生化實驗技術(shù)專題主要內(nèi)容：介紹生物大分子分離純化的一般步驟和原則；介紹層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)、超過濾技術(shù)的原理及其應(yīng)用；總結(jié)蛋白質(zhì)、核酸、酶、氨基酸測定的主要方法。生化實驗技術(shù)專題主要內(nèi)容：介紹生物大分子分離純化的1目錄第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備第二節(jié)幾類主要的生化實驗技術(shù)第三節(jié)

蛋白質(zhì)、核酸的檢測目錄第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備2第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備

一．一般過程和原則二．注意事項三．純化方案的設(shè)計和評價例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化確立有效成分的測定方法材料的選擇和預(yù)處理細(xì)胞的破碎和細(xì)胞組分分離有效成分的抽提有效成分的純化和濃縮第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備

一．一般過程和原則二．注意3生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細(xì)分級→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法鹽析（硫酸銨4調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表5注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解1．控制適當(dāng)?shù)膒H2．控制低溫3．注意提取過程中的溶液環(huán)境4．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解6宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化

純化步驟總蛋白總活力比活力純化倍數(shù)回收率

（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸鈣沉淀2129801412.64694、鹽析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、結(jié)晶0.12130107219.703宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化純化步驟7第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術(shù)一、層析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)四、透析和超過濾第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術(shù)一、層析技術(shù)8一．層析技術(shù)（chromatography）1．層析技術(shù)一般原理2．層析技術(shù)分類3．常用層析技術(shù)及應(yīng)用一．層析技術(shù)（chromatography）1．層析技術(shù)一般9層析技術(shù)原理

層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析,都是由互不相溶的兩個相組成:一是固定相(固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。

混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)(distributioncoefficient,Kd）來描述。混合物各組分的分配系數(shù)差異越大，越容易分離開。

物質(zhì)在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于其Kd，而取決于它的有效分配系數(shù)Keff:

Keff=

某一物質(zhì)在A相中的總量

某一物質(zhì)在B相中的總量層析技術(shù)原理層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析10層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱層析法分類（按裝置分類）

紙層析洗脫液樣11氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)150cm柱，pH3.25，0.067mol/L檸檬酸鈉150cm柱，pH4.25，0.067mol/L檸檬酸鈉15cm柱，pH5.25，0.12mol/L檸檬酸鈉緩沖液泵顯色反應(yīng)管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerP12氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置載氣（流動相）樣品）進(jìn)樣室檢測器記錄儀出口氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigra13高效液相層析（HPLC）圖解

（highperformanceliquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置溶劑儲瓶溶劑過濾器進(jìn)樣室檢測器記錄儀高效液相層析（HPLC）圖解

（highperforma14各類層析的原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）各類層析的原理和載體類別分離15幾種主要沉淀方法比較幾種主要沉淀方法比較16常用層析技術(shù)及應(yīng)用吸附層析分配層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析常用層析技術(shù)及應(yīng)用吸附層析17吸附層析

（absorptionchromatography）

原理：載體：硅膠氧化鋁羥基磷石灰應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質(zhì)以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃酉唷Ｓ捎诟鞣N物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當(dāng)流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。吸附18分配層析

（distribuptionchromatography）

原理：載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定

分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動相（展開劑）。當(dāng)流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點中的溶質(zhì)在水和有機(jī)相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進(jìn)行不斷分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。分配層析

（distribupt19逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質(zhì)Z(Kd=3)的分配情況溶劑B總量總量總量總量總量總量平衡后轉(zhuǎn)移1轉(zhuǎn)移2轉(zhuǎn)移3分溶管號轉(zhuǎn)移4上相轉(zhuǎn)移下相轉(zhuǎn)移上相轉(zhuǎn)移管中蛋白質(zhì)總量物質(zhì)Y物質(zhì)Z分溶曲線管號有效分配系數(shù)（Keff）

某一物質(zhì)在A相中的總量某一物質(zhì)在B相中的總量逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質(zhì)20分子篩層析（gel-filtrationchromatography）

