關于蛋白質工程制藥第1頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六2第一節蛋白質和多肽類藥物的分類一、多肽與蛋白質肽：2-50蛋白質：>50一般來說，大于20個氨基酸的多肽與蛋白質沒有明顯界限。第2頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六3二、多肽類藥物的分類與作用激素類加壓素、催產素、促皮質素及衍生物下丘腦-垂體肽激素消化道激素其他激素和活性肽細胞生長調節因子含有多肽成分的其他生化藥物第3頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六4三、蛋白質類藥物的分類與作用激素、細胞生長調節因子、血漿蛋白質、黏蛋白、膠原蛋白、堿性蛋白質、蛋白酶抑制劑、植物凝集素第4頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六5四、多肽和蛋白質類藥物的性質酸堿性解離等電點pI離子結合蛋白質形成的鹽在組織中廣泛存在；小離子與蛋白質特異性結合在組織和體液中起重要作用。第5頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六6膠體性質——電荷和水化膜應用：除雜變性三維結構破壞第6頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六7五、多肽和蛋白質類藥物的制備提取分離純化化學合成法蛋白質工程法第7頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六8提取分離純化原材料選擇預處理多肽和蛋白質藥物提取純化來源豐富、目的物含量高、成本低破碎、防止變性水溶液提取、有機溶劑提?。ㄈ芙舛取⒎肿哟笮⌒螤?、電性等）第8頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六9蛋白質工程法更換活性蛋白質的關鍵氨基酸殘基調整蛋白質分子的某些肽段、結構域或寡糖鏈，生成合適的糖型，產生新的功能功能互補的兩種基因工程藥物在基因水平上融合第9頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六10第二節、蛋白質分子設計與合成第10頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六11

蛋白質工程與蛋白質設計的術語是20世紀80年代初產生的。通過序列修飾改造改變蛋白質的性質并有應用價值的第一個報道引起了人們廣泛的關注，紛紛成立了蛋白質工程及設計的專門機構。盡管通過蛋白質工程研究已取得許多激動人心的成果，但是通過蛋白質設計產生一個結構確定、具有新的所希望性質的穩定的新蛋白質并不容易。第11頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六12公開性蛋白質研究組織

研究組織目標/特色ProteinStructureInitiative(美國NIH)十年內定出一萬個蛋白質的立體結構StructuralDiversityPilotProject(美國)Rockefeller大學主導之學術合作NMRParkProject(日本)利用NMR來決定老鼠蛋白質之結構ProteinStructureFactory(德國)醫學上重要蛋白質結構之高速分析StructuralBiologyIndustrialPlatform(歐洲)包含幾個主要製藥公司等16家公司所組成的聯盟第12頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六13蛋白質設計的目的和類型

為蛋白質工程提供指導性信息；探索蛋白質的折疊機理。蛋白質設計分為基于天然蛋白質結構的分子設計及全新蛋白質設計（蛋白質從頭設計）。第13頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六14蛋白質設計目前存在的問題設計的蛋白質與天然蛋白質比較，缺乏結構的獨特性及明顯的功能優越性。所有設計的蛋白質有正確的形貌、顯著的二級結構及合理的熱力學穩定性，但一般說來它們的三級結構的確定性較差。第14頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六15

從圖2-1(a)看出，天然蛋白質有確定主鏈結構及側鏈構象。圖2-1(b)所示的設計蛋白質的結構是一組低能構象的集合，缺乏結構獨特性。第15頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六16蛋白質設計是一門新興的研究領域，其本身在不斷地發展，其內容也在不斷地更新。蛋白質設計及結構與功能關系研究的必要性。蛋白質設計是多學科的交叉領域。蛋白質設計在許多方面取得的顯著進展。第16頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六17基于天然蛋白質結構的分子設計

一、概述蛋白質結構與功能的關系的認識對蛋白質設計是至關重要的，蛋白質的結構涉及一級結構(序列)及三維結構。即使蛋白質的三維結構是已知的，選擇一個合適的突變體仍是困難的，這說明蛋白質設計任務的艱巨性，它涉及多種學科的配合，如計算機模擬專家、X射線晶體學家、蛋白質化學家、生物技術專家等的合作與配合。第17頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六18計算機模擬

