瓊脂糖凝膠電泳操作標準流程瓊脂糖凝膠電泳操作標準流程瓊脂糖凝膠電泳操作標準流程V:1.0精細整理，僅供參考瓊脂糖凝膠電泳操作標準流程日期：20xx年X月瓊脂糖凝膠電泳操作標準流程實驗目的:瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經濟快速等優點。DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術僅代表具備操作瓊脂糖電泳的能力。實驗原理:瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。影響核酸分子泳動率的因素主要還是：1、DNA分子大小；2、瓊脂糖濃度；3、DNA構想；4、所用的電壓；5、瓊脂糖種類；6、電泳緩沖液。核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidiumbromideEB）。溴化乙錠是一種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復合物時，出現不同的效應。254nm的紫外線照射時，靈敏度最高，但對DNA損傷嚴重；360nm紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對DNA損傷小，所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高，且對DNA損傷不是很大，所以也比較適用。材料、試劑及器具材料：不同大小的基因組片段試劑：HindIIIdigestDNAMarker（分子量標準）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；瓊脂糖；加樣緩沖液（6x）：溴酚藍；電泳緩沖液（1×TAE）；溴化乙錠（EB）；儀器及器具：（1）移液器、吸頭、錐形瓶（2）電泳系統：電泳儀、水平電泳槽、托盤、膠托、梳子等。（3）紫外透射儀、微波爐、電子天平操作步驟器具清洗：首先將配膠、電泳、染膠所需要的器具清洗干凈，包括托盤、膠托、梳子、電泳槽、染膠盤（EB污染，需獨立清洗）。清洗流程為：先用自來水沖洗三次，然后用純水沖洗三次，最后用紙巾或醫用紗布擦干。若需對電泳產物進行膠回收，則還需用75%酒精對器具進行消毒。配膠：根據基因組片段大小，配置相應濃度的瓊脂糖凝膠。首先將錐形瓶洗干凈并加入少量純水煮沸，然后量取一定量的電泳緩沖液（1×TAE）至錐形瓶中，再稱取相應量的瓊脂糖倒入錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，最后放入微波爐煮，煮膠的過程中需注意安全，應適當搖勻，防止爆沸。煮好的凝膠需無氣泡、色澤均勻。將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，及時將凝膠倒入裝好的干凈模具中。待凝膠完全凝固后，將凝膠小心轉移至4℃冰箱，冷凍30min，然后拔梳子。此時，凝膠需平整、不漏孔，可以用于電泳檢測。電泳準備：先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標記，然后把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負極（注意：①放凝膠前，需將膠托底部的凝膠抹干凈，防止膠托在電泳槽中滑動；②此時，可順便觀察凝膠是否漏孔），再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩沖液（1×TAE）至剛好將凝膠淹沒。（注意保持桌面衛生，防止緩沖液灑到桌面）上樣：將樣品、6×溴酚藍按3：1的比例混勻，輕甩后按照規定的順序上樣，上樣順序應與電泳槽上的標記一致，最后點上一定量的Ladder。（注意：①上樣時必須確保上樣順序正確無誤，樣品間不混淆，點樣后的空管子先放在電泳槽旁邊，用于核查；②點樣時不戳孔、不外漏、不溢出；③點樣時需小心槍頭不要碰到凝膠，以免凝膠挪動，若凝膠已經挪動，需等樣品完全沉到底部后，再固定凝膠）電泳：確認已經正確上樣后，雙手蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽（注意：確認電極正確連接），設置電泳參數：電壓：120V，電流：300mA，時間：30min（溴酚藍跑至膠2/3為宜）；注意確認電極、電泳參數完全正確之后，最后按star鍵開始電泳。染膠：電泳結束之后，帶上PE手套，小心滑出凝膠，把凝膠轉移到干凈的PE手套上（注意：PE手套上應做好標記，確保樣品、電泳槽、PE手套的標記是一致），小心地將凝膠放入相應標記的EB染膠盤中，蓋上蓋子染30min。其中，染膠盤放在EB暗房中，EB染液的配方為：100ml1×TAE+5ulEB染料。（注意：①配制EB染液和染膠時需戴上乳膠手套、PE手套，必要時可戴上口罩，染膠時動作要輕，防止濺起EB染液；②注意區分EB污染區與非污染區，防止EB污染區向非污染區擴散）凝膠成像：帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時的那個PE手套上（注意：撈膠時需小心防止凝膠斷裂、滑落，盡量把多余的EB染液甩干），將凝膠放入凝膠成像系統中，按照“Tanon凝膠成像系統操作規程”進行操作拍照。（注意：拍照時需嚴格區分EB污染區與非污染區，防止EB污染區污染電腦、鍵盤及鼠標），最后保存膠圖信息至規定的文件夾內，命名規則為：日期+姓名+部門+電泳目的。注意事項電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質，務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的EB暗房中操作，操作時戴上乳膠手套，必要時戴上PE手套和口罩建議電泳條件：12