從成年或幼年器官和組織的碎片中分離、培養(yǎng)和擴增某一類型的組織干細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增有可能作為組織工程的種子細(xì)胞來源。例如，從骨髓分離和擴增間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell,MSC)，用作骨折愈合、肌腱韌帶修復(fù)、肌肉再生和造血重建等組織工程的種子細(xì)胞。設(shè)想是選擇與人體細(xì)胞兼容性較好的生物材料，按缺損組織或器官53六、ES細(xì)胞研究面臨的問題和研究趨勢--如何解決用于人類胚胎干細(xì)胞研究的胚胎來源問題？--如何分離、純化干細(xì)胞？--如何保持體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的全能性，并控制定向誘導(dǎo)分化？--如何使ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的分化細(xì)胞永生化？--分化后的細(xì)胞是否有致瘤性？--如何使干細(xì)胞在體外發(fā)育成完整的器官？--如何克服分化細(xì)胞移植后仍有可能發(fā)生的免疫排斥？--有關(guān)倫理道德和法律以及商業(yè)應(yīng)用等問題六、ES細(xì)胞研究面臨的問題和研究趨勢--如何解決用于人類胚54--改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效、更簡便的獲得ES細(xì)胞的方法；--定向誘導(dǎo)分化成特定類型細(xì)胞，用于臨床疾病治療并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題；--成體干細(xì)胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細(xì)胞的比較：成體干細(xì)胞能否替代胚胎干細(xì)胞？--改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效、更簡便的獲得55嵌合體一詞的英文是chimera，源于希臘神話，是指獅子頭、山羊身和蛇尾的雌性怪物。有關(guān)嵌合體神話在各國文化中都有嵌合體的科學(xué)概念則是，任何由兩個或兩個以上遺傳上不同的組織構(gòu)成的機體。它可以是任何不同物種的混合，但目前較關(guān)注的是動物與人的嵌合體。嵌合體與雜合體（hybrid）不同。雜合體是由來自不同物種的兩個配子形成一個合子。一個雜合體的所有細(xì)胞來源于這一合子。嵌合體一詞的英文是chimera，源于希臘神話，是指獅子頭、56

最近美國政府封殺了斯坦福大學(xué)的一項向小鼠大腦植入人類神經(jīng)干細(xì)胞的研究，引起了國際學(xué)界和公眾的關(guān)注。這項研究是當(dāng)前干細(xì)胞研究前沿的一個重要方面，涉及到一個機體擁有兩種不同物種的細(xì)胞或組織，這種嵌合體研究引起許多新穎的倫理問題，激發(fā)了對這類研究應(yīng)該采取什么行動的倫理爭論。最近美國政府封殺了斯坦福大學(xué)的一項向小鼠大腦植57第一是為了建立動物模型。

例如世界上首次克隆牛的華裔美籍科學(xué)家楊向中創(chuàng)造了兔子的人類心臟病模型，可以表達(dá)人類引致心臟病的基因；而原來用大鼠建立的模型不能表達(dá)人的基因，用大鼠模型試驗的藥物對人體無用為什么要創(chuàng)建嵌合體呢？第一是為了建立動物模型。為什么要創(chuàng)建嵌合體呢？58干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)后如何行為？它們?nèi)绾畏只⒁苿雍托纬尚陆M織？在人身上試驗不道德，應(yīng)首先在動物身上研究。將人類干細(xì)胞注射入動物體內(nèi)，引起兩方面的問題：一是在生殖方面，如果將人胚胎干細(xì)胞注射入動物胎兒，尤其在很早期，它們很可能移動到發(fā)育機體的生殖系產(chǎn)生人類的精子和卵。如果這兩個嵌合體交配，一個人類精子使一個人類卵受精，結(jié)果在一個動物子宮生長出一個人類胚胎。如果這種動物（例如嵌合體小鼠）產(chǎn)生的人類精子和卵，用體外受精方法產(chǎn)生一個孩子，他或她的父母是一對小鼠？這對孩子將是非常尷尬的。二是在腦方面。如果Weissman設(shè)想的有100%人類神經(jīng)細(xì)胞的小鼠有一天站起來說：“嗨，我是米老鼠！”那時我們對它該怎么辦？這種可能似乎不大。理由是意識肯定不發(fā)生在細(xì)胞層次，鼠腦又不到人腦大小的千分之一。但如果將人類干細(xì)胞注射入黑猩猩胚胎內(nèi)，擁有100%人類神經(jīng)細(xì)胞的黑猩猩是否會發(fā)育生長出具有某種人性的功能，就很難說了。第二是為了進(jìn)行干細(xì)胞研究。干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)后如何行為？它們?nèi)绾畏只⒁苿雍托纬尚陆M59