基因構建突變蛋白質產品功能分析蛋白質設計循環第18頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六19蛋白質分子設計大致涉及的幾個重要方面在蛋白質設計開始之前，要對所要求的活性進行篩選。測定它們的序列、三維結構、穩定性、催化活性等。第19頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六20專一性突變產物是蛋白質設計成敗的關鍵。一些新技術，如PCR及自動化技術的發展使各種類型的基因工程變得快速、容易。計算機模擬技術在蛋白質設計循環中占有重要位置。建立蛋白質三維結構模型，確立突變位點或區域以及預測突變后的蛋白質的結構與功能對蛋白質工程是至關重要的。在明確突變位點或蛋白質序列應改變的區域后，可以進行定位突變，但要得到具有預期結構與功能的蛋白質是不容易的，可能需要經過幾輪的循環。第20頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六21第21頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六22設計目標及解決辦法蛋白質結構與功能的關系對于蛋白質工程及蛋白質分子設計都是至關重要的。如果我們想改變蛋白質的性質，必須改變蛋白質的序列。Hartley等于1986年完成了一個我們所要的有關蛋白質重要性質設計目標及解決辦法表，該表至今仍有參考價值。第22頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六23設計目標解決辦法熱穩定性對氧化的穩定性對重金屬的穩定性pH穩定性提高酶學性質引入二硫橋增加內氫鍵數目改善內疏水堆積增加表面鹽橋把Cys轉換為Ala或Ser把Met轉換為Gln、Val、Ile或Leu把Trp轉換為Phe或Tyr把Cys轉換為Ala或Ser把Met轉換為Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替換表面荷電基團His、Cys以及Tyr的置換內離子對的置換專一性的改變增加逆轉數(turnovernumber)改變酸堿度蛋白質設計的目標及解決辦法第23頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六24蛋白質突變體的設計涉及如下3個步驟。（1）從天然蛋白質的三維結構出發(實驗測定或預測)，利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的氨基酸。這是非常關鍵的步驟，一般應注意如下問題。

a．應確定對蛋白質折疊敏感的區域，這些區域包括帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區等。

b．應確定對功能非常重要的位置，這些可以從結構與功能關系、生物化學或蛋白質工程實驗及結構上的考慮。第24頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六25

c．應該考察剩余位置對所希望改變的影響。

d．當進行互換或插入刪除殘基時應考慮它們對結構特征的影響，如疏水堆積、側鏈取向、氫鍵、鹽橋等。同時也要考慮它們對蛋白質功能的影響。互換或插入/刪除區域一般都在外環。有如下一些假設：氨基酸側鏈的改變不會影響該主鏈折疊的改變，插入/刪除某些部分不會影響表面區域，側鏈交換遵守蛋白質結構保守原則。（2）利用能量優化及蛋白質動力學方法預測修飾后的蛋白質結構。（3）預測的結構與原始的蛋白質結構比較，利用蛋白質結構-功能或結構-穩定性相關知識及理論計算預測新蛋白質可能具有的性質。在上述設計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經分離、純化及表征后得到所要求的新的蛋白質。第25頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六26計算機蛋白質設計只是有效實驗設計的一種方法。它不能替代實驗，正像蛋白質結構預測不能替代蛋白質結構測定一樣。如果一個科學家設計一種具有新的催化性質的酶，他必須了解催化過程及機理；了解蛋白質的結構化學、生物化學方面的知識。因此蛋白質設計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密結合。第26頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六27內核假設所謂內核是指蛋白質在進化中保守的內部區域。在大多數情況，內核由氫鍵連接的二級結構單元組成。假定蛋白質獨特的折疊形式主要由蛋白質內核中殘基的相互作用所決定。

二、蛋白質設計原理

第27頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六28內部密堆積，并且沒有重疊。

由兩個因素造成的。分子是從內部排出的，這是總疏水效應的一部分；由原子間的倫敦色散力所引起的，是由于短吸引力的優化。第28頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六29氫鍵都是最大滿足的蛋白質的氫鍵形成涉及一個交換反應，溶劑鍵被蛋白質鍵所替代。隨著溶劑鍵的斷裂所帶來的能量損失是由折疊狀態的重組以及可能釋放一個結合的水分子而引起的熵的增益所彌補。第29頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六30疏水及親水基團需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面。在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。對于金屬蛋白，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。最優的氨基酸側鏈幾何排列結構及功能的專一性。第30頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六31三、蛋白質設計中的結構－功能關系研究蛋白質結構－功能關系的重要性

蛋白質的序列、三維結構，熱力學及功能性質之間的關系是目前廣泛關注的熱點。它對于蛋白質工程及蛋白質設計都是非常重要的。對蛋白質結構與功能的認識過程始于蛋白質中重要功能殘基及蛋白質與其他分子相互作用的確定。第31頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六32定位突變在蛋白質結構與功能關系研究中的作用

通過定位突變替換單獨的氨基酸殘基是分析功能殘基的有力工具。選擇突變殘基，最重要的信息來自結構特征。因此如果蛋白質的立體結構是未知的，則突變功能殘基的研究帶有不確定性。第32頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六33定位突變種類插入一個或多個氨基酸殘基；刪除一個或多個氨基酸殘基；替換或取代一個或多個氨基酸殘基。最大量的定位突變是在體外利用重組DNA技術或PCR方法。第33頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六34突變蛋白質結構的評估溶解性熱力學分析Ｘ射線晶體學及ＮＭＲ譜園二色譜方法單克隆抗體探測構象變化第34頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六35熱力學分析可以用于測量突變蛋白質的熱穩定性及化學變化自由能，并可作為構象整體性的檢測。

