1、關(guān)于基因工程基本流程篩選與鑒定第1頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四21. 抗藥性篩選法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點Pst I。基于載體遺傳標記的篩選與鑒定 原理：第2頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四3第3頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四4第4頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四5（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：pBR322抗生素標記選擇產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指

2、示液（I2-KI-Ampicillin）（藍灰色）褪色。抑制細菌生長，但不殺死細菌。殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。（3）環(huán)絲氨酸：第5頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四6選擇過程如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活第6頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四7無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基第7頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四8（

3、2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。第8頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四92. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍+深藍色原理載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG誘導(dǎo)表達。 載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶。第9頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四10選擇過程第10頁，共56

4、頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四11-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍色產(chǎn)物。第11頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四123. 營養(yǎng)缺陷型篩選法原理載體能夠合成某些生長必須營養(yǎng)成分，受體菌基因突變不能合成這種生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)。在缺少該營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)板上涂布細菌，長出的菌落均含有載體的，是否重組子需進行第二輪篩選。第12頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四13選擇過程營養(yǎng)缺陷型受體營養(yǎng)合成型載體第13頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四144. 噬菌斑篩選法原理以-DNA為載體的重組DNA分子經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)染受體，轉(zhuǎn)化子

5、在培養(yǎng)板上形成噬菌斑。取代型載體，噬菌斑即為重組子；插入型載體需進行二次選擇第14頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四15選擇過程第15頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四16基于克隆片段序列的篩選與鑒定1. PCR鑒定法 原理：針對已知目的片段特異性擴增。包括：區(qū)分重組子與非重組子、期望重組子與非期望重組子、目的片段是否整合在受體基因組上。PCR鑒定法不適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)化子的鑒定。第16頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四17選擇過程1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或基因組DNA）2）用相應(yīng)引物進行PCR反應(yīng)3）電泳PCR產(chǎn)物4）檢查是否有

6、PCR產(chǎn)物5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致原理圖p58第17頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四182. Southern blot雜交 原理：從宿主細胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用特異性探針（與目的基因同源）進行核酸雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。第18頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四19選擇過程Southern blot流程第19頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四203. 菌落/噬菌斑原位雜交 原理：特異性探針（與目的基因同源）進行的核酸原位雜交第20頁，共56頁，2022年，5月

7、20日，8點14分，星期四21探針的制備及標記，p60選擇過程第21頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四224. R-環(huán)檢測法 原理：DNA-RNA雜交：外源基因的mRNA與重組載體雜交第22頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四23選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。第23頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四24缺點：需要電鏡第24頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四255. Northern blotting 原理：

8、從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。檢測表達載體。第25頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四26選擇過程Northern blot流程第26頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四276. 直接電泳檢測 原理：有插入片段的重組載體分子量比野生型載體分子量大第27頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四28選擇過程從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。分子量 Marker載體重組克隆第28頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四297. 限制性酶切圖譜法限制性酶切圖譜：核酸經(jīng)限制性內(nèi)切酶

9、消化成片段，用電泳方法分離，不同的核酸形成的各自獨特的條帶圖譜。第29頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四30在外源片段大小及限制性酶切圖譜已知的條件下，選擇一兩種內(nèi)切酶切割載體，電泳后比較電泳結(jié)果(DNA條帶數(shù)目和分子大小）差異進行區(qū)分。或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。 原理：第30頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四31ABA或B第31頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四32不同克隆的酶切結(jié)果第32頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四33選擇過程第33頁，共

10、56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四348. DNA序列測定 原理：通過對插入片段序列的測定確定是否是所需的重組子第34頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四35選擇過程雙脫氧末端終止法化學降解法焦磷酸降解法高通量Solexa測序第35頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四36第36頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四37基于外源基因表達產(chǎn)物的篩選與鑒定1. 蛋白質(zhì)功能檢測 原理：外源基因編碼具有特殊功能的酶或活性蛋白，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，針對該表達產(chǎn)物設(shè)計相應(yīng)的檢測方案針對表達載體的檢測方法第37頁，共56頁，2022年

11、，5月20日，8點14分，星期四38待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標記的二 抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗125I標記的二抗固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標記的二抗 結(jié)合蛋白125I標記的二抗第38頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四39選擇過程彌補缺陷轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長第39頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四40例：小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。D

12、HFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長2) 增加新性狀使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。第40頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四3) 酶活性檢測針對外源基因表達產(chǎn)物是酶。擴散免疫沉淀檢測分泌型產(chǎn)物原理：抗原抗體凝集反應(yīng)方法：把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當插入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。第41頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四42對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。第42頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四43

13、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）原理：一抗（primary antibody）：與目標分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linked）二抗： 攜帶能催化無色底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩镔|(zhì)（或發(fā)光）的酶，再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標分子的含量。第43頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四44待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶 第44頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四45方法：固定樣品一抗結(jié)合二抗結(jié)合顯色/發(fā)光反應(yīng)比色第4

14、5頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四462. 放射免疫原位檢測利用抗體作為“探針”原位檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。蛋白蛋白雜交 原理：第46頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四47選擇過程第47頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四483. western blotting蛋白蛋白雜交 原理：選擇過程western blot過程第48頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四49多抗Blotting結(jié)果單抗blotting結(jié)果第49頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四504. 蛋白

15、凝膠電泳待篩選克隆與非重組子同時進行蛋白質(zhì)電泳，電泳結(jié)束后通過染色對比相應(yīng)條帶辨識重組子。適合受體蛋白表達種類較少，外源基因高效表達的體系。 原理：第50頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四51選擇過程SDS，染色不適于篩選第51頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四525.轉(zhuǎn)譯篩選法 借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。 原理：第52頁，共56頁，2022年，5月20日，8點14分，星期四53選擇過程mRNA無細胞翻譯系統(tǒng)35S標記的 甲硫氨酸翻譯35S標記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性 帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？第53頁，共56頁，2022年，5月20日，8點