基質(zhì)葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)

原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行分離的一種方法。由于被分離物質(zhì)的分子大小（直徑）和形狀不同，洗脫時，大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。分子篩層析（gel-filtrationchromatog21分子篩層析原理示意圖

分子篩層析原理示意圖

22分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質(zhì)管蛋白質(zhì)混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質(zhì)管蛋白質(zhì)混合物大分子23蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系

Andrews的經(jīng)驗公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”G-200G-100logMrKav蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）24離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度離子交換層25離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaClNaCl梯度離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶26梯度混合器凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形梯度混合器凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱27常用的陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺丙基常用的陽離子交換劑

離子交換劑28常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）氨基乙基離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)PAB-纖維素（弱減型）對氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強(qiáng)減型）二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強(qiáng)減型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱減型）（中弱減型）常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）29親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex親和層析（affiuitychromatography）

30親和層析原理示意圖

蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的可溶性配基專一性結(jié)合蛋白質(zhì)沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度洗脫體積與配體專一性結(jié)合蛋白質(zhì)加入配基基質(zhì)親和層析原理示意圖

蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的31聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時間進(jìn)行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動速率層析時的聚焦效應(yīng)示意圖聚焦層析（Chromatofocusing）32幾種主要層析方法比較幾種主要層析方法比較33二、電泳技術(shù)

1．電泳的一般原理2.電泳技術(shù)的類別3、常用電泳技術(shù)4、電泳技術(shù)的拓展二、電泳技術(shù)

1．電泳的一般原理34電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其35電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠36常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳3、瓊脂糖電泳4、毛細(xì)管電泳常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳37聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

1、一般PAGE2、SDS3、PAGE等電點聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryla38聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性)或連續(xù)體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進(jìn)行電泳分離一種方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種。化學(xué)聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegele39不連續(xù)PAGE的濃縮效應(yīng)

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)ABC++--樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-不連續(xù)PAGE的濃縮效應(yīng)

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)40SDS

原理：

當(dāng)SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。可用下式表示：

LogMr=a–bmr應(yīng)用:測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）LogMrSDS

原理：Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）41等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度等電點聚焦（isoelectricfocusing）

42瓊脂糖電泳

瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到450C以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠用作電泳的固相支持物具有分子篩效應(yīng)，其對生物分子的分離作用不僅與其分子的構(gòu)象及其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)，而且與凝膠的濃度也有密切關(guān)系，故可根據(jù)分離對象分子量大小選擇適當(dāng)濃度的凝膠。

瓊脂糖電泳常用于核酸分離，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為2OObP至5Okb的DNA，

瓊脂糖凝膠還常用作免疫電泳的固相支持物。瓊脂糖電泳瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖43不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)可分辨的線性DNA大小范圍／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物水平型平板電泳槽

不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)44毛細(xì)管電泳

(CapillaryElectrophoresis，CE)

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。毛細(xì)管電泳原理示意圖毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的發(fā)展毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展毛細(xì)管電泳

(CapillaryElectrophores45毛細(xì)管電泳裝置示意圖30KV高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集石英玻璃毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液正極負(fù)極毛細(xì)管電泳裝置示意圖30KV光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集石英玻璃毛46毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的發(fā)展

（一）紫外可見光吸收石英毛細(xì)管因可透過20nm波長以下的紫外光，因此不僅允許從紫外到可見光這一波長范圍內(nèi)對樣品組分進(jìn)行檢測。而且可將透光窗口直接開在毛細(xì)管上，進(jìn)行“在柱”檢測。（二）熒光檢測法是毛細(xì)管電泳中一種常見的“在柱”檢測法，尤其是激光誘導(dǎo)熒光檢測法(LIF)，其靈敏度可高達(dá)10-12～10-16mol/L-1，是目前毛細(xì)管電泳中最靈敏的一種檢測方法。（三）電化學(xué)檢測方法電導(dǎo)檢測、電位檢測、安培檢測是電化學(xué)檢測常用的三種方法，對電活性組分的檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、選擇性好以及價格低廉等特點。（四）集成毛細(xì)管電泳芯片該項技術(shù)以晶體硅、玻璃、塑料(指有機(jī)玻璃)、陶瓷和硅橡膠為基本材料，借助毛細(xì)管電泳技術(shù)，將樣品進(jìn)樣、反應(yīng)、分離、檢測等過程集成到一起的多功能化的技術(shù)，該項工作與分析儀器的微型化、小型化和集成化緊密相連,使得其能符合現(xiàn)代生物化學(xué)、制藥工業(yè)的低成本和高產(chǎn)出的需求。毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的發(fā)展（一）紫外可見光吸收47毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展

