低溫沼氣產氣量及效率提升綜合方案實驗目的、原理及任務1.1實驗目的（1） 以沼氣發酵原理為基礎，通過在厭氧發酵過程中研究微生物、相關酶活性的變化過程以及與沼氣產生之間的關系及動力學模型，以及非產甲烷菌和產甲烷菌在整個沼氣發酵過程中的作用和功能，分析物質轉化及沼氣形成特點和整個反應過程鏈的促進作用和反饋抑制特點，分析沼氣產生過程的生化過程特點，其物質降解轉化及產生沼氣的過程與能量代謝流的關系及其平衡關系。（2） 研制基于高效生產沼氣的微生物和酶催化劑，完善催化劑成熟的制備工藝，使沼氣產量提高，研究高效產沼氣的生化反應體系有效控制模式及調控優化技術措施，開發出可用于沼氣生產的基于專用微生物菌群和生物酶的高效催化劑制品。（3） 通過添加發酵促進劑，篩選出能提高沼氣產量的外源添加物，篩選出各外源添加物后進行正交及驗證試驗，結合考慮促氣效果及經濟成本，得出最優組合，最后將該組合在沼氣池中進行效果驗證。1.2實驗原理（1） 沼氣工程是一個復雜的生化過程，需要多種產沼氣微生物參與，多種生物酶促進了生物質向沼氣的轉化。大體可分為三個階段:水解一產酸一產甲烷。水解階段是在微生物的作用下把不溶于水的固形有機物轉變成可溶于水的物質。許多微生物能分泌各種胞外酶，在胞外酶的作用下，固形有機物被水解成相對分子質量較小的可溶性物質。如纖維素酶、淀粉酶、蛋白質酶和脂肪酶等，通過對有機物質進行體外酶解，將多糖水解成單糖或二糖，蛋白質分解成多肽和氨基酸，脂肪分解成甘油和脂肪。產酸階段是指第一階段產生的各種可溶性物質（單糖、氨基酸、脂肪酸）進入細胞內后，在各種細菌胞內酶作用下繼續分解代謝轉化成低分子物質，如丁酸、丙酸、乙酸以及醇、酮、醛等簡單的有機物質。最主要的產物是乙酸，也有氫（H2）、二氧化碳（CO2）、氨（NH3）和少量的其他產物。產甲烷階段由產甲烷菌將前一階段產生的低分子化合物如乙酸、甲酸、氫和二氧化碳還原轉變為甲烷。中間產物乙酸、氫氣等對產甲烷有雙重作用，在其高于一定濃度時，抑制產甲烷。若能夠很快被消耗，維持低的濃度時，對產甲烷有促進作用。在沼氣厭氧發酵系統中，非產甲烷菌能為產甲烷菌提供營養，而且創造生活條件；產甲烷菌則將非產甲烷菌的代謝終產物H2/CO2及乙酸加以利用，產生甲烷。當前沼氣工程中生物質轉化不充分，產氣量不足，為了增加沼氣的產氣量，提高非產甲烷菌對有機物的水解速度比產甲烷菌的繼續富集更重要，特別是對纖維素的分解速度，在沼氣自然發酵過程中，微生物對纖維素的分解較慢，應用產纖維素酶的菌株可以提高生物質的利用率，使畜禽糞便得到充分水解，提高沼氣的產氣量，實驗結果表明接種低溫馴化微生物對提高沼氣產量起著決定性作用。（2） 目前常見的沼氣高效催化劑產品主要是由一些耐低溫纖維素降解菌和耐低溫發酵細菌組成，但其在低溫條件下應用效果有限。這與沼氣發酵過程有關，在沼氣發酵過程中共有四大類群微生物參與，分別是：水解發酵菌群、產氫產乙酸菌群、同型產乙酸菌群和產甲烷菌群，他們之間相互依賴又相互制約，共同構成了一條厭氧消化生物鏈。由于產甲烷菌利用氫氣、二氧化碳和乙酸等簡單有機物質生成甲烷，其倍增時間長，因此一般認為產甲烷菌合成甲烷的階段為沼氣發酵的限速步驟。產甲烷菌群相對于其它菌群對低溫更為敏感，所以，在北方地區低溫沼氣發酵系統中常常出現揮發酸積累甚至酸化的現象。