高級植物生理實驗報告

植物營養(yǎng)農學院農藥學東保柱20132020542013年12月27日實驗1植物組織銨態(tài)氮含量的測定（茚三酮比色法）一、實驗原理植物吸收的氮主要是氨態(tài)氮和硝態(tài)氮，后者經過還原過程形成氨，前者經同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白質。測定氨態(tài)氮的方法有多種，本實驗為改良的茚三酮比色法。a-氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱，經氧化脫氨變成相應的a-酮酸，酮酸進一步脫羧變成醛，水合茚三酮則被還原，在弱酸環(huán)境中，還原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反應，縮合生成藍紫色物質。根據藍紫色的深淺，在580nm波長下測定吸光值。本實驗中在茚三酮試劑中添加乙二醇并補加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不穩(wěn)定性。二、儀器設備研缽、燒杯、漏斗、量筒、具塞試管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴鍋、可見分光光度計三、 試劑10%醋酸（lOOmL）1%抗壞血酸（lOOmL）5口g/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至lOOOmL）pH5.4醋酸緩沖液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀釋至lOOOmL）加41.2mLO.2mol/L醋酸鈉（醋酸鈉16.4g或三水醋酸鈉27.2g配成lOOOmL）。水合茚三酮試劑：l.lg茚三酮放到燒杯中，加入15mL正丙醇，搖勻，溶解，后加入3Oml正丁醇和6Oml乙二醇，混勻，再加9mLpH5.4醋酸緩沖液，混勻。保存于棕色瓶中，冰箱保存，適用期限1O天。四、 操作步驟標準曲線的繪制以下表所示量從5ug/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分別取溶液并在每個試管中加蒸餾水至2mL，對照加2mL蒸餾水，后在各試管中加入3mL水合茚三酮試劑和O.lmL1%抗壞血酸，搖勻。蓋上試管塞，于沸水中加熱15分鐘，取出后攪拌冷卻15分鐘。冷卻后的有色溶液中加無水乙醇至10mL，在波長580nm處測吸光值，以銨態(tài)氮濃度（ug/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。試管號1234567試劑（mL）00.20.40.81.21.61.8銨態(tài)氮濃度（ug/mL）00.512345稱取0.5g新鮮植物材料，放入研缽中，加入5mL10%醋酸，研磨后以蒸餾水稀釋至100mL，混勻，通過濾紙過濾，棄去最先濾下的一部分濾液后過濾到100mL三角瓶中。從剩下的濾液中取2mL放入試管中，加3mL水合茚三酮試劑和0.1mL1%抗壞血酸，搖勻。蓋上試管塞，于沸水中加熱15分鐘。同時將盛有對照溶液（提取液用蒸餾水代替）的試管加熱。取出后攪拌冷卻15分鐘。加熱形成的紅色茚三酮試劑被氧氧化而褪色，茚三酮與氨基酸形成的藍紫色反應產物仍然存留并變得更加鮮明。冷卻后的有色溶液中加無水乙醇至10mL，混勻。在波長580nm處測光密度值，根據標準曲線查得數值代入以下公式計算銨態(tài)氮含量。樣品c值：1.436、1.435、1.436、1.435（0.1X10XC）X（100g樣品中的氨態(tài)氮毫克數）= X100（2Xn）C：比色液中氨態(tài)氮濃度（Ug/mL）10：比色液體積（mL）n：樣品重量（g）100：分析溶液總體積（mL）0.1：ug換算成mg并折算成100g物質中含量的換算系數。實驗2植物體內硝態(tài)氮含量的測定一、原理在濃酸條件下，N0-與水楊酸反應，生成硝基水楊酸。生成的硝基水楊3酸在堿性條件下(pH12)呈黃色，最大吸收峰在波長410nm處，可直接比色測定。二、儀器和設備分光光度計、天平、刻度試管、移液器、移液管、容量瓶、漏斗、水浴鍋、濾紙三、試劑500mg/LNO—N標準溶液:稱取KN00.3611g溶于蒸餾水中，定容至lOOmL。335%水楊酸-硫酸溶液：稱取5g水楊酸溶于lOOmL濃硫酸中，攪拌溶解后，貯藏于棕色瓶中。3.8%NaOH溶液：8.695gNaOH溶于lOOmL蒸餾水中。四、方法標準曲線的制作吸取500mg/LNO—N標準溶液0,1,2,3,4,6,8mL分別放入50mL3容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，使之成為0、10、20、30、40、60、80mg/L的系列標準溶液。吸取上述系列標準溶液0.1mL，分別放入刻度試管中，以0.1mL蒸餾水代替標準溶液作空白。再分別加入0.4mL5%水楊酸-硫酸溶液，搖勻，在室溫下放置20分鐘后，再加入8%NaOH溶液9.5mL，搖勻冷卻至室溫。顯色液總體積為10mL。以空白作參比，在410nm波長下測定光密度。以NO-N濃度為橫坐3標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線并計算出回歸方程。硝酸鹽的測定(1)樣品液的制備：取2g植物材料切碎后放入刻度試管中，加入10mL蒸餾水，封口。置于沸水浴中提取30分鐘，冷卻，將提取液過濾到25mL容量瓶中,并反復沖洗殘渣，最后定容至刻度。（2）樣品液的測定：吸取樣品液O.lmL分別放入刻度試管中，加入5%水楊酸-硫酸溶液0?4mL，混勻后置室溫下20分鐘，再慢慢加入9.5mL8%NaOH溶液,待冷卻至室溫后以空白作對照，在410nm波長下測定光密度值。在標準曲線上查得或用回歸方程計算出NO--N濃度，再用以下公式計算其含量。3NO—N含量（mg/g）=（DX樣品液總量）/樣品鮮重3D：標準曲線上查得NO—N濃度（mg/L）