人體發(fā)生過程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰內(nèi)細(xì)胞群中胚層結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng)人體發(fā)生過程：60CELLENGINEERING細(xì)胞工程CELL細(xì)胞工程61第一章緒論4個學(xué)時

第二章實驗室配置及基本技術(shù)2個學(xué)時

第三章植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)4個學(xué)時

第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)6個學(xué)時

第五章植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)3個學(xué)時

第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交3個學(xué)時

第七章人工種子及植物種質(zhì)資源保存2個學(xué)時

第八章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)2個學(xué)時第九章動物細(xì)胞培養(yǎng)4個學(xué)時

第十章動物細(xì)胞融合與單克隆抗體4個學(xué)時

第十一章動物組織與胚胎工程1個學(xué)時

第十二章試管動物與克隆動物1個學(xué)時

課程初步安排：36學(xué)時

第一章緒論62第七章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞是什么ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)及建系技術(shù)ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化ES/EG細(xì)胞技術(shù)學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用ES/EG細(xì)胞技術(shù)學(xué)面臨的問題和研究趨勢第七章胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)干細(xì)胞是什么63一、干細(xì)胞（stemcells）是什么?具有無限的或延長的自我更新能力的細(xì)胞?能產(chǎn)生至少一種類型的高度分化的細(xì)胞一、干細(xì)胞（stemcells）是什么?具有無限的或延64

從具有的分化潛能上講：--專能干細(xì)胞--多能干細(xì)胞--全能干細(xì)胞從具有的分化潛能上講：65從組織發(fā)生即來源上講：

--胚胎性干細(xì)胞--成體干細(xì)胞/組織干細(xì)胞從組織發(fā)生即來源上講：66胚胎性干細(xì)胞是一類來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞等源于胚胎的干細(xì)胞，基本特征是有穩(wěn)定地在體外自我更新、穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能夠分化為屬于三胚層范疇的各種類型分化細(xì)胞，甚至參與個體發(fā)育。--來自早期胚胎：胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES）--來自胚胎生殖嵴中的原始生殖細(xì)胞：胚胎生殖細(xì)胞（embryonicgermcells,EG）--來自畸胎瘤組織：胚胎性癌細(xì)胞（embryonalcarcinomacells,EC）胚胎性干細(xì)胞是一類來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞等源于胚胎的干細(xì)67－－1981年，Evens和Martin分別成功的分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細(xì)胞；－－1995年，Thomson等人分離建立了第一株靈長類動物的胚胎干細(xì)胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細(xì)胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細(xì)胞；－－2002年3月，美國麻省理工學(xué)院科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細(xì)胞培育出毛細(xì)血管，證明了胚胎干細(xì)胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力；－－目前已有報導(dǎo)，ES細(xì)胞在離體適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞等。－－1981年，Evens和Martin分別成功的分離和體外68成體干細(xì)胞（adultstemcells,AS），也叫作組織干細(xì)胞（tissuestemcells）是指一群分布在成體組織中處于尚未分化的、具有自我更新并負(fù)有構(gòu)建和補充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞。如骨髓的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞；肝干細(xì)胞；骨骼肌干細(xì)胞等。--造血干細(xì)胞可分化為血液系統(tǒng)的各種細(xì)胞；小腸和皮膚中的干細(xì)胞具有分化、補充和更新小腸和皮膚組織的能力。--骨髓干細(xì)胞除了形成各種血細(xì)胞和衍生于間質(zhì)細(xì)胞的各類細(xì)胞外，還可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨和肝細(xì)胞等不同分化細(xì)胞。成體干細(xì)胞（adultstemcells,AS），也叫69細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件70二、ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)建系技術(shù)