X射線晶體學及NMR譜可以直接提供突變蛋白的高分辨率結構及評估結構整體性。圓二色譜方法是可用于分析突變體結構的另一生物物理方法。第35頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六36蛋白質中功能殘基的鑒定根據已知結構信息確定功能殘基突變法鑒定功能殘基利用蛋白質同源性鑒定功能殘基第36頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六37不同動物胰島素在A鏈中的差異

羧基端第37頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六38四、天然蛋白質的剪裁

什么是分子剪裁：分子剪裁是指在對天然蛋白質的改造中替換1個肽段或一個結構域。將小鼠單克隆抗體分子重鏈的互補決定簇用基因操作方法插到人的抗體分子的相應部位上，使得小鼠單抗分子所具有的抗原結合專一性轉移到人的抗體分子上。這項實驗有重要的醫學價值。第38頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六39結構域由α螺旋、β折疊等二級結構單位按一定的拓撲學規則構成的三維結構實體。構域是蛋白質分子中一種基本的結構單位，結構域拼接是通過基因操作把位于兩種不同蛋白質上的幾個結構域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白的性質。

五、結構域的拼接第39頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六40第40頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六41六、結構與功能的容忍度蛋白質結構及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結構與功能關系有一定的穩健度。第41頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六42Fersht等替換了Barnase的所有內核殘基。結果表明23％的突變體保留了酶的活性。Mathews及其合作者在溶菌酶內核中替換多至10個殘基。實驗證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協同折疊。第42頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六43全新蛋白質設計一、特征全新蛋白質設計是另一類蛋白質工程，合成具有特異結構與功能的新蛋白質。根據所希望的結構及功能設計蛋白質或多肽的氨基酸序列。第43頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六44

全新蛋白質設計是根據所希望的結構及功能設計序列，稱反折疊研究。蛋白質的功能是直接與它的三維結構相關的，通過序列的改變來操縱結構提供功能的多樣性?；谔烊坏鞍踪|結構改造的蛋白質工程可以優化蛋白質的活性，改善它們的藥效動力學性質。而全新蛋白設計是另一類蛋白質工程，它合成具有新奇的結構與功能的新蛋白質。第44頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六45二、蛋白質的全新設計內容蛋白質結構的從頭設計蛋白質功能的從頭設計第45頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六46三、蛋白質結構的從頭設計１．二級結構模塊單元的自組裝２．配體誘導組裝３．通過共價交叉連接實現肽的自組裝４．在合成模板上肽的組裝５．線性多肽折疊為球狀結構６．基于組合庫的全新蛋白質設計第46頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六47設計一個新奇的蛋白質結構的中心問題是設計一個具有穩定及獨特的三維結構的序列。要達到這個目標需要克服的基本障礙是線性聚合鏈的構象熵。例如，如果在具有100個殘基的蛋白質中每個殘基采取10個可能構象中的一個構象，則這條鏈折疊成為確定的三維構象所消耗的熵是568.48kJ／mol。這個數字代表不合適的自由能的真實的量。因此要實現正確的折疊必須借助于許多合適的相互作用，要使一個序列能折疊為確定的三維結構，設計的相互作用能必須超過構象熵。第47頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六48可以采用不同的策略達到這個目標。最主要是使相互作用的強度與數目達到最大。另一個策略是通過共價交叉連接減小折疊的構象熵。根據第一原理設計一個蛋白質，我們必須依賴于分析已知結構的天然蛋白質中的二級結構單元，例如螺旋、β折疊片、(環)以及轉折，得到一些結構知識，這些知識涉及氨基酸形成二級結構的傾向性等。十多年來，科學家對螺旋已有很好的認識，近幾年的重點在于二級結構在三維空間形成的獨特的構象通過長程相互作用可控形成超二級結構。我們可以有把握地設計并合成螺旋束，β折疊片以及ββα模塊，它們的形成規律比較清楚，成功的概率也比較高。蛋白質中不同層次的結構組織見圖2-6。第48頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六49第49頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六50分析己知結構的蛋白質，可以認為復雜的三級折疊和四級結合可以分解為有數的二級結構單元，例如螺旋、串、轉角，它們通過LOOP連接為三級結構。特殊折疊的穩定性是由一定距離殘基間鍵相互作用決定的。全新蛋白質設計要求很好地認識蛋白質結構及穩定性的規律。在了解殘基形成二級結構單元的傾向性后，要安排殘基的最大的疏水相互作用形成一個緊密的疏水內核。離子相互作用及氫鍵可以進一步用于穩定蛋白質的結構。另外一種途徑是根據主鏈的構象限制設計二級結構。第50頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六51