（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳又稱毛細(xì)管自由電泳，毛細(xì)管內(nèi)只充入緩沖溶液，在直流高壓驅(qū)動下，溶質(zhì)以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)行遷移而被分離。可用于氨基酸、多肽、離子、對映體等物質(zhì)的分析。（二）毛細(xì)管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物而進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用，溶質(zhì)按分子大小進(jìn)行分離。常用聚丙烯酸胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱，可用于分離測定蛋白質(zhì)和DNA等，但制備繁瑣，使用壽命短。（三）毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)將普通等電聚焦電泳轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中進(jìn)行，在高壓作用下，毛細(xì)管內(nèi)部建立pH梯度，蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中向各自的等電點聚焦，形成明顯的區(qū)帶，再通過檢測器分別加以確認(rèn)，常用于分離離子型物質(zhì)。（四）親和毛細(xì)管電泳(ACE)建立在生物分子之間的親和作用基礎(chǔ)上，利用親和分子（如抗原與抗體、酶與底物、配體與受體等）相互選擇性，通過毛細(xì)管電泳來測定這些分子，從而具有高選擇性和靈敏性。傳統(tǒng)的親和分析有很多優(yōu)點，但在技術(shù)上操作繁瑣，自動化程度低，測定周期長，因而親和分析與毛細(xì)管電泳的聯(lián)用正可彌補(bǔ)其局限性和缺點。毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳48電泳技術(shù)的拓展1、免疫電泳(immunoelectrophoresis)2、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(singlecellgelelectrophoresisassay，SCGE)，又稱彗星試驗(Cometassay)3、雙向電泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)4、脈沖凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)5、連續(xù)型逆向色譜電泳(continuouscounteractionchromatographicelectrophoresis，CACE)6、介體電泳(preparativeelectrophoresis)7、溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis）電泳技術(shù)的拓展1、免疫電泳(immunoelectroph49雙向電泳圖譜正常小鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)組的雙向電泳人胃癌SGC7901細(xì)胞蛋白質(zhì)組的雙向電泳第一向：PAGE等電點聚焦（IEF），第二向：SDSPAGE雙向電泳圖譜正常小鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)組的雙向電泳人胃癌SGC750連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽極陰極目標(biāo)產(chǎn)品富集區(qū)填料（排阻區(qū)）填料（嵌入?yún)^(qū)）凈速度電泳色譜凈速度電泳目標(biāo)蛋白的遷移情況連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽51三、離心技術(shù)

1．離心機(jī)類別普通離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分高速離心機(jī)2-3萬轉(zhuǎn)/分超速離心機(jī)3萬轉(zhuǎn)/分2．沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient,s）3．超離心法類別

密度梯度離心法（densitygradient）

沉降速度法（sedimentationvelocity）

沉降平恒法（sedimentationeguilibrium）三、離心技術(shù)

1．離心機(jī)類別2．沉降系數(shù)（sedimen52離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動馬達(dá)真空冷凍離心機(jī)結(jié)構(gòu)示意圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動馬達(dá)真空冷凍53

沉降系數(shù)

