基因打靶技術及研究進展

2007諾貝爾獎專題

王廷璞瑞典卡羅林斯卡醫學院10月８日宣布，２００７年諾貝爾生理學或醫學獎授予來自美國的馬里奧·卡佩奇、奧利弗·史密斯和來自英國的馬丁·伊文思因胚胎干細胞研究獲該獎項。

這三位科學家是因為“在涉及胚胎干細胞和哺乳動物DNA重組方面的一系列突破性發現”而獲得這一殊榮的。這些發現導致了一種通常被人們稱為“基因打靶”的強大技術。這一國際小組通過使用胚胎干細胞在老鼠身上實現了基因變化。

馬里奧·卡佩奇馬丁·埃文斯奧利弗·史密斯

基因打靶：是利用同源重組技術來定點改變物種的基因組順序和結構，從而在突變的個體內來研究基因及基因組的功能。基因敲除：是使基因組中某個/某幾個基因或基因的順式元件產生缺陷，從而在突變體內喪生正常的功能，來推測這些基因或元件原來在體內的功能。基因敲入：在個體基因組中定點加入某個/某幾個基因或順式元件，使之表達或發揮作用，從而研究該基因或順式元件在體內的功能。

基因打靶流程圖一、基因打靶研究的背景目前的基因轉移技術，如顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀及逆轉錄病毒載體感染等方法，已能有效地將外源基因導入靶細胞內。但這些導入的外源基因在靶細胞基因組中整合的位點一般是隨機的，可能導致下面幾種情況出現：為避免上述情況的出現，最好的途徑就是將外源基因導入預先確定的位點。即對細胞內靶位點進行定點修飾——基因打靶，而研究該基因的功能或在生物發育中的作用。隨著人類及四十多種微生物基因組測序的完成，發現了大量未知功能的基因，應用基因打靶技術對這些新基因進行靶向修飾，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成為繼基因轉移技術后亟待發展的新技術。早在20世紀初，Morgan等人通過對果蠅眼色遺傳的分析揭示了同源染色體之間的DNA重組是產生交換的基礎。1985年在哺乳動物細胞中實現了同源重組。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發生同源重組，整合至受體細胞基因組中并得以表達的一種外源DNA導入技術。胚胎干細胞注入體內與完整胚胎形成嵌合體后，可以發育形成包括生殖細胞在內的一系列成體組織；正是由于胚胎干細胞的特殊功能，ES細胞基因打靶技術已被廣泛地應用于建立轉基因動物之中。從80年代到90年代初，小鼠ES細胞基因打靶技術已發展到成熟階段。1984年，Bradly等成功地用顯微注射法將ES細胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，獲得生殖系嵌合體，經過適當的交配，獲得了源于ES細胞系的純系小鼠。此實驗首次證實體外培養的ES細胞能在體內分化發育成生殖系嵌合體并可獲得小鼠純合體子代。1987年，人們利用ES細胞技術建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的動物模型。此后，這項技術得到了普遍應用和長足發展。三、打靶載體的構建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標記基因等非同源序列，其中同源序列是同源重組效率的關鍵因素。基因打靶載體有基因插入型載體(Gene-insertionvector)和基因置換型載體(Gene—replacementvector)。插入型載體中與靶基因同源的區段中含有特異的酶切位點，線性化后，同源重組導致基因組序列的重復，從而干擾了目標基因的功能。置換型載體進行線性化的酶切位點在引導序列和篩選基因外側，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數基因敲除突變都采用置換型載體進行基因打靶。四、外源DNA導人的方式外源DNA導人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉錄病毒法等。目前應用最廣的是顯微注射法。Capecchi報道，用顯微注射法導入可得到很高的轉染效率，占接受外源DNA細胞的10％~20％，但顯微注射每次只能注射一個細胞，而電穿孔法可同時使許多細胞得到轉染。Mansour等研究發現電穿孔可使1％的ES細胞穩定轉染。逆轉錄病毒載體法利用某些病毒與組織細胞有特異的親合力，可用于時空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發展潛力。