如果能選育出在低溫條件下具有較高活性的產甲烷菌株，優化組配成產甲烷菌劑投加到沼氣發酵系統中，進行生物強化沼氣發酵過程，理論上就可以提高低溫條件下產沼氣效率。但產甲烷菌傳代和培養條件苛刻，需嚴格厭氧，且倍增時間長，這給低溫沼氣發酵菌劑的開發帶來了很大的困難。盡管產甲烷菌的活性對于沼氣發酵起著決定性作用，但如果忽略其它相關微生物菌群的作用也不能達到理想的效果，因此，應從提高產甲烷菌活性、優化其它不產甲烷菌群，從整體上對沼氣發酵微生物生態系統進行調控，實現沼氣發酵過程的高效轉化。（3）為了有效激活低溫環境下沼氣發酵系統中各微生物的生理活性，國內外對外源促進劑進行了系統研究。沼氣發酵促進劑即指從產沼氣發酵系統以外加人的以期提高沼氣產量、甲烷含量的物質，如酶、營養物質、代謝促進物、吸附劑、螯合劑等。眾多文獻表明，向產沼氣系統中加入促進劑，可以促進系統微生物的代謝，提高系統生物量，改善厭氧發酵各階段的作用效率，從而更有效地利用底物，最終提高沼氣產量。尤其在低溫環境下，促進劑可激活系統微生物的代謝活性，解除低溫抑制，提高產氣量。當前對沼氣發酵促進劑的產氣影響研究主要集中在尋求有促氣作用的各種外源促進劑及不同添加物的促氣效果等方面，而對于不同添加物之間的復合作用以及提高產氣的具體機制研究還不多。因此，可加強低溫下促進劑的激活機理、低溫高效促進劑開發、促進劑投配調控方法等方面的研究，最大程度地提高低溫沼氣產效率。1.3實驗任務（1） 在成熟的沼氣發酵池中分離出主要優勢微生物，并篩選出促進產生沼氣的纖維分解、半纖維分解、淀粉分解及一些特殊的產氫、產乙酸有益微生物菌群。（2） 在厭氧發酵過程中研究微生物、相關酶活性的變化過程以及與沼氣產生之間的關系及動力學模型，研究非產甲烷菌和產甲烷菌在整個沼氣發酵過程中的作用和功能，分析物質轉化及沼氣形成特點，以及整個反應過程鏈的促進作用和反饋抑制特點。分析沼氣產生過程的生化過程特點，其物質降解轉化及產生沼氣的過程與能量代謝流的關系及其平衡關系，為進一步生化過程控制提供理論依據。（3） 利用現代發酵工程技術對沼氣產特有發酵菌種進行馴化及培養，以高效低溫纖維分解、半纖維分解、淀粉分解及一些特殊的產氫、產乙酸有益微生物菌群為基礎，添加保護劑和穩定劑等助劑，研制基于高效生產沼氣的微生物和酶催化劑，完善催化劑成熟的制備工藝，使沼氣產量提高。（4） 通過添加發酵促進劑，篩選出能提高沼氣產量的外源添加物，而后進行正交及驗證試驗，結合考慮促氣效果及經濟成本，得出最優組合，最后將該組合在沼氣池中進行效果驗證。（5） 研究高效產沼氣的生化反應體系有效控制模式及調控優化技術措施。根據重慶白市驛板鴨食品有限責任公司現有沼氣工程運行特點，制定應用技術方案，實現工程化應用，確定沼氣催化劑最佳使用比例量和時間間隔，以及物料添加量，溶氧量、pH和氧化還原電位等，制定成熟應用技術措施方案。文獻查閱及資料分析、實驗優先級2.1高效催化劑2.1.1、 纖維素酶產生菌2.1.2、 產乙酸菌2.1.2、 產甲烷復合菌劑一一中科院成都生物研究所開發的產甲烷復合菌劑，活菌數達到2X107個/克。投加該菌劑后，在常溫條件下，與普通污泥對比，啟動時間至少縮短1/2，甲烷濃度相當，沼氣總產氣量可以提高25%以上。2.1.3、 產氫菌一一產氫菌對沼氣發酵的生物強化作用可提高沼氣總產量和甲烷總產量，累積甲烷產量增加11%。