第2節基因工程的基本操作程序第3章基因工程本節聚焦1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術和方法有哪些？轉基因抗蟲棉也稱為轉Bt基因抗蟲棉。它是將蘇云金芽孢桿菌的Bt基因導入到受體細胞(轉基因抗蟲棉的葉肉細胞)中。蘇云金芽孢桿菌的代謝過程中能產生一種Bt殺蟲蛋白，它對多種害蟲具有毒殺作用，作為生物農藥廣泛使用在蔬菜、瓜果等作物上。通過根癌農桿菌介導等方法將Bt基因轉入棉花植株的細胞中后，棉株體內也能合成Bt殺蟲蛋白。轉Bt基因抗蟲棉的殺蟲譜因Bt基因不同而存在差異。我國現有的轉基因抗蟲棉對棉鈴蟲、紅鈴蟲、卷葉蟲等鱗翅目的害蟲具有非常顯著的抗性。1997年，我國政府首次批準商業化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節支社會經濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？（1）轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是抗蟲基因（Bt基因）來源于蘇云金桿菌，Bt基因表達的蛋白質具有殺蟲活性。當害蟲食用轉基因抗蟲棉花的時候，同時攝入Bt基因表達產生的蛋白質，這種蛋白質在害蟲腸道內被激活，造成腸道穿孔，導致害蟲死亡。（2）培育轉基因抗蟲棉的步驟有目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。基因工程的基本操作程序（四個步驟）目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定前提保證關鍵核心有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可進行遺傳、表達和發揮作用載體進入受體細胞穩定表達，才能實現一種生物的基因在另一種生物中的轉化才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩定遺傳和正確表達一、目的基因的篩選與獲取1.目的基因的概念：（1）改變受體細胞性狀：如抗蟲性狀（2）獲得預期表達產物：如胰島素2.目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌）、人胰島素基因、人干擾素基因等3.轉基因抗蟲棉抗蟲的機制：蘇云金桿菌通過產生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白）破壞鱗翅目昆蟲的消化系統來殺死棉鈴蟲。4：獲取目的基因的方法（1）從基因文庫中獲取基因組文庫cDNA文庫（2）人工合成化學合成法逆轉錄法現在常用PCR技術獲取和擴增①PCR技術的原理：利用DNA雙鏈復制的原理，將基因的核苷酸序列不斷地加以復制，使其數量呈指數方式增加。②利用PCR技術擴增目的基因的前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。③PCR技術中引物的作用：引物的優劣直接關系到PCR的成功與否。引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，可以是一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復制的起始點，分別與DNA分子兩條模板鏈的3'端結合。PCR擴增后得到的產物同樣可以和引物結合。④PCR擴增的過程：三步一循環，即高溫變性、低溫復性、適溫延伸，一般設置30～35個循環。二、基因表達載體的構建1.構建基因表達載體的目的：這是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用2.基因表達載體的組成（1）目的基因：外源DNA分子中具有遺傳效應的片段（2）啟動子位置：基因的首端功能：是R聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA（3）終止子位置：基因的尾端功能：終止轉錄（4）標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因4.過程：一般用同一種限制酶切割載體和含目的基因的DNA片段，再用DNA連接酶把兩者連接成重組DNA基因表達載體構建模型思考：構建基因表達載體時應考慮哪些因素？1.啟動子的選擇要選擇強啟動子或組織特異性啟動子。啟動子有強有弱，選擇強啟動子可以增加轉錄活性，使基因產物量增多。如果想讓基因只在生物的某個組織表達，如只在植物種子中表達，就要選擇在種子中特異性表達的啟動子。2.特殊基因的添加有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。3.天然質粒不可直接作為運載體自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，不能直接作為運載體。在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。