分離囊胚的內(nèi)細(xì)胞群與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，ES細(xì)胞非分化增殖分離胚胎生殖腺細(xì)胞胚胎干細(xì)胞的鑒定定向誘導(dǎo)分化功能細(xì)胞二、ES/EG細(xì)胞的培養(yǎng)建系技術(shù)71細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件721、ES/EG細(xì)胞的來源(1)發(fā)育良好的囊胚，從中分離ICM，進(jìn)一步分離培養(yǎng)ES細(xì)胞(2)從胚胎生殖腺中分離出EG細(xì)胞從畸胎瘤中分離出EC細(xì)胞治療性克隆即體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移（SCNT）途徑分離培養(yǎng)ES細(xì)胞

1、ES/EG細(xì)胞的來源(1)發(fā)育良好的囊胚，從中分離ICM73細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件74細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件752、ES/EG細(xì)胞的分化抑制培養(yǎng)目前常用的細(xì)胞分化抑制物主要有三種:--飼養(yǎng)層細(xì)胞(feederlayer)--特殊細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)細(xì)胞條件培養(yǎng)液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitoryfactor,LIF)2、ES/EG細(xì)胞的分化抑制培養(yǎng)目前常用的細(xì)胞分化抑制物主76飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法：常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有下列兩種：（1）MEF細(xì)胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各種品系小鼠的12dpc胚胎。經(jīng)剪碎和胰蛋白酶消化，常規(guī)分散細(xì)胞培養(yǎng)為單層散布的成纖維細(xì)胞。（2）STO細(xì)胞，來自SIM小鼠(S)胚胎的對硫代鳥嘌呤(T)和烏本苷(O)有抗性的成纖維細(xì)胞系，能分泌干細(xì)胞生長因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法：常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有下列兩種：77無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備在一定程度上使ES/EG細(xì)胞培養(yǎng)顯得較繁雜。近來以添加LIF生長因子或某些特定細(xì)胞的條件培養(yǎng)液至含F(xiàn)CS的正常培養(yǎng)液，借此替代飼養(yǎng)層細(xì)胞：（1）直接在ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入重組LIF（2）Buffalo大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液(RH-CM)無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備在一定程度上使ES/EG細(xì)胞783、ES/EG細(xì)胞系的特性和鑒定（1）形態(tài)學(xué)特征（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定（3）嵌合體動物3、ES/EG細(xì)胞系的特性和鑒定（1）形態(tài)學(xué)特征（2）發(fā)育全79（1）形態(tài)學(xué)特征

體外培養(yǎng)小鼠ES/EG細(xì)胞在抑制分化培養(yǎng)中呈現(xiàn)一個或幾個核仁、且核質(zhì)比高的圓形或卵圓形細(xì)胞，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長形態(tài)，組成克隆的細(xì)胞彼此界限不清楚，粘連性強。

人ES與EG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征有所不同，與小鼠ES/EG也有所不同。單層培養(yǎng)時，人體ES細(xì)胞呈扁平狀群落，且細(xì)胞界限清楚。（1）形態(tài)學(xué)特征體外培養(yǎng)小鼠ES/EG細(xì)胞在抑制分化培養(yǎng)中80（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定

小鼠和包括人在內(nèi)的靈長類動物全能或多能性胚胎性干細(xì)胞，具有特有的表達(dá)標(biāo)志以及在體內(nèi)外的分化特點。（2）發(fā)育全能性和分化潛能鑒定小鼠和包括人在81干細(xì)胞標(biāo)記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++？+小鼠與人類多能干細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)譜干細(xì)胞標(biāo)記鼠類EC鼠類ES鼠類EG人類EC人類ES人類EGS82SSEAs(stage-specificembryonicantigen):時期專一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:腫瘤排斥抗原AKP：堿性磷酸酶在小鼠及靈長類的ES細(xì)胞中活性較高，在已分化細(xì)胞中活性明顯降低；

Oct-4:是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子。作為和胚胎發(fā)育全能/多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Oct-4通過多種調(diào)控機制激活或抑制不同靶基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞的全能/多能性及未分化狀態(tài)的調(diào)控和維持中發(fā)揮重要作用。端粒酶(telomerase):一類核糖核蛋白，與維持真核細(xì)胞染色體末端的端粒長度和控制細(xì)胞壽命有關(guān)。人ES細(xì)胞的端粒酶活性高，而分化細(xì)胞一般難以檢測到；胚胎干細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)志：SSEAs(stage-specificembryoni83ES/EG細(xì)胞在體外被刺激分化為各種類型細(xì)胞是其最基本的屬性;ES/EG細(xì)胞接種于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股溝、眼窩、腹腔等可以形成由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層細(xì)胞構(gòu)成的畸胎瘤。胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)、外分化特點：ES/EG細(xì)胞在體外被刺激分化為各種類型細(xì)胞是其最基本的胚84