五、基因打靶的篩選方法（1）正負雙向選擇系統(positive-negative-selection,PNS)：為了更好地篩選發生同源重組的克隆，1988年Mansour等人設計了PNS,解決了定點整合與隨機整合的鑒別問題。同源重組時，只有載體的同源區以內部分發生重組，同源區以外部分將被切除。隨機整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內。置換型載體含有正負選擇基因各一，正選擇基因多為neo基因，位于同源區內，其在隨機整合和同源重組中均可正常表達。G418是一種氨基糖類抗生素，其結構與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質合成,對原核和真核等細胞都有毒性,包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞,也包括原生動物和蠕蟲。是穩定轉染最常用的選擇試劑。當neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后,則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA,從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達,使細胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養基中生長。Ｇ418的這一選擇特性,已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛應用。用G418作正篩選，選出含有neo基因的細胞株，再用丙氧鳥苷作負篩選淘汰含有tk基因的細胞株，保留未含有tk基因的同源重組細胞株。此方法是目前應用較廣泛的一種策略。正向篩選標記基因Neo具有雙重作用，一方面導致靶基因的插入突變；同時作為重組細胞的正向篩選標志，該基因產物可使細胞在含有新霉素的培養基中生長。除了上述方法外，還可用PCR及Southern雜交法進一步篩選及鑒定中靶細胞。（2）正相選擇法（positiveselectionmethod）麻省理工學院Sharp教授的研究組獨辟新徑，建立了一種新的同源重組選擇方法—正相選擇法。這種選擇法適用于在靶細胞內正常表達的基因的定點突變。其主要程序是：將選擇標記基因neor的啟動子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點同源的序列內，將打靶載體轉染進靶細胞，可能出現下面幾種情況：①打靶載體不整合入靶細胞基因組，將隨傳代而丟失；②外源打靶序列隨機整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動子和起始密碼，整合位點周圍亦無啟動子，使neor基因的表達受阻；③雖是隨機整合，但其整合位點側翼序列在其它基因的啟動子能啟動neor基因的表達；④外源打靶載體與靶位點發生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密碼的作用而呈現表達活性。因此，如用G418篩選，則抗性細胞中將只包含后兩種可能情況，根據這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測出同源重組的克隆。六、基因打靶的策略（一）完全基因剔除(completeknotk-out)的策略在ES細胞中進行基因打靶最常用的策略依然是使用PNS載體。借助于陽性選擇標記基因通常被插入靶基因功能最關鍵的外顯子中，或通過同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實行靶基因的完全剔除。陽性選擇標記基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），將其以正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基因外，通過分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表達的時空順序。lacZ基因5’端若攜帶內源核糖體插入位點(internalribosomalentrysites，IREs)，則lacZ基因的插入會不受時相的控制而得到正確的翻譯。此外，由于陰性選擇基因(多為tk基因)可能在轉染及整合過程中失活，導致打靶載體隨機整合的ES克隆得以生長，因而PNS載體依然得到較多隨機整合的ES克隆。