4.限制酶的選擇基因表達載體的構建過程中，最好用同種限制酶切割目的基因和載體，以獲得相同的黏性末端（或平末端），便于二者進行連接。但有時用兩種限制酶切割載體和目的基因，這樣可避免載體與載體之間、目的基因與目的基因之間的自身連接及目的基因與載體之間的反向連接。三、將目的基因導入受體細胞1.將目的基因導入受體細胞的方法：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為轉化。由于受體細胞的種類不同，選用的轉化方法也要根據具體情況而定。①將目的基因導入植物細胞：農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法。②將目的基因導入動物細胞：顯微注射法（受精卵）。③將目的基因導入微生物細胞：Ca2+處理法（感受態細胞）。2.受體細胞的選擇：①對于植物來說，受體細胞可以是受精卵或體細胞，因為植物細胞具有全能性。②對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，因為受精卵的全能性高，而高度分化的動物體細胞的全能性受到抑制。③大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細胞，但又有所不同。大腸桿菌為原核細胞，而酵母菌為真核細胞（具有多種細胞器），所以酵母菌在用于生產需要加工和分泌的蛋白質時比大腸桿菌有優勢花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。農桿菌轉化法：首先將目的基因插入農桿菌的Ti質粒的T-DNA上，構建基因表達載體；然后將基因表達載體轉入農桿菌（常用Ca2+處理成感受態細胞）。當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引含重組Ti質粒的農桿菌移向這些細胞，這時農桿菌中已經插入了目的基因的T-DNA,就可以進入植物細胞，并將目的基因插入植物細胞染色體的DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。由受體細胞培育成植株需要用到植物組織培養技術。農桿菌轉化法示意圖四、目的基因的檢測與鑒定對目的基因的檢測與鑒定分為分子水平和個體生物學水平兩個層次。1.分子水平的檢測①檢測目的基因是否插入轉基因生物的DNA上：DNA分子雜交技術。②檢測目的基因是否轉錄出mRNA：分子雜交技術。③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原－抗體雜交技術。2.個體生物學水平的鑒定①進行害蟲或病原體的接種實驗，以確定是否具有抗性以及抗性的程度。②檢測轉基因產品的功能活性是否與天然產品相同。目的基因是否插入mRNA蛋白質個體轉錄翻譯檢測檢測DNA分子雜交分子雜交抗原—抗體雜交抗蟲或抗病接種實驗現象現象現象現象是否出現雜交帶是否出現雜交帶是否出現雜交帶是否抗蟲或抗病鑒定分子水平檢測個體水平檢測思考：基因表達載體中已經具備標記基因，對受體細胞進行了篩選，為什么基因工程的第四步還要對目的基因進行檢測和鑒定？基因表達載體中的標記基因（如抗生素抗性基因）可以對受體細胞進行初次篩選：利用含抗生素的選擇培養基培養細胞，在這種培養基上能生長的是具有抗生素抗性的細胞，即導入了載體的細胞，這里的載體可能是基因表達載體，也可能是未插入目的基因的空載體。因此第四步需要對目的基因是否導入進行進一步的檢測。此外，雖然在選擇培養基上能生長的細胞中導入的是基因表達載體，但是仍然不知道目的基因插人的位置、方向等是否正確，能否正確表達，因此也需要在轉錄和翻譯及個體水平上進行檢測和鑒定。課堂練習1.如圖為某一重組質粒示意圖，下列敘述錯誤的是()A.用限制酶EcoRⅤ處理該質粒得到的分子共含有4個游離的磷酸基團B.同時用限制酶EcoRⅤ和BamHⅠ處理該質粒可得到3個雙鏈DNA片段C.在獲得目的基因時應該使用的限制酶是BamHⅠD.將受體細胞培養于含有卡那霉素的培養基中，可篩選出含有目的基因的細胞C2.基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟，是成功的關鍵，下列相關說法不正確的是()A.構建基因表達載體的目的包括使目的基因在受體細胞中能穩定存在且遺傳給下一代B.基因工程中使用的標記基因有許多種，有的標記基因是質粒上固有的，有的標記基因是人為加上去的C.一個基因表達載體一般包括目的基因、標記基因、起始密碼和終止密碼等結構D.基因表達載體中的復制原點是質粒DNA的復制的起點C3.基因和表達載體相連時既可以正向連接也可以反向連接。下圖甲、乙分別表示某質粒、含目的基因和酶切位點的DNA片段，構建基因表達載體時應用酶B和酶C進行切割，不應用酶A切割運載體和DNA片段，其原因不包括()A.防止目的基因和運載體發生反向連接

B.保證構建的重組質粒中含有標記基因C.防止目的基因或運載體重新自身環化

D.保證構建的重組質粒中含有啟動子D4.土壤農桿菌中含有Ti質粒，在侵染植物細胞的過程中，Ti質粒上的T-DNA片段可整合到