組織和器官的細(xì)胞由含有兩個或兩個以上基因型構(gòu)建而成的完整個體稱為嵌合體動物（chimaera）。把ES/EG細(xì)胞注入胚泡或與桑椹胚聚集，使其與正常胚胎結(jié)合在一起，并參與宿主胚胎發(fā)育，可形成嵌合體動物的各種組織和器官，包含生殖系嵌合體動物可通過毛色、皮膚顏色等外觀指標(biāo)進(jìn)行判定或是取器官組織進(jìn)行同功酶檢測(3)嵌合體動物組織和器官的細(xì)胞由含有兩個或兩個以上基因型構(gòu)建而成的完整85三、ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化三、ES/EG細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化861、基本原理細(xì)胞誘導(dǎo)分化是一個細(xì)胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又精密協(xié)調(diào)的分子細(xì)胞學(xué)過程，是胚胎正常發(fā)育過程中重要而基本的現(xiàn)象；

ES細(xì)胞是體外研究誘導(dǎo)分化的較理想模型，在體外被誘導(dǎo)分化的途徑可能與在體胚胎細(xì)胞的不完全相同；在體胚胎的細(xì)胞分化過程中，誘導(dǎo)作用的結(jié)果不只是決定于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和專一性，同時也決定于被誘導(dǎo)細(xì)胞的反應(yīng)能力(competence)。后者受遺傳、發(fā)育潛能等內(nèi)在因素的限制；1、基本原理細(xì)胞誘導(dǎo)分化是一個細(xì)胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又87

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化實驗中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)繁多，誘導(dǎo)模式不盡相同，按其作用機理大致分為兩類：--使被誘導(dǎo)細(xì)胞可逆性輕度損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞分化無機物、有機酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物等--誘導(dǎo)物通過其與被誘導(dǎo)細(xì)胞表面的受體結(jié)合而誘導(dǎo)細(xì)胞分化類固醇激素、維甲酸衍生物、多肽生長因子等

同一種誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)出不同類型細(xì)胞或變化多端的構(gòu)造，不僅涉及誘導(dǎo)劑的濃度差別、誘導(dǎo)作用模式和微環(huán)境的未知因素等，而且可能與被誘導(dǎo)細(xì)胞本身的發(fā)育潛能和對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)性等差別有關(guān)。ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化實驗中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)繁多，誘導(dǎo)模式同88

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化途徑可分為：--譜系分化（lineagedifferentiation），有利于認(rèn)識組織譜系細(xì)胞分化機理和全過程。ES細(xì)胞譜系祖細(xì)胞譜系定型細(xì)胞終末分化細(xì)胞--定向分化（committeddiffereniation），需設(shè)法控制導(dǎo)向產(chǎn)生單一類型的分化細(xì)胞。對ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因、細(xì)胞分化因子結(jié)合報告基因和誘導(dǎo)條件選擇等手段，探索定向誘導(dǎo)分化途徑ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化途徑可分為：89細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件90細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件912、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化：較難分化為單一類型的細(xì)胞ES細(xì)胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化：相對誘導(dǎo)分化細(xì)胞類型較單一,具體方法有：（1）軟瓊脂培養(yǎng)（2）懸滴培養(yǎng)