（二）大規模隨機基因剔除—基因捕獲(genetrapping)用常規方法進行基因打靶，必須針對靶位點在染色體組文庫中篩選相關的染色體組克隆，需耗費大量的時間和人力。利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫，節省大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體的工作及費用，更有效和更迅速地進行小鼠染色體組的功能分析。典型的基因捕獲載體包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo基因。neo基因插入到ES細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉錄調控元件實現表達的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養基中篩選出來。從理論上講，在選擇培養基中存活的克隆應該100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側翼cDNA或染色體組序列分析來獲得。用基因捕獲法在單次實驗中可以獲得數以百計的帶有單基因剔除的ES克隆。但此方法的缺點是只能剔除在ES細胞中表達的基因。隨著應用哺乳動物體細胞克隆新個體的成功實現。在體細胞中應用基因捕獲剔除更多在發育晚期才表達的基因，其后通過核移植技術獲得帶有突變基因的動物個體、這不失為一種可以彌補以上缺陷的辦法。此外用基因捕獲法進行基因剔除的另一個缺點是無法對基因進行精細的遺傳修飾。（三）精細突變的引入人類疾病中許多是由于基因功能喪失引起的，也有許多是由于基因過表達或功能獲得（gainoffunction）引起的。對后者就無法用基因剔除的方法獲得相應的疾病模型。為此，研究者發明了各種可以將諸如插入終止密碼子或替換某個氨基酸之類的精細突變引入小鼠基因組中的方法。早期的研究者采用的方法主要有兩種，一是將不含選擇標記基因的打靶載體直接經顯微注射法引入ES細胞，然后用PCR分析鑒定同源重組克隆；另一種是用帶有精細突變但無選擇標記基因的打靶載體與僅含標記基因的載體經電穿孔共轉染ES細胞。這兩種方法在技術上有很大局限性，現在基本上已不再使用。目前較為常用的方法主要有“HitandRun”、“TagandExchange”以及基于重組酶系統的方法。（1）打了就走策略(HitandRun法)HitandRun法，也稱進退策略。這一方法包括兩次同源重組：第一步（Hit）用插入型載體進行同源重組，這樣會在靶位點插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個篩選標記（如正篩選標記基因neo和負篩選標記基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性篩選，富集為數不多的發生了染色體內重組的克隆。染色體內重組去除了含有負篩選標記基因的載體序列，由于負篩選標記基因的消失，細胞就恢復了對負篩選藥物的抗性，因此，回復突變體可以在負選擇培養基中存活下來。為了便于應用Southern方法對中靶克隆進行篩選，可對靶基因突變位點的相鄰核苷酸進行改造，產生一個新的限制性內切酶位點而不影響相鄰氨基酸的組成。有時可以通過改變堿基組成使突變基因序列和野生型基因序列間的差異達到最大，以便于用不同的PCR引物檢出突變基因和野生型基因。Hasty等用此方法在小鼠ES細胞同源異型基因簇Hox-2.6基因3’端引入了一個終止密碼子，得到了減少43個氨基酸的突變蛋白。HitandRun法的不足之處是：第一，此過程中第二步染色體內的同源重組無法精確地控制，可能會導致失去攜帶突變的同源序列，而留在基因組中的仍是未修飾的內源片段。第二，整個過程需要采用兩種培養基分別進行先后兩次篩選。第三，無法同時引進多個位點突變。另一類采用置換型載體進行基因打靶、將突變經過兩次同源重組引入靶基因的策略部分地彌補了這些缺陷。（2）雙置換法(DoubleReplacement)最早提出這一設想的研究者稱其為“In-Out”法。第一步用含有Hprt基因的打靶載體轉染Hprt–ES細胞，由于Hprt基因雙側是靶基因的同源序列。通過在HAT培養基中篩選并用PCR進行基因組分析，篩選發生同源重組、Hprt基因整合到基因組中的陽性克隆。第二步，用只攜帶突變同源序列的打靶載體轉染第一步獲得的Hprt+ES細胞。同源重組發生后，突變序列整合入基因組，Hprt被置換出來。Hprt–細胞可在6-GT培養基上篩選并用PCR進行分析。這種方法的優點在于，第一步獲得的Hprt+ES細胞，除了可用于產生普通的基因剔除小鼠外，更可作為將不同突變引入靶基因的基礎。