（sedimentationcoefficient）

生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時間。數(shù)學(xué)定義式為：

沉降系數(shù)單位：由于蛋白質(zhì)、核酸、病毒等的沉降系數(shù)介于1×10-13介于10-13到200×10-13s的范圍，為方便起見，把1×10-13s作為沉降系數(shù)的一個單位，用Svedberg單位，用即S表示。沉降系數(shù)（s）與相對分子量（Mr）的關(guān)系:Mr=RTsD(1-)Svedberg方程:d/dt2

s=沉降系數(shù)

（sedimentation54密度梯度離心法（densitygradient）

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度密度梯度離心法（densitygradient）551、核酸密度的測定=o+4.2

2(2-02)10-102、測定DNA中G-C之含量

Rolfe-Meselson公式：=0.100xG-C+1.6583、溶液中核酸構(gòu)象的研究：單鏈DNA雙鏈DNA蛋白質(zhì)雙鏈DNARNA4、核酸的制備

氯化銫密度梯度超離心經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的應(yīng)用1、核酸密度的測定經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA56沉降速率法（sedimentationvelocity）

在離心場的作用下，蛋白質(zhì)分子將沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向（徑向）移動，并產(chǎn)生沉降界面，界面的移動速度代表蛋白質(zhì)的沉降速度。在界面處由于濃度差造成折射率不同，可借助適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)，如schlieren光學(xué)系統(tǒng)（也稱暗線光學(xué)照相系統(tǒng)），觀察到這種界面的移動。在schlieren光學(xué)系統(tǒng)中，利用溶液的折射率梯度（d/d）和樣品的濃度梯度（dc/d）成正比這一特點，巧妙地設(shè)計光路，使移動的界面以峰形曲線呈現(xiàn)在照相圖片上，峰頂代表移動界面。離心機(jī)的裝置允許在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)時，對界面的移動進(jìn)行觀察和拍照。沉降速率法（sedimentationvelocity57分析型超速離心機(jī)光源柔性驅(qū)動軸熱敏溫度計樣品池準(zhǔn)直透鏡液面沉降界面溶劑配衡池沉降界面聚光透鏡馬達(dá)濾光片溶質(zhì)空氣沉降方向照相機(jī)透鏡園柱型透鏡底板Schlieren光閘真空冷凍12cd/d分析型超速離心機(jī)光源柔性驅(qū)動軸熱敏溫度計樣品池準(zhǔn)直透鏡液面沉58沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）

在較低速度（8,000-20,000r/min）的離心場中，離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結(jié)果造成濃度梯度。因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用，擴(kuò)散力的作用方向正與離心力相反，當(dāng)凈離心力與擴(kuò)散平衡時，在離心池內(nèi)從液面到池低形成一個由低到高的恒定濃度梯度。如果測得相關(guān)參數(shù)即可算出生物分子的分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴(kuò)散力x2Mr=(1-)2(22-12)2RTdln(c2-c1)計算公式如下：沉降平衡法（sedimentationeguilibr59透析（dialysis）半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料透析（dialysis）半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透60超過濾（ultrafiltration）

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質(zhì)。為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅(qū)動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心AB超過濾（ultrafiltration）利用壓力61蛋白質(zhì)、核酸的定性定量檢測1、蛋白質(zhì)的測定凱氏定氮法（含N量6.

25）雙縮脲法、Folin-酚法紫外光度法（max=280nm）離心法、電泳法、層析法2、酶活力的測定終點法、動力學(xué)法3、氨基酸的測定茚三酮法Sangerf法、Edmam法、DNS法4、核酸的測定紫外光度法（max=260nm）分子雜交法離心法、電泳法蛋白質(zhì)、核酸的定性定量檢測1、蛋白質(zhì)的測定凱氏定氮62生化實驗技術(shù)專題主要內(nèi)容：介紹生物大分子分離純化的一般步驟和原則；介紹層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)、超過濾技術(shù)的原理及其應(yīng)用；總結(jié)蛋白質(zhì)、核酸、酶、氨基酸測定的主要方法。生化實驗技術(shù)專題主要內(nèi)容：介紹生物大分子分離純化的63目錄第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備第二節(jié)幾類主要的生化實驗技術(shù)第三節(jié)

