1、(19)(12)(21)申請(qǐng)?zhí)?(22)申請(qǐng)日 (71)申請(qǐng)人 地址 2015166988(72)發(fā)明人 劉國(guó)趙胡衛(wèi)錢曉(74)專利代理機(jī)構(gòu) 公司 代理人 (10)申請(qǐng)公布號(hào) CN 102808005 (43)申請(qǐng)公布日 C12P7/66C12R1/07權(quán)利要求書 1 頁(yè)權(quán)利要求書 1 頁(yè) 說(shuō)明書 5(54)1 1 5(57)CN 102808005 菌生產(chǎn)維生素 K2K2的納豆芽孢桿菌 BS-53 與生長(zhǎng)速度快但維生素 K 產(chǎn)量低的納豆芽孢桿菌 CICC10262 進(jìn)行原生質(zhì)體融生產(chǎn)維生素 K2，并用異丙醇和正己烷來(lái)提取分離K2K2規(guī)模化生產(chǎn)提供了有效方CN 102808005 2 PAGE

2、 22 PAGE 2CN 102808005 CN 102808005 1/1K2BS-5BS-53CICC10262BKU-6BUK-620ml5%100mlK2K212納豆芽孢桿菌 BS-5如權(quán)利要求 1 所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素 K2 豆芽孢桿菌 BS-5 突變體 BS-53 原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌 CICC10262 原生質(zhì)體之間采用電如權(quán)利要求 1 所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素 K2 1%0.5% 0.5%0.5%如權(quán)利要求 1 所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素 K2 3712h。12發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量百分比的組分 5%3%0.6g/L2HPO4 0.3mol/LCa

3、C22H2O 0.1g/LMgS047H2O 0.3g/L如權(quán)利要求 1 所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素 K2 374d。如權(quán)利要求 1 所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素 K2 丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為 1 2處理方式為在搖床上以 220r/min10minK2。如權(quán)利要求 1 所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素 K2 15min8000rmp。說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 3說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 3/53 PAGE 33 PAGE 3K20001 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)維生素K2K20002 K（MK素或抗出血維生素。維生素 （MK可分為兩大類

4、一類為脂溶性化合物 K1K2 和 K3可在動(dòng)植物體內(nèi)提另一類為水溶性化合物 K4人工化學(xué)合成。最重要的為 K1K2 和 K3商品用維生素K是維生素K3的衍生物。在動(dòng)物體內(nèi)具有生物活性的是K2而維生素K1 和K3需要K20003 2222KYoshinori TToshiro SK00042060700005 0006MKMKMK-7MK2HPO4MKMK-4K2HPO4MgSO42HPO4。K2說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 4說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 4/54 PAGE 44 PAGE 4本發(fā)明的目的在于提供一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2K2K2一種利用納豆芽孢

5、桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法其特征在于它包括如下步驟： （1質(zhì)體融合后篩選獲得的高產(chǎn)菌株BKU-6；（25%100mlK20015 BS-50016 BS-5BS-53CICC102620017在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所述種子培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基它包括如下質(zhì)量百分比的組分蛋白胨1%葡萄糖0.5%酵母粉0.5%牛肉膏0.5%和NaCl0.5%余量為水。 0018在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所述恒溫培養(yǎng)的溫度為37時(shí)間為12h。0.3g/L370021 比為1 2處理方式為在搖床上以220r/min 的速度震蕩10min用于提取納豆芽孢桿菌發(fā)酵K2。0022 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述離心處理的離心時(shí)間為 1

6、5min，離心速率為 0023 2生素2BS-53KCICC102622K22K20024 0025 說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 5說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 5/55 PAGE 55 PAGE 5K20027 （1用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262BKU-60028 （2納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復(fù)合后接種于20ml的種子培養(yǎng)液中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，5%100ml0029 （3）0030 （4）K2K20031 BS-5CICC10262BS-5KCICC 10262MKBS-5MK0032 BS-5BS-53 原生質(zhì)體和納豆

7、芽孢桿菌CICC102620033 1%0.5%0.5%NaCl0.5%3712h。0034 5% 3% 0.3g/L374d。0035 12理方式為在搖床上以 220r/min 的速度震蕩 10min用于提取納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中的維生K2。 15min0037 0038BS-5 和CICC1026237恒溫培18-24h4保存。0039 （30/250ml37120r/min48h取種子培養(yǎng)液5%的接種（v/v接入到液體培養(yǎng)基（30/250ml37120r/min BS-2-31108/mL0041 15mL9cm外燈 (20W) 的垂直距離為 30cm在紫外燈下照射 45s連續(xù)處理兩代將菌

8、液涂布于抗性3724h0042 BS-5BS-529ml,1ml,說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 6說(shuō)明書CN 102808005 PAGE 6/56 PAGE 66 PAGE 6100ug/ml3730min8000r/min10min3724hBS-53BS-53CICC102622CICC1026220mL372h10min1h3000r/mim10min2SMM 37長(zhǎng)前加入青霉素 2U/mL 繼續(xù)培養(yǎng)約 2h取菌10min棄去上清用磷酸緩沖液（SMM40min時(shí)間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質(zhì)體生當(dāng)鏡檢有 90% 的原生質(zhì)體形成3000R/mim10minSMM2SMM0045 BS-53CICC102622ml1:1SMM2(3500r/min10min)108/ml1cm5-10min374d0046 K237200r/min4d選指標(biāo)同時(shí)以出發(fā)菌株作為對(duì)照進(jìn)一步篩選即可獲得MK產(chǎn)量最高的融合菌株BUK-6。 納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)納豆芽孢桿菌BUK-6接種至3L液體完全培養(yǎng)（蛋白1%0.5%0.5%NaCl0.5%180rmp37條件下培養(yǎng)10-12h。5%3%K2HPO4 0.3mol/L，CaCl22H2O 0.1g/