ICS11.220B41 DB45廣西壯族自治區地方標準DB45/T1681-2018活禽批發市場禽流感監測技術規范Technicalspecificationforavianinfluenzasurveillanceinlivepoultrywholesalemarkets20182018-03-252018-04-25廣西壯族自治區質量技術監督局發布DD4/621目次前言 II1范圍 12規范性引用文件 13術語和定義 14信息收集 35樣品采集 36樣品實驗室檢測 57檢測結果處理 5附錄A（規范性附錄）溶液配置 7附錄B（資料性附錄）采樣數量 8附錄C（資料性附錄）抽樣數量 10附錄D（資料性附錄）禽流感采樣記錄 12IIIIIDD4/621DD4/621前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由廣西壯族自治區水產畜牧獸醫局提出。本標準并廣西畜牧業標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心。本標準主要起草人：鄒聯斌、施開創、莫勝蘭、屈素潔、尹彥文、張步嫻、粟艷瓊、李軍。IIIIIIDD4/621DD4/621活禽批發市場禽流感監測技術規范1范圍本標準適用于廣西境內活禽批發市場中禽流感的緊急監測和日常監測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18635動物防疫基本術語GB/T18936高致病性禽流感診斷技術NY764高致病性禽流感疫情判定和撲滅技術規范NY/T765高致病性禽流感樣品采集、保存及運輸技術規范NY/T770高致病性禽流感監測技術規范NY/T772禽流感病毒RT-PCR檢測方法NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法NY/T772禽流感病毒RT-PCR檢測方法NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法國辦函〔2005〕51號《國家突發重大動物疫情應急預案》國辦發〔2004〕12號《全國高致病性禽流感應急預案》農牧發〔1999〕18號《動物疫情報告管理辦法》農醫發〔2013〕13號《農業部關于印發<動物H7N9禽流感緊急監測方案>和轉發<動物H7N9禽流感應急處置指南（試行）>的通知》農醫發〔2014〕22號《農業部關于印發<全國家禽H7N9流感剔除計劃>的通知》3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1活禽批發市場livebirdswholesalemarket從事活的雞、鴨、鵝及其他禽類批發交易的市場。3.2禽流感avianinfluenzaAI正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類傳染性疾病。13.3監測surveillance對某種疫病的發生、流行、分布及相關因素進行系統的長時間的觀察與檢測，以把握該生情況和發展趨勢。3.4流行病學單元epidemiologyunit具有明確的流行病學關系、暴露于某一病原的可能性大體相同的動物或動物群，如處于同一環境（如同一個活禽批發市場、同一個攤位）或飼養管理方式相同的動物。流行病學單元可以是單個個體，也可以是動物群。流行病學單元在流行病學抽樣調查和監測中，又稱為抽樣單元。3.5population處于同一環境內、相同生產階段或相同生物安全管理措施下，面臨相同感染風險的同一種動物流行病學單元的總體。3.6樣本sample目標群的一部分，由按照一定程序從目標群中抽取的那部分個體或抽樣單元組成。3.73.7抽樣sampling又稱取樣，從一個研究的群體中選出一部分個體，作為整個群體的代表。3.8簡單隨機抽樣simplerandomsampling從N個單位中任意抽取n單位作為使每個可能的樣本被抽中的概率相等的抽樣方式3.9兩階段抽樣two-stagesampling對區域面積大且樣本單元復雜或不清楚的動物疫病抽樣調查所采取的抽樣技術。第一步抽取流行病學單元；第二步從流行病學單元內抽取個體動物。3.10主觀抽樣purposivesampling又稱目的抽樣，研究者依據自己的專業知識和經驗，以及對調查群體的了解，有意識的研究對象。3.11便利抽樣conveniencesampling研究者根據實際情況，為方便開展工作，僅選擇那些離得最近的、最容易得到的調查對象。