蛋白質(zhì)、核酸的檢測目錄第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備64第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備

一．一般過程和原則二．注意事項三．純化方案的設(shè)計和評價例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化確立有效成分的測定方法材料的選擇和預(yù)處理細(xì)胞的破碎和細(xì)胞組分分離有效成分的抽提有效成分的純化和濃縮第一節(jié)生物大分子物質(zhì)的制備

一．一般過程和原則二．注意65生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級→│←細(xì)分級→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理生物大分子分離純化的一般步驟和原則

層析法鹽析（硫酸銨66調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表67注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解1．控制適當(dāng)?shù)膒H2．控制低溫3．注意提取過程中的溶液環(huán)境4．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基注意事項

基本原則：防止生物分子變性、降解68宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化

純化步驟總蛋白總活力比活力純化倍數(shù)回收率

（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液8043205411002、乙醇沉淀2935851232.27833、醋酸鈣沉淀2129801412.64694、鹽析417714648.52415、丙酮沉淀11166110420.29276、結(jié)晶0.12130107219.703宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的純化純化步驟69第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術(shù)一、層析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)四、透析和超過濾第二節(jié)幾類重要的生化實驗技術(shù)一、層析技術(shù)70一．層析技術(shù)（chromatography）1．層析技術(shù)一般原理2．層析技術(shù)分類3．常用層析技術(shù)及應(yīng)用一．層析技術(shù)（chromatography）1．層析技術(shù)一般71層析技術(shù)原理

層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析,都是由互不相溶的兩個相組成:一是固定相(固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或氣體）。層析時，利用混合物中各組分理化性質(zhì)（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。

混合物在層析系統(tǒng)中的分離決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)(distributioncoefficient,Kd）來描述。混合物各組分的分配系數(shù)差異越大，越容易分離開。

物質(zhì)在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于其Kd，而取決于它的有效分配系數(shù)Keff:

Keff=

某一物質(zhì)在A相中的總量

某一物質(zhì)在B相中的總量層析技術(shù)原理層析技術(shù)是一種物理的分離方法。無論何種層析72層析法分類（按裝置分類）

紙層析薄膜層析

柱層析洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱層析法分類（按裝置分類）

紙層析洗脫液樣73氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)150cm柱，pH3.25，0.067mol/L檸檬酸鈉150cm柱，pH4.25，0.067mol/L檸檬酸鈉15cm柱，pH5.25，0.12mol/L檸檬酸鈉緩沖液泵顯色反應(yīng)管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerP74氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置載氣（流動相）樣品）進(jìn)樣室檢測器記錄儀出口氣液色譜圖解

（gas-liquidchromatigra75高效液相層析（HPLC）圖解

（highperformanceliquidchromatigraphy）層析柱恒溫裝置溶劑儲瓶溶劑過濾器進(jìn)樣室檢測器記錄儀高效液相層析（HPLC）圖解

（highperforma76各類層析的原理和載體類別分離原理基質(zhì)或載體吸附層析化學(xué)、物理吸附硅膠、氧化鋁、羥基磷酸分配層析兩溶劑相中的溶解效應(yīng)纖維素、硅藻土、硅膠凝膠層析

分子篩效應(yīng)的排阻效應(yīng)sepharose、sephadex離子交換層析離子基團(tuán)的交換反應(yīng)離子交換樹脂、纖維素、葡聚糖親和層析

分離物與配體之間有帶配基的sepharose特殊親和力或sephadex聚焦層析等電點和離子交換作用多緩沖交換劑（與帶有多種電荷基團(tuán)的配體相偶聯(lián)的sepharose6B）各類層析的原理和載體類別分離77幾種主要沉淀方法比較幾種主要沉淀方法比較78常用層析技術(shù)及應(yīng)用吸附層析分配層析凝膠過濾（分子篩層析）離子交換層析親和層析