1995年，Moore等將這種方法稍加改進，稱其為“雙置換法”（doublereplacement）。他們用這種方法將5種突變分別引入Prion蛋白基因，探討研究人類Prion蛋白相關疾病及其基因治療的可能性。（3）“標記和置換”法(TagandExchange)“標記和置換”的策略與雙置換法有許多共同之處。它是用兩個不同的置換型載體進行兩次連續的基因打靶完成的。通過第一步的同源重組插入正負篩選標記基因（如neo和tk）對靶基因進行“標記”。第二步打靶用在同源序列上帶有精細突變的載體來轉染第一步得到的ES克隆，帶有精細突變的同源序列將置換下被“標記”的靶基因。Askew等用標記和置換法成功地將ES細胞內源的Na+-K+-ATP酶基因改變了兩個氨基酸，使其既能維持轉膜運輸的離子泵功能，又能抵抗強心類糖苷的抑制作用。（4）利用Cre-LoxP系統引入點突變近年來，導入精細突變最常用的方法應首推以Cre-LoxP為基礎的重組系統。Cre-LoxP位點特異重組酶是由酵母或細菌所編碼、可識別特異靶位點并在其上催化斷裂和重接、從而產生精確的DNA重組的一類酶。根據序列相似性，重組酶可分為Int家族（integrasefamily）和resolvase-invertasefamily。Cre是來源于P1噬菌體cre基因所編碼的一個38ku蛋白，屬于Int家族，它可識別P1基因組上由34bp核苷酸序列構成的稱為LoxP的特異靶位點，并根據Loxp的方向性，可在各種底物（超螺旋環狀型，松弛型和線型DNA分子）上介導三種不同的重組事件：①相位點之間序列的缺失；②插入序列；③兩個反向位點之間序列顛倒。需指出的是，Cre重組酶所催化的是一個可逆的重組事件，重組的程度與重組酶的表達水平相關。此外在位點特異重組反應的任何階段上，不需要任何輔助因子參與；該特點使Cre/LoxP位點特異重組酶系統成為可在各類種屬上進行意向DNA操作的有用工具。應用Cre-LoxP系統將精細突變導入基因組的策略為：在置換型的打靶載體中，正負篩選標記基因兩側各放置一個LoxP序列，并被置于靶基因的內含子中。攜帶精細突變的外顯子位于載體一側的同源臂上。經過同源重組和突變的鑒定后（如利用新產生的酶切位點來鑒定），通過轉染將Cre重組酶表達質粒導入中靶ES細胞。（四）條件性基因打靶Cre-loxP系統、FLP/FRT系統和條件性基因敲除Cre/loxP：來自P1噬菌體，Cre重組酶基因和loxP序列位于P1噬菌體基因組內，loxP是Cre酶的識別序列。Cre（FLP）重組酶有刪除/整合、倒位、轉位等功能基本策略是通過類似于基因敲除的方法將兩個loxP位點同向引入到要刪除的基因片段兩側。FLP/FRT：來自酵母，FRT是FLT酶的識別序列5’ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT3’3’TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA5’CreCre反向重復序列ATAACTTCGTATATATACGAAGTTATGCATACATCreCreloxP反向重復序列5’ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT3’3’TATTGAAGCATATCGTATGAATATGCTTCAATA5’CreCre+loxP序列及其酶切示意圖“條件性”主要由控制Cre酶產生方法來實現，采用不同時空表達專一性的啟動子來表達Cre酶，就能在小鼠發育的特定階段或特定組織達到某基因敲除的目的。條件基因敲除大大開拓了基因敲除的應用范圍，并賦予基因敲除的新的涵義。條件性基因敲除的意義：建立條件性基因敲除需要分三步進行：1、通過同源重組的方法在待刪除片斷的兩側引入同向的loxP位點（此步同ES細胞的打靶，只是載體不同），用Cre的瞬時表達載體轉染ES細胞克隆，在Cre酶下發生DNA重排。2、構建一個在特定組織和發育階段表達Cre酶的轉基因小鼠3、將前兩步獲得的小鼠雜交，在子代小鼠轉篩選特定組織中基因敲除的小鼠。條件性基因敲除的打靶載體和技術流程示意基因敲入基因敲入：用一個設計好的基因片段來取代基因組中的特定片段和將一個設計好的基因片段插入到基因組的特定片段中，這一技術也是建立在Cre－loxP系統基礎上。基因敲入有兩條途徑刪除選擇標記基因：第一條途徑是引入loxP位點的同源重組后，引入Cre基因瞬時表達載體，在ES細胞內瞬時表達Cre，刪除兩個loxP位點之間的序列，然后用該ES細胞建立相應的小鼠品系。