23.12靶向抽樣targetedsampling根據一個或多個特征對目標群進行分層，這些特征通常被認為是與疾病發生概率有聯系的。抽樣可能包含的樣本僅是從發現疾病概率最高的層次得到的。3.13分層隨機抽樣stratifiedrandomsampling又稱類型隨機抽樣，將總體各單位按一定標準分成各種類型（或層）；然后根據各類型單位數與總體單位數的比例確定從各類型中抽取樣本單位的數量最后隨機原則從各類型中抽取3.14置信水平levelofconfidence所實施的監測能夠從某一假定存在感染的群體中檢出感染的概率。3.15預期流行率expectedprevalancerate預計某個特定時間某特定區域規定動物疫病病例數或發病數與動物群體個體總數的平均值之比可分為群間預期流行率和群內預期流行率。4信息收集活禽批發市場的信息包括活禽批發市場的信息包括名稱地址地攤種來源成要銷往地等。樣品的信息包括樣品編種攤攤主姓名系方式種來源群體數量等。5樣品采集采樣前準備器具和試劑采樣器材冷藏保溫箱酒精棉一次性注射器2mL離離心管盒菌醫用（塑料桿棉簽為宜冰袋、不干膠標簽、簽字筆、記號筆、采樣登記表等。5.1.1.2保存液在2mL的離心管中加入1mL～1.5mL的樣品保存液，-20℃保存備用。制備方法見A中的A.25.1.1.3人員防護用品口罩、一次性手套、防護服、防護帽、水鞋等。3采集樣品種類血清樣品、咽喉/泄殖腔拭子、環境樣品。5.2.2樣品數量活禽批發市場的監測根據監測目的的不同常采取兩種或兩種以上的方法混合進行抽樣。計算樣本量時，常使用95%的置信水平。抽樣方式分層+兩階段抽樣法在經費、人員和時間較充足，并且對該活禽批發市場的背景比較清楚的情況下，宜用此法。抽樣方法為：BCC.1。5.2.3.2分層抽樣+便利抽樣按設定好了每個活禽批發市場的采樣數量和每個攤位的采樣數量采樣。抽樣方法為：按照設定的抽樣數量，在攤位里按便利抽樣法抽取禽只采樣。5.2.3.3靶向抽樣+主觀抽樣此法適用于緊急監測、無疫證明和發現疫病。抽樣方法為：——靶向抽樣法，按照禽流感的流行病學特點、疫情信息等，選擇來自疫區或高發區、易感或感染率高的禽群；個糞便/籠具拭子、520/泄殖腔拭子和5樣品采集方法血清樣品采集采用翅靜脈采血，每只禽采取血樣1.5mL～2mL，經離心或自然放置析出血清后，將血清移到離心管，蓋緊封好口，貼好標簽。血清與棉拭子須一一對應，并填寫采樣單。咽喉/泄殖腔拭子采集將采集的咽喉/泄殖腔拭子放入同一個樣品保存液的離心管或分開裝，采集方法為：——取咽喉拭子時要確保將拭子深入喉頭口及上顎來回刮3～5次取咽喉分泌液；4——1.5cm～2.0cm轉一圈并沾取少量糞便。5.2.4.3環境樣品采集以擦拭涂抹的方式重點采集市場攤位的食槽、飲水槽、地面、下水池、家禽及鳥類糞便、籠具表面或用具表面等環境樣品。采樣時采樣拭子不得與禽類接觸。樣品信息收集樣品信息參見附錄D中的表D.1，采取查看禽群，詢問市場管理人員和攤主、查驗運輸登記記錄和產地檢疫合格證明等方式收集樣品信息。采樣單應用簽字筆逐項填寫，樣品標簽和離心管應用防水記號筆做標記。樣品保存和運輸樣品應置于冷藏保溫箱中保存，保溫容器應密封，防止滲漏。樣品運輸時24h到冰袋冷藏運輸。如24作冷凍處理，再用冰袋冷藏運輸。樣品到達實驗室后，如不能立即檢測，應冷凍（以-20℃或以下為宜）保存。避免反復6樣品實驗室檢測6.1實驗器材及試劑應符合GB/T18936NY/T7726.2血清樣品檢測血凝抑制試驗（HG/86。根據監測目的,選擇同亞型的禽流感抗原6.3拭子樣品檢測檢測按照NY/T772的要求操作，先用禽流感通用引物檢測，結果為陽性時，再進行鑒定。6.4判定標準血清抗體GB/T18936血凝抑制試驗（HI）檢測，抗體效價≥5log2，結果判定為陽性。NY/T7727檢測結果處理血清學檢測結果陽性已經免疫過某亞型禽流感疫苗的，血清抗體陽性，用作免疫效果評估。血清抗體經感染過某亞型屬2014〕22進行處理。5病原學檢測陽性低致病性禽流感，可根據監測目的進行流行病學調查。200412號和NY764的要求進行處置。監測結果由各級動物疫病預防控制機構存檔或備案。動物疫病預防控制機構應定期對監測結果進行分析、匯總和報告。66附錄A（規范性附錄）溶液配置A.1PBS配制將試劑按次序加入定量器中,加適量蒸餾水溶解后,再定容至1000mL,調pH至7.4,高壓消毒滅菌112kPa20min，冷卻后，保存于4℃冰箱中備用。PBS配制試劑見表A.1表A.1PBS配制試劑試劑用量（g）NaCl8.0KHPO0.2NaHPO·122.9KCl0.2將抗生素溶解到500將抗生素溶解到500mLPBSpH值至終濃度為10%的甘油或終濃為5%的小牛血清。