2.2發酵促進劑2.2.1、酶類一一呂淑霞和陳祖潔的研究表明：發酵物中（以TS計）添加3g.kg-1固體纖維素酶，甲烷產率可提高52.1%；而添加30U.kg-1液體纖維素酶，甲烷產率的提高幅度可高達88.8%ORademacher等人也添加多種酶用來提高厭氧污泥消化速率。Scheidat等人在初沉池污泥中加人蛋白酶、糖化酶和脂肪酶，發現在39°C和55°C下均能明顯地提高水解作用。張無敵等人采用3種不同配方的水解酶進行試驗，結果表明配方l和2均可提高沼氣產量，分別為26.8l%和13.75%。2.2.2、 啤酒糟一一啤酒糟中含有酵母、微量元素等促進發酵微生物生長代謝的因子，另外還含有粗蛋白、淀粉、糖分等有機營養物質，在生長因子和有機營養物質的共同作用下可使產氣量提高，并且在發酵前期能加速糞便中可溶性物質的降解，從而使得前期啤酒糟的促進作用更大，可考慮將其與加速產甲烷過程的添加物同時使用從而實現在發酵全過程均能提高產氣量。2.2.3、 微量元素——添加一定的微量元素如銘、銅、鎳、鋅、鐵、硒等能夠促進沼氣發酵微生物尤其是產甲烷菌菌群的活性，從而提高產氣量。Geeta等人的研究表明2.5mg.L-1的Ni能最高增加54%的產氣量。Speece等人發現，添加Ni時每克VSS的底物（乙酸）利用率可達10g.g-1d-1，而不加Ni時只有2-4.6g.g-1d-1，同時添加Ni和酵母提取物的底物（乙酸）可達l2-15g乙酸.g-1d-1。Sigh和Singh的研究表明，奶牛糞中添加Cu（N03）。亦能促進產氣，在48d的停留時間內產氣率比對照的0.036m-3.kg-1提高22.22%。同時，將各種微量元素組合應用也有較好的效果。李亞新和董春娟分別以醋酸鈣和乙醇為基質，得出激活產甲烷菌的最佳微量元素組合為Fe，C0，Ni，與對照相比，產氣速率分別提高了24.6%和25.4%。而陳朝猛等人以有機生活垃圾為底物投加Fe，Co,Ni，與不投加的系統相比，產氣量增加了43.4%，甲烷含量提高了5.1%，COD去除率提高了10.2%。2.2.4、 吸附劑——一些吸附劑也能改善產氣效果，吸附劑將微生物聚集起來，增加微生物密度，同時能保持對微生物生長有利的環境，從而讓微生物更好地降解有機物質，加快揮發酸的消耗，提高產氣量。Madamwar和Mithal在系統中加入10g.L-1的商用5果膠，使得最大產氣量增加了150%，并且CH4含量可達65%。根據Kumar等人的研究，在批量式和半連續發酵裝置中，添加商用木炭DarcoG-60能使沼氣量分別提高17%和34.7%。Patel和Madamwar對不同的吸附劑進行了試驗，有乳凝膠、聚乙烯醇、活性炭、果膠、高嶺土、硅膠、鋁粉、皂土、滑石土等，發現隨著加入吸附劑量的增加，沼氣量和CH含量均增加，且BOD，COD隨之下降。2.2.5、螯合劑一一添加螯合劑不僅可以提供碳源，更重要的是提高其他無機營養元素的可利用性，使得微生物能夠更好地利用營養物質，提高產甲烷菌的生長速率和種群的穩定性。添加環已烷二胺四醋酸（CDTA），氨三乙酸（NTA），乙二胺四乙酸（EDTA），檸檬酸（CA）四種螯合劑均可促進甲烷產量，提高量從5%-20%不等，其中氨三乙酸的促進作用最高，而且隨著螯合劑的添加，產氣量隨時間的增加而增加。