2、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化92制備ES單細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm的培養(yǎng)皿蓋蓋上帶有懸浮細(xì)胞小滴的蓋子培養(yǎng)皿內(nèi)加PBS培養(yǎng)皿邊緣用膜封置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)移擬胚體至含細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)皿或微孔板進(jìn)一步培養(yǎng)然后,移放入鋪有0.1%白明膠的培養(yǎng)皿或微孔板內(nèi)在培養(yǎng)液中再培養(yǎng)可被誘導(dǎo)分化為不同類型細(xì)胞ES細(xì)胞體外懸滴培養(yǎng)制備ES單細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)皿蓋上接種20ul/滴，直徑10cm933、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化舉例造血細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞與血管神經(jīng)細(xì)胞脂肪細(xì)胞心肌和其他肌肉細(xì)胞軟骨細(xì)胞胰島細(xì)胞3、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化舉例造血細(xì)胞94小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)并分化產(chǎn)生各種造血系統(tǒng)的細(xì)胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES細(xì)胞擬胚體成單個細(xì)胞，經(jīng)干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和條件培養(yǎng)液處理，誘導(dǎo)其定向分化為造血干細(xì)胞；②用原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞作飼養(yǎng)層和SCF及IL-6細(xì)胞因子處理可進(jìn)一步使ES細(xì)胞來源的造血干細(xì)胞分化為B淋巴細(xì)胞系。造血細(xì)胞小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣95內(nèi)皮細(xì)胞與血管小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu)，其中也有內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)：①利用經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因轉(zhuǎn)染的小鼠ES細(xì)胞在含RA培養(yǎng)液中經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成擬胚體；②再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)擬胚體周圍呈輻射狀長出許多血管樣結(jié)構(gòu)。將外源重組TGF-β1添加至培養(yǎng)液，同樣也能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組成的血管樣結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞與血管小鼠ES細(xì)胞擬胚體在體外可以分化為類似于早期胚96心肌和其它肌肉細(xì)胞

懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞擬胚體在RA誘導(dǎo)條件下貼壁生長數(shù)天，常出現(xiàn)某些分化細(xì)胞集落具有節(jié)律性自發(fā)收縮的現(xiàn)象，顯然是肌細(xì)胞：DMSO誘導(dǎo)ES細(xì)胞擬胚體可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多種類型肌細(xì)胞，用肌肉專一性的調(diào)節(jié)因子MyoD基因轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞并結(jié)合DMSO誘導(dǎo)處理，額外表達(dá)MyoD基因的ES細(xì)胞主要分化為骨骼肌且常融合成肌管。心肌和其它肌肉細(xì)胞懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞擬胚體在RA97ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是至今仍未解決、正在探索中的問題。根據(jù)國外少數(shù)報道和國內(nèi)的經(jīng)驗，對ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞專一的轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志基因或是有關(guān)細(xì)胞分化因子等遺傳操作，并結(jié)合誘導(dǎo)條件選擇等手段，是一條可能的探索ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的途徑。ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是至今仍未解決、正在探索中的問題。根據(jù)國98四、ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化

尋找建立ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的分化細(xì)胞永生化途徑是目前ES/EG細(xì)胞研究領(lǐng)域待解決的問題。四、ES/EG細(xì)胞誘導(dǎo)分化細(xì)胞的永生化尋99五、ES/EG培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的意義哺乳類發(fā)育的體外模型人體的基因和細(xì)胞治療組織工程的種子細(xì)胞來源五、ES/EG培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的意義哺乳類發(fā)育的體外模型人體100細(xì)胞工程7胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)課件101哺乳動物早期胚胎一般體積很小，又在宮內(nèi)發(fā)育，在體內(nèi)研究胚胎發(fā)育和各類細(xì)胞分化及其機理幾乎不可能；ES細(xì)胞具有完整的發(fā)育潛能性，而且對所有調(diào)節(jié)正常發(fā)育的信號具有應(yīng)答能力。雖然ES細(xì)胞體外分化途徑和機制與在體胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之處，是研究特定類型細(xì)胞分化、某些前體細(xì)胞起源和細(xì)胞譜系演變較理想的實驗體系；許多國家在法律上禁止以克隆或復(fù)制人為目的的前提下，已允許將人ES細(xì)胞類似于小鼠ES細(xì)胞體外實驗一樣，用于研究人類胚胎發(fā)育、分化和調(diào)節(jié)信號等事件。哺乳類發(fā)育的體外模型哺乳動物早期胚胎一般體積很小，又在宮內(nèi)發(fā)育，在體內(nèi)研究胚胎發(fā)102人體的基因和細(xì)胞治療