將配制好的保存液分裝到2mL的離心管中，每管1mL～1.5mL，-20℃保存備用。樣品保存液配制見表A.2。表A.2樣品保存液配制7試劑用量青霉素（80/0.48g）2.6g鏈霉素（100/1g）5.0g慶大霉素（8/2mL）2.6mL制霉菌素（0.5萬單位/片）B5片附錄B（資料性附錄）采樣數量1采樣數量表采樣數量表見表B.1。表B.1在置信水平為95%的條件下、不同估計陽性攤位百分率下的攤位抽取數量抽樣數陽性攤位百分率/%攤位數50403025201510543211045678910101010101020457810121619202020203046891114192628293030405681012152131343739405056810121623353944485060568101317243843495660705681013172441475462698056910131725434958697990569101318254552617487100569111318264654647996150569111418275060759713120056911141928536481108158300569111419295668881221954005691114192957709112921750056911141929587294134233600569111419295873951372447005691114192959739614025380056911141929597497142260900569111419305974981432651000569111419306074981452691500569111419306075100148283200056911141930617610115029030005691114193061761021522984000569111419306177102153302500056911141930617710315430460005691114193061771031543067000569111419306177103154307800056911142030617710315530888表B.195%的條件下、不同估計陽性攤位百分率下的攤位抽取數量（續）抽樣數陽性攤位百分率/%攤位數5040302520151054321900056911142030617710315530810000569111420306177103155309>1000056911142030617710315530999附錄C（資料性附錄）抽樣數量1不同流行率下的抽樣數量不同流行率下的抽樣數量見表C.1。表C.1在95100%的條件下、不同流行率下的抽樣數量采樣量群的數量流行率%50403025201510543210.50.12045781012151920202020202030457911141826272930303030404689111520313437394040405046810121522343843485050506046810121623374248556060607046810121623404553626970708046810121624414857677880809046810121724435060738790901004691013172544526377951001001504691113172648587294129147150200469111318275161781051551902003004691113182753658411718925930040046911131827546787124210310400500469111318285568891282243494996004691113182856699113123537859670046911131828567092134243402690800469111318285670931352494217819004691113182857709313725443786810004691113182857719413825845095015004691113182857729514127049312962000469111318285872961432775171552300046911131828587297145284542189440004691113182858739714628755