聚焦層析常用層析技術(shù)及應(yīng)用吸附層析79吸附層析

（absorptionchromatography）

原理：載體：硅膠氧化鋁羥基磷石灰應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核苷酸等生化物質(zhì)以吸附劑作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃酉唷Ｓ捎诟鞣N物質(zhì)的極性不同，被吸附劑吸附的程度和在流動相中的溶解度不同。層析時，當(dāng)流動相從固定相上流過時，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動相向前移動。吸附80分配層析

（distribuptionchromatography）

原理：載體：纖維素硅藻土硅膠應(yīng)用：各種生化物質(zhì)的分離鑒定

分配層析實際上是一種連續(xù)抽提方式。如紙層析中濾紙的結(jié)合水為固定相，以水飽和的有機(jī)溶劑為流動相（展開劑）。當(dāng)流動相沿濾紙經(jīng)過樣品點時，樣品點中的溶質(zhì)在水和有機(jī)相中溶解度不同而不均勻地分配在兩相中，各種組分按其各自的分配系數(shù)進(jìn)行不斷分配，從而使物質(zhì)得到分離和純化。分配層析

（distribupt81逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質(zhì)Z(Kd=3)的分配情況溶劑B總量總量總量總量總量總量平衡后轉(zhuǎn)移1轉(zhuǎn)移2轉(zhuǎn)移3分溶管號轉(zhuǎn)移4上相轉(zhuǎn)移下相轉(zhuǎn)移上相轉(zhuǎn)移管中蛋白質(zhì)總量物質(zhì)Y物質(zhì)Z分溶曲線管號有效分配系數(shù)（Keff）

某一物質(zhì)在A相中的總量某一物質(zhì)在B相中的總量逆流分溶原理示意圖物質(zhì)Y(Kd=1)的分配情況溶劑A物質(zhì)82分子篩層析（gel-filtrationchromatography）

基質(zhì)葡聚糖凝膠（sephadex）瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用測定分子量脫鹽和濃縮分離提純生物大分子除去熱原物質(zhì)

原理：凝膠層析也稱為排阻凝膠層析、凝膠過濾和分子篩層析。它是60年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行分離的一種方法。由于被分離物質(zhì)的分子大小（直徑）和形狀不同，洗脫時，大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。分子篩層析（gel-filtrationchromatog83分子篩層析原理示意圖

分子篩層析原理示意圖

84分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質(zhì)管蛋白質(zhì)混合物大分子從柱上面加緩沖溶液小分子洗脫體積（Ve）凝膠柱大分子小分子Ve1Ve2V0分子篩層析與洗脫曲線

凝膠顆粒收集蛋白質(zhì)管蛋白質(zhì)混合物大分子85蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）未知logMr洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系

Andrews的經(jīng)驗公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“選擇性曲線”G-200G-100logMrKav蛋白質(zhì)Mr=49,000洗出液中的蛋白質(zhì)濃度洗脫體積（mL）86離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度離子交換層87離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管收集樣品的管帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)收集樣品的管NaClNaCl梯度離子交換層析原理示意圖

蛋白質(zhì)濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質(zhì)帶88梯度混合器凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱磁力攪拌器洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度簡單型梯度混合器梯度洗脫曲線洗脫劑體積（mL）洗脫劑濃度儲液瓶混合瓶復(fù)合型梯度混合器梯度洗脫曲線凸形線形凹形梯度混合器凝膠顆粒蛋白質(zhì)混合物大分子小分子儲液瓶混合瓶層析柱89常用的陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強(qiáng)弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強(qiáng)弱酸型）磺丙基常用的陽離子交換劑

離子交換劑90常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）氨基乙基離子交換劑可電離基團(tuán)可電離基團(tuán)結(jié)構(gòu)PAB-纖維素（弱減型）對氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強(qiáng)減型）二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強(qiáng)減型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱減型）（中弱減型）常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）91親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：基質(zhì)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、sepharose、sephadex親和層析（affiuitychromatography）

92親和層析原理示意圖

蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的可溶性配基專一性結(jié)合蛋白質(zhì)沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)濃度洗脫體積與配體專一性結(jié)合蛋白質(zhì)加入配基基質(zhì)親和層析原理示意圖