這里的基因治療是指用遺傳改造過的人體細(xì)胞直接移植或輸入病人體內(nèi)，達(dá)到控制和治愈疾病為目的的治療手段，又稱細(xì)胞治療。人體的基因和細(xì)胞治療這里的基因治療是指用遺傳103目前常說的基因治療技術(shù)雖然能把編碼正常序列的基因?qū)胪蛔兗?xì)胞而使突變基因的功能得到糾正，但導(dǎo)入基因的整合和表達(dá)難以精確控制，特別是基因插入后對其他基因產(chǎn)生的效應(yīng)尚無法預(yù)知。更大問題是，許多被用作基因操作的細(xì)胞在體外不易穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)染和增殖傳代；ES細(xì)胞是基因治療的較理想的靶細(xì)胞，經(jīng)遺傳操作后一般仍能穩(wěn)定地在體外增殖傳代，克服了目前基因治療中需要大量靶細(xì)胞來源的主要問題。目前常說的基因治療技術(shù)雖然能把編碼正常序列的基因?qū)?04定向誘導(dǎo)分化，選擇治療因子基因表達(dá)

人ES細(xì)胞基因操作（克服免疫學(xué)障礙）

多種MHC組合的ES細(xì)胞庫

組織譜系干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞）

功能性分化細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）移植移植

不同類型疾病的宿主

基因組被改造的ES細(xì)胞異源性基因表達(dá)基因修飾

基因敲除、敲入定向誘導(dǎo)分化選擇

組織譜系干細(xì)胞或功能性分化細(xì)胞移植圖2-2-1用于基因和細(xì)胞治療的人ES細(xì)胞工程示意圖基本策略1定向誘導(dǎo)分化，選擇治療因子基因表達(dá)人ES細(xì)胞基因操作105基本策略2欲接受細(xì)胞治療患者的體細(xì)胞核導(dǎo)入去核卵細(xì)胞體外發(fā)育胚泡期專用ES細(xì)胞特化細(xì)胞分離培養(yǎng)體外誘導(dǎo)分化回輸基本策略2欲接受細(xì)胞治療患者的導(dǎo)入去核卵細(xì)胞體外發(fā)育106細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用前景神經(jīng)系統(tǒng)疾病骨和軟骨疾病血液病肝病細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用前景神經(jīng)系統(tǒng)疾病107神經(jīng)系統(tǒng)疾病

根據(jù)小鼠ES/EG細(xì)胞研究資料，由于各種類型神經(jīng)細(xì)胞因某種原因死亡而成熟神經(jīng)細(xì)胞又不能分裂、補充和替代死亡細(xì)胞引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多發(fā)性硬化癥等，有望通過人ES/EG細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療。新近，產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞已能從小鼠ES細(xì)胞衍生而來，為細(xì)胞治療Parkinson’s病的ES細(xì)胞來源問題提供實驗依據(jù)。神經(jīng)系統(tǒng)疾病根據(jù)小鼠ES/EG細(xì)胞研究資料，由于各種類型神108骨和軟骨疾病ES/EG細(xì)胞可能在體外被誘導(dǎo)為骨和軟骨，這些細(xì)胞被導(dǎo)入骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)域，或因骨折、手術(shù)而引起的較大骨隙中，這類從ES細(xì)胞衍生的骨和軟骨細(xì)胞在被移植部位自我修復(fù)的優(yōu)點遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)行的組織移植。骨和軟骨疾病ES/EG細(xì)胞可能在體外被誘導(dǎo)為骨和軟骨，這些細(xì)109血液病ES和造血干細(xì)胞研究有助于產(chǎn)生供細(xì)胞移植用的、不含有鐮刀狀血球突變的血細(xì)胞。血液病ES和造血干細(xì)胞研究有助于產(chǎn)生供細(xì)胞移植用的、不含有110肝病利用肝干細(xì)胞移植治療肝病取得了重要進(jìn)展。肝病利用肝干細(xì)胞移植治療肝病取得了重要進(jìn)展。111

組織工程的種子細(xì)胞來源人體ES細(xì)胞技術(shù)學(xué)的發(fā)生和發(fā)展，有望解決目前組織或器官修復(fù)中的難題。組織工程的種子細(xì)胞來源人體ES細(xì)胞技術(shù)學(xué)的發(fā)生和發(fā)112

設(shè)想是選擇與人體細(xì)胞兼容性較好的生物材料，按缺損組織或器官的要求設(shè)計制成模型或支架放在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，使