第二條途徑是先引入loxP位點的ES細胞建立一個小鼠品系，與一種Cre轉基因小鼠品系雜交，最后建立基因敲入的小鼠品系。基因敲入的打靶載體和技術流程示意條件基因打靶有如下特點：①通過條件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效應的基因的功能以及基因在特定的組織細胞或個體發育特定階段的功能。②通過條件性基因激活，實現轉基因的可控制性表達。③通過Cre切除條件性基因修復(Creexcision-conditionalgenerepair)，進行基因的可修復性敲除，以研究一個基因的多種功能。（五）時空特異性基因打靶完全基因剔除將靶基因自產生時刻起在所有的組織器官中終生滅活。許多在成體器官發育中具有重要功能的基因，如腫瘤抑制基因Brca1、Brca2、Dpc4/Smad4等，由于在胚胎早期表達，基因剔除后往往導致小鼠胚胎早期死亡，使得研究者無法深人探索這些基因在成體中的重要作用。因此可以在特定的時間和空間—即在特定的發育階段和特定的組織細胞中開啟或關閉特定基因的時空特異性基因打靶（spatiotemporalgenetargetingSTGT）技術應運而生。Cre/LoxP和FLP—frt系統的應用使得組織特異性基因剔除變為現實。第1例應用Cre/LoxP系統研制成功的組織特異性基因剔除小鼠是由Gu等人在1994年報道的。構建條件剔除（conditionalknockout）小鼠的打靶載體，常將陽性選擇標記基因置于靶基因的內含子中，并在靶基因重要功能域兩側的內含子中插入方向相同的LoxP序列，因為許多時候選擇標記基因即便被放置在內含子中，也會阻斷靶基因的轉錄。Meyer等人同時應用Cre—LoxP和FLP—frt系統研制了系列fgf8等位基因突變小鼠。fgf8染色體組上的不同區域分別放置了成對的LoxP序列和frt序列，通過與Cre或FLP轉基因小鼠雜交可以分別獲得完全敲除小鼠和條件敲除小鼠。此外，還可通過感染表達重組酶的腺病毒或逆轉錄病毒實現組織特異性的重組。為了達到在時空上調節基因打靶的目的，研究者將Cre基因置于配體或藥物可誘導的啟動子控制下，Kühn等人在1995年報道了Mx1—Cre轉基因鼠的研究，Mxl是一種與抗病毒感染相關的基因，它在健康的小鼠中是不表達的，但可被重組干擾素或干擾素誘導劑pI—PC誘導。另一個常用的系統是四環素調節系統。St-Onge等人證實應用經典的tet系統可實現Cre介導重組的誘導控制，但存在較高的背景Cre重組酶活性。這些研究都是試圖在轉錄水平上來控制Cre重組酶的表達從而達到在特定時段將靶基因剔除的目的。另一類研究則采用在轉錄后水平調節重組酶活性的策略。Feil等人將Cre基因與人雌激素受體突變的配體結合功能域融合，產生的Cre-ERT具有tamoxifen依賴的重組酶活性。他們將融合蛋白置于巨細胞病毒(CMV)的啟動子下研制成功了轉基因小鼠。第1例對Cre重組酶活性真正實現時空上調節的研究是1998年由Schwenk等人報道的。他們應用B細胞特異的啟動子將Cre-ER融合蛋白的表達限制在B淋巴細胞中。B淋巴細胞中Cre介導的重組效率高達80％。（六）染色體組大片段的刪除和重排（1）Cre介導的非同源染色體間的重排

基于Cre-LoxP系統的位點特異性重組可以介導長距離的重組，這種重組已被應用于果蠅和植物，在哺乳動物中也取得成功。Li等用此方法成功地將淀粉樣前體蛋白基因（APP）200kb的片段去除。其方法為在第一次打靶的過程中同時將兩個選擇標記基因neo、tk及3’端缺失的hprt基因和LoxP序列引入到靶位點的上游，通過篩選得到neo抗性的陽性克隆。篩到的克隆用于進行第二次打靶，在靶位點的下游引入另一個LoxP序列和5’端缺失的hprt基因，同時引入兩個選擇標記基因hyg和tk基因。中靶的陽性克隆在Cre重組酶的存在下發生重組將tk基因去除，將對FIAU產生抗性。同時，兩端部分缺失的hprt基因在染色體上重新組成有功能的hprt基因，使該克隆能在含HAT的培養基中存活。具體的實施過程有兩種策略：一種是通過兩次打靶分別將兩個LoxP位點引入靶位點。中靶的克隆轉染表達Cre酶的質粒，去除兩個LoxP位點之間的序列；另一種是第一次中靶的克隆直接轉染第二次的打靶載體和Cre酶表達質粒，直接篩選最終中靶的克隆。兩種方法都得到了嵌合體小鼠。Justice等用此系統研制了攜帶毛色基因標記的染色體組大片段缺失的突變小鼠。（2）Cre-LoxP介導的姐妹染色體間的重排哺乳動物細胞中有相當數量的基因是多拷貝的，這些多拷貝的基因在染色體上排列在一起形成基因簇。基因簇中的基因具有相同或相似的功能。用基因打靶的方法研究這些基因的功能必須使這些基因同時產生突變。