更有報道表明，加入0.1的伊紅美藍能使產氣提高25%-35%。實驗材料及方法（具體實驗方法預覽）3.1、高效催化劑3.1.1纖維素沒產生菌的分離及其酶活力測定材料與方法試劑:DNS顯色劑；2mol/L氫氧化鈉溶液；80.0gNaoH；1L蒸餾水；羧酸甲基纖維素鈉。培養基：①富集培養基：CMC2Na20.0g，胰蛋白胨2.0g，（NH4）2SO42.0g，MgSO4.7H2O0.3g，KH2PO44.0g，蒸餾水1000ml，自然PH值。②平板篩選培養基：CMC2Na20.0g，（NH4）2SO42.0g，KH2PO44.0g，NaCl0.5g，gSO4.7H2O0.5g，剛果紅0.2g，蒸餾水1000ml，瓊脂20.0g，自然PH值③搖瓶發酵產酶培養基：麩皮20.0g，胰蛋白胨2.0g，（NH4）2SO42.0g，MgSO4.7H2O0.3g，KH2PO44.0g，蒸餾水1000ml，自然PH值。1.1.3儀器設備：DNP-9272-1A電熱恒溫培養箱。BL-50立式壓力蒸汽滅菌器筒,SW-CJ-1CU雙人單面凈化工作臺，微波爐，DHZ-DA大容量冷凍恒溫振蕩器，UV-2100紫外可見分光光度計，GL-20G-2高速冷凍離心機。YXS-8型數顯恒溫水浴鍋，Olympus生物顯微鏡。1.1.4實驗取樣。供試菌株取自校園內的草坪土、花臺土等方法1.2.1纖維素產生菌的分離。從土中取樣。接入富集液體培養基，在30攝氏度，50r/min振蕩培養3』在平板篩選培養基上進行培養，選變色圈較大的菌株，經反復培養和劃線分離，獲得詳解纖維素的純菌落。1.2.2纖維素酶產生菌的鑒定對分離純化出的四個纖維素酶產生菌株進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察其菌株形態。初步鑒別其種類。1.2.3搖瓶產酶試驗。去菌種1環接種于裝有20ml液體種子培養基的250ml三角瓶中，30攝氏度，50r/min振蕩培養48h，按2%的接種量轉移到30ml液體產酶培養基中，30攝氏度，50r/min振蕩培養，定時取樣測定發酵液中的酶活力。1.2.4酶活力測定。①葡萄糖標準曲線②粗酶液的制備③DNS法測酶活力2結果與分析＜纖維素酶產生菌的篩選〉一、 實驗基本流程:培養基的配置，滅菌一一菌種分離，有關試劑的準備（剛果紅的配置、DNS試劑的配置、0.1%葡萄糖標樣的配置）一一鑒定菌種及純化，葡萄糖標準曲線的制備一一發酵，酶活測定。二、 實驗原理：a、纖維素酶產生菌的鑒定b、剛果紅可以跟大分子多糖牢固結合，纖維素是大分子多糖，能與剛果紅牢固結合，c、纖維素酶降解平板中的纖維素成小分子糖，那么剛果紅無法與小分子糖結合就被洗脫下來。呈現透明圈。d、先用含有纖維素的平板培養菌，等菌長出來后。把菌體刮離。然后加入剛果紅染色10-15分鐘。再用NaCl沖洗2-3次，產生透明圈就是能水解纖維素的菌。也可以把剛果紅直接加到平板中，菌在生長過程中也會逐漸形成透明圈，不過前面的方法更為靈敏。e、纖維素酶活測定，纖維素酶能將羧甲基纖維素鈉降解成寡糖和單糖，具有還原性末端的寡糖和具有還原基團的單糖在沸水浴中可以與DNS試劑發生顯色反應，反應液顏色的強度與酶解產生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應液中纖維素酶的活力成正比。