蛋白質(zhì)混合物配體與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)加入的93聚焦層析（Chromatofocusing）該法是在等電點聚焦方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)按其等電點在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應(yīng)的先決條件，如果一種蛋白質(zhì)加到已形成pH梯度的層析柱上時,由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質(zhì)將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的時間進(jìn)行聚焦,剩余樣品還可以加到柱上,其聚焦過程都能順利完成。pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質(zhì)1（pI=7）蛋白質(zhì)2（pI=8）流速移動速率層析時的聚焦效應(yīng)示意圖聚焦層析（Chromatofocusing）94幾種主要層析方法比較幾種主要層析方法比較95二、電泳技術(shù)

1．電泳的一般原理2.電泳技術(shù)的類別3、常用電泳技術(shù)4、電泳技術(shù)的拓展二、電泳技術(shù)

1．電泳的一般原理96電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。許多生物分子都帶有電荷，其電荷的多少取決于分子組成、性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。如果混合物中各組分的結(jié)構(gòu)組成不同，在某一pH溶液中，各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量不同，加之其分子量不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。電泳的一般原理

電泳是帶電顆粒在電場作用下向著與其97電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細(xì)管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠98常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳2、聚丙烯酰胺凝膠電泳3、瓊脂糖電泳4、毛細(xì)管電泳常用電泳技術(shù)1、醋酸纖維薄膜電泳99聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）

1、一般PAGE2、SDS3、PAGE等電點聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryla100聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

PAGE是在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性)或連續(xù)體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進(jìn)行電泳分離一種方法。

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應(yīng)的催化系統(tǒng)有兩種。化學(xué)聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegele101不連續(xù)PAGE的濃縮效應(yīng)

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)ABC++--樣品濃縮膠分離膠電極緩沖液低電位梯度E11高電位梯度E21+-不連續(xù)PAGE的濃縮效應(yīng)

樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質(zhì)102SDS

原理：

當(dāng)SDS（SodiumDodecylSulfate）與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS的作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。可用下式表示：

LogMr=a–bmr應(yīng)用:測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)亞基數(shù)Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）LogMrSDS

原理：Mr（相對遷移率）mr（相對遷移率）103等電點聚焦（isoelectricfocusing）

原理:

在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當(dāng)直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度等電點聚焦（isoelectricfocusing）

104瓊脂糖電泳

瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，這種多糖鏈在1000C左右時呈液態(tài)，當(dāng)溫度下降到450C以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。

瓊脂糖凝膠用作電泳的固相支持物具有分子篩效應(yīng)，其對生物分子的分離作用不僅與其分子的構(gòu)象及其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)，而且與凝膠的濃度也有密切關(guān)系，故可根據(jù)分離對象分子量大小選擇適當(dāng)濃度的凝膠。

瓊脂糖電泳常用于核酸分離，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為2OObP至5Okb的DNA，

瓊脂糖凝膠還常用作免疫電泳的固相支持物。瓊脂糖電泳瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖105不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)可分辨的線性DNA大小范圍／(kb)

0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.1DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物水平型平板電泳槽

不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍瓊脂糖凝膠濃度／(%)106毛細(xì)管電泳

(CapillaryElectrophoresis，CE)

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。

毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。毛細(xì)管電泳原理示意圖毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的發(fā)展毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展毛細(xì)管電泳

(CapillaryElectrophores107毛細(xì)管電泳裝置示意圖30KV高壓電源光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集石英玻璃毛細(xì)管緩沖液-樣品緩沖液正極負(fù)極毛細(xì)管電泳裝置示意圖30KV光源光電倍增管數(shù)據(jù)采集石英玻璃毛108毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的發(fā)展

