生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)V:1.0精細(xì)整理，僅供參考生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)日期：20xx年X月2013-2014學(xué)年生命科學(xué)綜合大實(shí)驗(yàn)GFP分離與純化1.文獻(xiàn)綜述綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）是由238個(gè)氨基酸組成，分子量是26.9kDa，最初是從維多利亞多管發(fā)光水母(Aequoreavictoria)中分離出來(lái)的，在藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光。來(lái)源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分別有主要和次要的激發(fā)峰，它的發(fā)射峰在509nm，處于可見(jiàn)光譜的綠色區(qū)域，來(lái)源于海腎的GFP只在498nm有單個(gè)激發(fā)峰。GFP是典型的β桶形結(jié)構(gòu)，包含β折疊α和螺旋，將熒光基團(tuán)包含在其中。嚴(yán)密的桶形結(jié)構(gòu)保護(hù)著熒光基團(tuán)，防止它被周?chē)h(huán)境淬滅，內(nèi)部面向桶形的側(cè)鏈誘Ser65-Tyr66-Gly67三肽環(huán)化，導(dǎo)致熒光基團(tuán)形成。北京時(shí)間10月8日下午5點(diǎn)45分，2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉，三位美國(guó)科學(xué)家，美國(guó)WoodsHole海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的OsamuShimomura(下村修)、哥倫比亞大學(xué)的MartinChalfie和加州大學(xué)圣地亞哥分校的RogerY.Tsien（錢(qián)永健）因發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了綠色熒光蛋白（GFP）而獲得該獎(jiǎng)項(xiàng)。下修村首次從Aequoreavictoria中分離出GFP。他發(fā)現(xiàn)該蛋白在紫外線下會(huì)發(fā)出明亮的綠光。MartinChalfie證明了GFP作為多種生物學(xué)現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標(biāo)記的價(jià)值。在最初的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，他用GFP使秀麗隱桿線蟲(chóng)的6個(gè)單獨(dú)細(xì)胞有了顏色。錢(qián)永健的主要成就在于讓人們理解了GFP發(fā)出熒光的機(jī)制。同時(shí)，他拓展出綠色之外的可用于標(biāo)記的其他顏色，從而使科學(xué)家能夠?qū)Ω鞣N蛋白質(zhì)和細(xì)胞施以不同的色彩。這一切，令在同一時(shí)間跟蹤多個(gè)不同的生物學(xué)過(guò)程成為了現(xiàn)實(shí)。實(shí)驗(yàn)器材2.1實(shí)驗(yàn)材料：含GFP融合質(zhì)粒，Top10菌株2.2實(shí)驗(yàn)試劑：質(zhì)粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2MNaOH/1%SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸鉀/2M醋酸；無(wú)水乙醇，75%乙醇，TEBuffer；轉(zhuǎn)化：0.1M預(yù)冷CaCl2，LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素，阿拉伯糖；GFP提取：液氮，LysisBuffer，飽和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；疏水作用層析柱材：苯基瓊脂糖凝膠CL-4B；離子交換柱層析柱材：DEAE+纖維素，StartBuffer(A液20mMTris-HCl，pH7.0（透析液）)Elutionbuffer(B液20mMTris-HCl，1MNaCl，pH7.0)SDS電泳：PEG10000，LoadingBuffer，溴酚藍(lán)，丙烯酰胺，Tris，SDS，過(guò)硫酸銨，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巰基乙醇，溴酚藍(lán)，甲醇，考馬斯亮藍(lán)，乙酸等2.3實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī),移液槍，超聲波破碎儀，梯度混合器，恒流泵,層析柱,色譜儀,自動(dòng)記錄儀,SDS電泳裝置。實(shí)驗(yàn)方法3.1質(zhì)粒提取1.取1.5mL菌液，12000rpm離心1min，棄上清液；2.加100μL溶液Ⅰ，充分懸浮；3.加200μL溶液Ⅱ，溫和混勻，室溫5min；4.加150μL溶液Ⅲ，混勻，冰浴5min；5.12000rpm離心8min，將上清加入一新的1.5mlEP管中；6.加800μL無(wú)水乙醇至上清液中，混勻，-20℃放置10min，12000rpm離心8min，棄上清；7.70%乙醇洗DNA一次，離心棄上清；8.在超凈臺(tái)中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；9.加40μLTEBuffer溶解DNA，4℃?zhèn)溆谩?.2感受態(tài)細(xì)胞的制備以及轉(zhuǎn)化1.取1.5mLTop10菌液，在4℃4000rpm離心10min，棄上清；2.加200μL預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮沉淀（無(wú)菌操作），冰浴15min后4℃4000rpm離心10min，棄上清；3.加200μL預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮沉淀（無(wú)菌操作），4℃?zhèn)溆茫?.將1μL質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min；5.42℃熱激90s；6.立即放在冰上3-5min；7.加入800μLLB液體培養(yǎng)基，37℃150rpm培養(yǎng)60min（使Top10恢復(fù)正常生長(zhǎng)）；8.取200μL菌液涂布在LB（Amp100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。3.3擴(kuò)大培養(yǎng)1.取含GFP質(zhì)粒的Top10平板并挑取單克隆（在紫外燈照射下有綠色熒光的菌落）；2.將挑取的單菌落接種于試管中（含4mL的LB液體培養(yǎng)基，100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約3-4h）；3.將上述搖好的菌液，按1:100轉(zhuǎn)接至250mLLB液中（Amp工作濃度100ng/ml，阿拉伯糖工作濃度2mg/ml），37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。3.4細(xì)胞破碎1.將培養(yǎng)好的細(xì)菌3000g離心10min，紫外燈觀察棄上清，沉淀用液氮凍融；2.