三、 培養基CMC-Na篩選培養基碳源（CMC-Na）：0.5g、蛋白月東：0.5g、KH2PO4：0.1g、MgSO4.7H2O:0.05g、酵母粉：0.05g、瓊脂：1.5g、水：100ml、PH：7.0濾紙篩選培養基：以上細菌培養基中碳源改成0.5g綠植條，其他成分相同剛果紅鑒定培養基：碳源（CMC-Na）:2.0g/l、（NH4）2SO4：2.0g/l、KH2PP4：1g/l、MgSO4.7H2O:0.05g/l、NaCl：0.5g/l、剛果紅：0.2g/l、瓊脂20g/l、PH：7.0四、 實驗步驟：兩種培養基的配制與其他材料的準備及滅菌一一分裝，制斜面培養基一一3.將土樣置于無菌生理鹽水中（0.9%NaCl溶液），制備成菌懸液，將菌懸液用無菌移液管各移取5ml至CMC-Na和濾紙條篩選培養基中，于28度搖床培養一周。4.取篩選后的菌液用無菌水梯度稀釋涂布于剛果紅鑒定平板上，28度培養箱培養48小時，觀察透明圈的大小5.挑取透明圈大的菌落，于CMC-Na培養基斜面中28度培養后冰箱4度保存。注：該小節內容已初步完成3.2.發酵促進劑3.1.1、啤酒糟【（1）實驗材料1）沼氣發酵底物（1） 牛糞：總固體含量（TS）20%?25%。（2） 產甲烷培養基：CH3COONa?3H2O10g，HCOONa3g，CH3OH1mL，MgCl2.6H2O0.1g，K2HPO4?3H2O0.4g，KH2PO40.4g，NH4Cl1.0g，水1L，pH7.0。2） 接種物：家畜糞便室溫下富集一周而得，TS16.02%。3） 外源添加物種類及成份4） 化學試劑：硫酸亞鐵、氯化鉆、氯化鎳、硫酸鋅、硫酸錳、活性炭、纖維素酶。根據相關文獻報導及前期試驗基礎，選擇一些對沼氣發酵過程中水解和產甲烷兩階段有促進作用的外源添加物進行試驗。所選的外源添加物種類及成份如下：微量元素液1（簡稱W1）:含Fe、Co、Ni，配制方法參照文獻［12］；微量元素液11（簡稱W2）:含Fe、Co、Ni、Ca、Na、Zn等，配制方法參照文獻［13］；維生素液：含生物素、葉酸、鹽酸、核黃素等，配制方法參照文獻［13］；物質M：蛋白東、氨基酸等的混合物；菌液：厭氧纖維素降解菌富集液，由厭氧污泥加富集培養基［14］室溫下富集30d而得；酶I：纖維素酶；酶II:纖維素酶、蛋白酶；酶III:纖維素酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶；甲胺磷：購于成都市某農貿市場；啤酒糟（干）：啤酒廠可購買。（2）實驗方法將發酵底物和接種物混勻后裝入1.5L發酵瓶，調節pH為7.0,室溫下進行批式發酵，排水集氣法收集沼氣，每天定時測定產氣量。1） 以豬糞為底物的篩選試驗以牛糞為底物，待產氣穩定后，分別加入2.0g/L啤酒糟、10.0mL/L菌液、酶I、酶II、酶111（各酶的用量參照文獻15］）進行試驗，并設置對照組（即不加任何外源添加物），每組均設3個重復。各組接種量為20%，料液TS8%。2） 以產甲烷培養基為底物的篩選試驗以產甲烷培養基為底物，待產氣穩定后分別加入10.0mL/LW1、10.0mL/LW2、2.0g/L物質M、1.0mg/L甲胺磷