（一）紫外可見光吸收石英毛細(xì)管因可透過20nm波長以下的紫外光，因此不僅允許從紫外到可見光這一波長范圍內(nèi)對樣品組分進(jìn)行檢測。而且可將透光窗口直接開在毛細(xì)管上，進(jìn)行“在柱”檢測。（二）熒光檢測法是毛細(xì)管電泳中一種常見的“在柱”檢測法，尤其是激光誘導(dǎo)熒光檢測法(LIF)，其靈敏度可高達(dá)10-12～10-16mol/L-1，是目前毛細(xì)管電泳中最靈敏的一種檢測方法。（三）電化學(xué)檢測方法電導(dǎo)檢測、電位檢測、安培檢測是電化學(xué)檢測常用的三種方法，對電活性組分的檢測具有靈敏度高、線性范圍寬、選擇性好以及價格低廉等特點。（四）集成毛細(xì)管電泳芯片該項技術(shù)以晶體硅、玻璃、塑料(指有機(jī)玻璃)、陶瓷和硅橡膠為基本材料，借助毛細(xì)管電泳技術(shù)，將樣品進(jìn)樣、反應(yīng)、分離、檢測等過程集成到一起的多功能化的技術(shù)，該項工作與分析儀器的微型化、小型化和集成化緊密相連,使得其能符合現(xiàn)代生物化學(xué)、制藥工業(yè)的低成本和高產(chǎn)出的需求。毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)的發(fā)展（一）紫外可見光吸收109毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展

（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳又稱毛細(xì)管自由電泳，毛細(xì)管內(nèi)只充入緩沖溶液，在直流高壓驅(qū)動下，溶質(zhì)以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)行遷移而被分離。可用于氨基酸、多肽、離子、對映體等物質(zhì)的分析。（二）毛細(xì)管凝膠電泳將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物而進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用，溶質(zhì)按分子大小進(jìn)行分離。常用聚丙烯酸胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱，可用于分離測定蛋白質(zhì)和DNA等，但制備繁瑣，使用壽命短。（三）毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)將普通等電聚焦電泳轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管中進(jìn)行，在高壓作用下，毛細(xì)管內(nèi)部建立pH梯度，蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中向各自的等電點聚焦，形成明顯的區(qū)帶，再通過檢測器分別加以確認(rèn)，常用于分離離子型物質(zhì)。（四）親和毛細(xì)管電泳(ACE)建立在生物分子之間的親和作用基礎(chǔ)上，利用親和分子（如抗原與抗體、酶與底物、配體與受體等）相互選擇性，通過毛細(xì)管電泳來測定這些分子，從而具有高選擇性和靈敏性。傳統(tǒng)的親和分析有很多優(yōu)點，但在技術(shù)上操作繁瑣，自動化程度低，測定周期長，因而親和分析與毛細(xì)管電泳的聯(lián)用正可彌補(bǔ)其局限性和缺點。毛細(xì)管電泳分離模式的發(fā)展（一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳110電泳技術(shù)的拓展1、免疫電泳(immunoelectrophoresis)2、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(singlecellgelelectrophoresisassay，SCGE)，又稱彗星試驗(Cometassay)3、雙向電泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)4、脈沖凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)5、連續(xù)型逆向色譜電泳(continuouscounteractionchromatographicelectrophoresis，CACE)6、介體電泳(preparativeelectrophoresis)7、溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis）電泳技術(shù)的拓展1、免疫電泳(immunoelectroph111雙向電泳圖譜正常小鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)組的雙向電泳人胃癌SGC7901細(xì)胞蛋白質(zhì)組的雙向電泳第一向：PAGE等電點聚焦（IEF），第二向：SDSPAGE雙向電泳圖譜正常小鼠結(jié)腸組織蛋白質(zhì)組的雙向電泳人胃癌SGC7112連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽極陰極目標(biāo)產(chǎn)品富集區(qū)填料（排阻區(qū)）填料（嵌入?yún)^(qū)）凈速度電泳色譜凈速度電泳目標(biāo)蛋白的遷移情況連續(xù)型逆向色譜電泳(CACE)分離原理示意圖

載液色譜陽113三、離心技術(shù)

1．離心機(jī)類別