1．二級結構模塊單元的自組裝設計新的蛋白質結構的最簡單、最直接的策略是合成單一二級結構單元(α螺旋或折疊股)作為多肽鏈的片段的模塊途徑，然后復制這些二級結構片段并把它們連接為整個蛋白質結構。通常，這些二級結構是兩親性的。疏水表面埋藏在內核形成緊密的蛋白質結構中，如圖2-7所示。第51頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六52

2．配體誘導組裝全新蛋白質設計的第二個策略是使用一個配體(典型的是一個金屬離子)誘導模塊蛋白片段的組裝，如圖2-10所示。一個配位結合位點設計在結構中幾個相互作用片段的界面處。如果這個位點對配體有很高的親和力，則結合配體的合適的自由能將充分克服熵消耗并驅動肽自組裝。第52頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六533．通過共價交叉連接實現肽的自組裝設計全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構象熵。當幾個沒有連接的肽鏈進行自組裝時，熵勢壘是比較難以克服的。通過共價交叉連接可以減少構象熵。因此共價連接他們的預組織肽是直接形成所希望結構的有力途徑，如圖2-13所示。第53頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六54

4．在合成模板上肽的組裝

Mutter及其合作者發展了一種模板組裝合成蛋白(TASPs)方法。他們不是使用天然蛋白中的turn和loops連接二級結構單元，而是使用圖2-16中所顯示的人工模板。同天然線性蛋白質不同。螺旋和折疊股在一個特殊折疊過程有一個正確的相對取向。TASP分子的螺旋和股通過模板結構導向形成所希望的構象。第54頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六55

5．線性多肽折疊為球狀結構

不用模板或交叉連接而通過線性多肽折疊形成球形的確定的三維結構是全新蛋白質設計追求的目標之一。把一個線性肽折疊形成獨特的三維結構的主要障礙是構象熵，這需要精心設計一系列的相互作用才能穩定結構。這方而工作已取得重大進展。第55頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六56

6．基于組合庫的全新蛋白質設計

蛋白質組學是目前備受關注的新領域，它包括天然蛋白質的多樣性、相互作用、結構以及功能。它回答的問題是“什么是天然存在的”。組合庫方法要回答的問題是“什么是可能的”。要問答這個問題是要構筑大的全新蛋白質庫。比較庫中的全新蛋白質與自然進化選擇的蛋白質，可以得到很多有用的信息。第56頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六57

所有可能的氨基酸序列是一個天文數字，例如一個含有100個殘基的序列可能有20100種。但是實際能形成獨特三維結構的序列僅占序列空間的很小部分。

組合庫的構筑既要顧及序列的多樣性又要利用合理設計大大減少序列的數目。

第57頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六58組合庫設計的一個核心問題是埋藏疏水部分。一個常用的方法是基于極性（P）和非極性(N)氨基酸的“二元模式”。“二元模式”一方面要有利于形成二級結構，另一方面又要埋藏疏水殘基。二元模式可用于二級結構兩親片段，一面完全是極性殘基，另一面完全是非極性殘基。第58頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六59組合庫的設計中要考慮優化疏水核，通過篩選發現最優的堆積相互作用。主要使用兩種篩選方法：第一種是使用一維1H-NMR譜；第二種方法是使用電噴霧質譜(ES-MS)觀察H-D交換動力學。除了考慮疏水核堆積外還要考慮優化二級結構單元間的界面。近年來發展了一些計算機輔助設計方法，在開始實驗之前先進行計算機篩選。一般分為兩步，第一步建立側鏈的旋轉構象庫(rotemer)；第二次把Rotomer庫作為輸入，計算低能序列組合的可能性。第59頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六60三、蛋白質功能的全新設計蛋白質設計的目標是產生既能折疊為預想的結構又具有有趣和有用的功能。功能設計主要涉及鍵合及催化。為達到這些目的可以采用兩條不同的途徑：反向實現蛋白質與工程底物的契合，改變功能；從頭設計功能蛋白質。第60頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六61計算蛋白質設計蛋白質設計是一個理論與實驗之間的循環。這個循環已經在蛋白質的合理設計中得到了許多重要進展。計算蛋白質設計包括能量表達、能量優化、側鏈構象的離散化、殘基分類(內核、表面、邊界)、功能位點設計、專一性、穩定性及序列空間的穩健性預測等方面內容。第61頁，共81頁，2022年，5月20日，4點43分，星期六62一、抗病毒藥β-干擾素穩定性的改進-SH17形成二聚體失去活性-OH17氨基酸取代×二聚體二硫鍵第三節、蛋白質工程在制藥中的應用第62頁，共81