如果基因簇內的各基因的遺傳距離較大，可以分別在每一個拷貝上引入突變，通過子代的雜交獲得每個拷貝同時帶有突變的個體。但當基因簇內的各基因間的距離很小時，染色體交換的頻率非常低，無法通過子代雜交獲得各拷貝同時帶有突變的個體。用Cre-LoxP系統可以實現這一目的。具體的實施策略是將兩個LoxP序列通過同源重組分別引入到兩個基因中去，得到兩個分別帶有LoxP序列的小鼠品系。兩個品系雜交，就會得到在兩條姐妹染色體上同時帶有LoxP序列的小鼠，再和表達Cre酶的第三個小鼠品系雜交便可獲得兩個拷貝同時刪除的子代。Matsuaka等將編碼腎素基因簇內的兩個基因ren1和ren2用此方法同時滅活獲得了成功。Cre介導的非同源染色體間的重排

人類的許多遺傳疾病是由于染色體的易位引起的，應用Cre-LoxP系統成功地建立了相應的動物模型。其原理是，將LoxP序列分別引入到非同源染色體上，在Cre酶的存在下誘導非同源染色體之間的重組。VanDeursen等通過兩次連續的基因打靶將兩個LoxP序列分別引入到小鼠ES細胞的13號染色體的DEK和2號染色體的Can基因中，兩次中靶ES細胞轉染超螺旋結構的編碼Cre重組酶的質粒，得到了染色體易位的ES細胞。（七）誘導性基因打靶（1）誘導性基因打靶原理

它主要由Cre/loxP及誘導系統組成。Cre／loxP系統由重組酶Cre和該酶的特定作用位點loxP組成，其中的重組酶Cre可誘導LoxP所在的DNA發生缺失、插入、重復、倒位和易位等多種形式的基因突變或染色體畸變。誘導性基因打靶就是以該系統為基礎、利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制、或利用Cre基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性、從而在loxP動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因打靶技術。（2）誘導性基因打靶的類型根據所用誘導劑的種類，誘導性基因打靶可分為四環素誘導型、干擾素誘導型（二者所用誘導劑為控制Cre基因表達的啟動子活性的活化物)和激素誘導型(所用誘導劑為Cre酶活性的激活物)等幾種類型。以Cre／loxP系統介導的位點特異性重組為基礎的誘導性基因打靶術的優勢：①誘導基因突變的時間可人為控制；②可避免因基因突變而致死胎的問題；③在2個loxP位點之間的重組率較高；④如用病毒或配體/DNA復合物等基因轉移系統來介導Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過程。（八）基因敲入（GeneKnockin）通過基因打靶，用一種基因替換另一種基因以便在體內測定它們是否具有相同功能。也可通過該技術進行靶向基因治療。與基因敲除不同之處在于：設計載體時將靶基因第一外顯子N端缺失并將新的替換基因置于靶基因的調控序列之下。七、基因打靶的影響因素基因打靶的效率是指可檢測到的細胞中發生同源重組的細胞數與轉染的細胞總數之比，又稱同源重組效率。基因打靶效率在不同的研究報道中變動范圍較大，其波動性來自較多的影響因素。(1)打靶載體的影響打靶載體中同源序列是決定同源重組效率的關鍵因素，Thomas和Capecchi研究表明，當載體同源序列長度從4kb增加至9kb時，基因打靶效率增加10倍，與此同時，非同源重組效率增加40倍。Zimmer等用顯微注射法將含20kb同源重組序列的載體插入小鼠基因組，破壞了Hox1.1基因，其效率是1/150。Hasty等研究發現，同源序列達一定長度后，繼續的增加對同源重組效率不產生顯著影響。(2)外源DNA導入方式的影響目前，外源DNA導入的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉錄病毒感染法。不同的導入方法對同源重組效率有明顯影響。目前應用最廣的是顯微注射法，用顯微注射法導入可得到很高的轉染率，占接受外源DNA細胞的10~20%，但顯微注射每次只能注射一個細胞，而用電穿孔法可同時使許多細胞得到轉染，可使1%的ES細胞穩定轉染。1993年，Squires等利用精子載體法制作轉基因雞，其陽性率為15~25%。近年，精子載體法研究在不斷的進行，影響DNA與精子結合的因素可能是獲得成功的一個關鍵因素。而逆轉錄病毒載體法利用某些病毒對某些組織具有特異的親合力，在人類疾病的基因治療方面顯示了良好的發展潛力。(3)靶基因的影響早期研究缺陷型標記基因時發現整合標記基因的同源重組效率與它在基因組中的插入位置有關，說明基因組中的不同區域對同源