用30mLLysisBuffer(50mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA)懸浮沉淀；3.向懸浮液中加15mg溶菌酶，混勻后室溫溶解10min；4.400W功率下，超聲處理10min；5.將破碎液9000g離心15min，紫外燈觀察，留上清備用；6.選取合適的濃度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP；一般(NH4)2SO4飽和度為30%時(shí)，雜蛋白的沉淀量最大，飽和度達(dá)到70%時(shí)GFP沉淀量達(dá)最大附：(NH4)2SO4濃度與含量表，體積為10ml；(NH4)2SO4飽和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%(NH4)2SO4（g）0.561.141.762.425.616.62向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室溫放置20min，9000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清至另一試管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混勻，室溫放置至少20min，9000rpm離心15min，棄上清，留沉淀備用；3.5疏水作用層析1.將沉淀的GFP，用10mL2M(NH4)2SO4/LysisBuffer，pH8.0溶解，9000rpm，離心10min，留上清；（2號(hào)樣品）2.用3倍體積平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.將步驟1中的上清液上柱，用3倍柱體積的WashingBuffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TEBuffer（ElutionBuffer：10mMTris,1mMEDTA，pH8.0）洗柱，紫外燈檢查，GFP快流出時(shí)，準(zhǔn)備收集；5.將收集液透析過(guò)夜。（3號(hào)樣品）3.6離子交換層析1.將透析后所得的透析液9000rpm離心10min，棄去沉淀（4）；2.用3倍體積的StartBuffer(A液)平衡柱子；3.將步驟1中所得的上清液上柱，再用3倍柱體積的StartBuffer洗柱子；4.梯度洗脫GFP，梯度液：StartBuffer(A液)、ElutionBuffer(B液)，紫外燈觀察，GFP快流出來(lái)時(shí)，準(zhǔn)備收集5.將收集液透析過(guò)夜(透析液為A液)。3.7凝膠過(guò)濾純化GFP1.將透析袋置入含PEG10000的培養(yǎng)皿中，濃縮至體積約2mL；2.用3倍柱體積的20mMTris-HCl，pH7.0平衡柱子；3.將步驟1中所得的GFP上柱，用20mMTris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外燈檢測(cè)，GFP快流出時(shí)收集備用。3.8SDS—PAGE將收集的各樣品加入等體積的2×SDSLoadingBuffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩?.按照電泳裝置的使用說(shuō)明，裝好潔凈干燥的玻璃板。2.分離膠的制備按下列成分配制分離膠：ddH2O30%丙烯酰胺混合液1.5MTris(pH8.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED8.2mL6.68mL5.0mL0.1mL0.1mL0.04mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，并為濃縮膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層20%乙醇封頂，以防止空氣中的氧對(duì)凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的乙醇，用濾紙吸干凝膠頂端的乙醇。3.濃縮膠的制備按下列成分配制2mL5%的積層膠：ddH2O30%丙烯酰胺混合液1.0MTris(pH6.8)10%SDS10%過(guò)硫酸銨TEMED7.35mL1.3mL1.25mL0.1mL0.1mL0.1mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避免產(chǎn)生氣泡。4.待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。5.將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入20μL各樣品。6.樣品在濃縮膠中電泳時(shí)，使用80V電壓，待溴酚藍(lán)帶進(jìn)入分離膠后，將電壓升至120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)帶到達(dá)分離膠的底部且開(kāi)始泳出膠底面，關(guān)閉電源。7.卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（50%甲醇，0.05%考馬斯亮藍(lán)，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平搖床上室溫染色45min，之后取出凝膠并回收染色液，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)脫色液（與染色液同，只是無(wú)考馬斯亮藍(lán)）中，在水平搖床上脫色1h，其間更換脫色液3-4次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察結(jié)果并拍照。（注：由于濃縮膠制備過(guò)程中凝固太快，所以最后未使用濃縮膠而只用分離膠進(jìn)行SDS。）思考題實(shí)驗(yàn)純化效果如何？如果要得到較純的GFP，你會(huì)采用哪些方法進(jìn)一步純化？答：實(shí)驗(yàn)純化效果請(qǐng)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。SDS的樣品緩沖液中有哪些成分它們有什么作用為什么要將樣品和緩沖液混合后煮沸答：SDS的樣品緩沖液的主要成分有SDS，甘油，溴酚藍(lán)和β-巰基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白質(zhì)變形，斷裂蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的氫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；甘油是增加密度，使蛋白質(zhì)能很好的沉淀在下面；溴酚藍(lán)作為指示前沿，防止電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；β-巰基乙醇作為保護(hù)劑，防止空氣中的氧對(duì)蛋白質(zhì)的氧化作用，同時(shí)還能斷裂蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸殘基中的二硫鍵。常用的交聯(lián)葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么？

答：交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交聯(lián)葡聚糖干膠膨脹時(shí)所吸收水克數(shù)的10倍，如