1、第十三章微生物的進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定第一節(jié) 進(jìn)化的測(cè)量指征第二節(jié) 微生物的分類第三節(jié) 微生物的分類鑒定特征和技術(shù)第四節(jié) 微生物的快速鑒定和自動(dòng)化分析技術(shù)第一節(jié) 進(jìn)化的測(cè)量指征20 世紀(jì) 70 年代以前：形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、行為習(xí)性、化石資料。微生物：形體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、缺有性繁殖、化石資料少。20 世紀(jì) 70 年代以來(lái)的新課題：尋找新的進(jìn)化指征一、 進(jìn)化指征的選擇生物大分子序列進(jìn)化特點(diǎn)：進(jìn)化速率相對(duì)恒定 分子計(jì)時(shí)器、進(jìn)化鐘進(jìn)化指征生物大分子序列同源性 選擇要求：普遍存在于所研究的各個(gè)生物類群中；選擇在各種生物中功能同源的大分子相同進(jìn)化來(lái)源；序列線性排列，方便分析比較；根據(jù)生物間進(jìn)化距離選擇

2、不同進(jìn)化速率的分子序列。二、 rRNA 作為進(jìn)化的指征16S rRNA/18S rRNA是最適合的進(jìn)化指征之一；參與蛋白質(zhì)合成，功能必不可少且保持不變；存在高度保守、中度保守和高度變化的序列區(qū)域；相對(duì)分子量大小適中，足夠的信息量，1.5kb普遍存在于真核、原核生物中 古細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)（ 20世紀(jì)70年代，美國(guó)學(xué)者 Woese） 三、 16S rRNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（phylogenetic tree）系統(tǒng)發(fā)育分析：提取基因組得到16S rRNA測(cè)序序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)：概括各種生物間親緣關(guān)系的樹(shù)狀分枝圖。分為：無(wú)根樹(shù)和有根樹(shù)。有根樹(shù)無(wú)根樹(shù)第二節(jié) 微生物的分類微生物分類學(xué)（micr

3、obialtaxonomy）：研究微生物分類理論和技術(shù)方法的學(xué)科。涉及三個(gè)任務(wù)：分類、命名和鑒定；此三部分相互依存又有區(qū)別；分類（classification）：是根據(jù)一定的原則對(duì)微生物進(jìn)行分群歸類，根據(jù)相似性或相關(guān)性水平排列成系統(tǒng)，并對(duì)各個(gè)分類群的特征進(jìn)行描述，以便查考和對(duì)未被分類的微生物進(jìn)行鑒定；命名（nomenclature）：是根據(jù)命名法規(guī)，給每一個(gè)分類群一個(gè)專有的名稱；鑒定（identification or determination）：是指借助于現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通過(guò)特征測(cè)定，確定未知的、新發(fā)現(xiàn)的或未明確分類地位的微生物所應(yīng)歸屬分類群的過(guò)程。一、通用分類單元種以上的系統(tǒng)分類單

4、元界 Kingdom門 Phylum（或Division）亞門綱 Class 亞綱 超目目 Order 亞目 科 Family 亞科 族 亞族 屬 Genus 種 Species種以下的分類單元種是一個(gè)基本分類單位，是一大群表型特征高度相似、親緣關(guān)系極其接近、與同屬內(nèi)其他種有明顯差異的菌株的總稱。一個(gè)種只能用一個(gè)典型菌株作為標(biāo)本模式種。亞種（subspeciers）：種的進(jìn)一步細(xì)分，一般指某一個(gè)特征上與模式種有明顯而穩(wěn)定差別的菌種而又不足以區(qū)分成新種，分成的更小的分類單元。與模式種不同的種常在種名、署名的加詞后寫(xiě)上subsp. ，然后再寫(xiě)具體亞種的加詞；變種（variety）：與亞種同義，現(xiàn)已

5、不用。型（form）：使用中用型作為后綴；表示細(xì)菌菌株，現(xiàn)已作廢；類群（group）：沒(méi)有分類地位非正式地指定一組具有某些共同性狀的生物；培養(yǎng)物（culture）：指一定時(shí)間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長(zhǎng)物；單一微生物細(xì)胞繁殖產(chǎn)生的稱為純培養(yǎng)物（pure culture）一些非正式的類群術(shù)語(yǔ)菌株（strain）：表示任何由一個(gè)獨(dú)立分離的單細(xì)胞繁殖而成的純種群體極其一切后代；實(shí)際上是一個(gè)微生物達(dá)到遺傳性純的標(biāo)志。相（phase）：自然界存在的微生物交互變異的一定階段；態(tài)（state）：通常指微生物的菌落變異狀態(tài)。二、微生物的命名命名（nomenclature）：是根據(jù)命名法規(guī)，給每一個(gè)分類群一個(gè)

6、專有的名稱；每一種微生物都有自己的名字，包括俗名和學(xué)名兩種。（一）俗名普通的、通俗的、地區(qū)性的名字，具有簡(jiǎn)明和大眾化的優(yōu)點(diǎn)，但往往涵義不夠確切，易于重復(fù)，使用范圍局限，不利于國(guó)際交流。例如：“結(jié)核桿菌”Mycobacterium tuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）“綠膿桿菌”Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）；“白色念珠菌”Candida albicans（白色假絲酵母）；“金葡菌”Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）；“丙丁菌”Clostridium acetobutylicum（丙酮丁醇梭菌）；“紅色面包霉”Neurospora cr

7、assa（粗糙脈孢菌）。（二）學(xué)名一個(gè)菌種的科學(xué)名稱，用拉丁詞或拉丁化的詞組成。在出版物中應(yīng)排成斜體字，在書(shū)寫(xiě)或打字時(shí)，應(yīng)在學(xué)名之下劃一橫線，以表示它應(yīng)是斜體字母。按照國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)，一般采用林奈氏雙名法。 （三）學(xué)名的表示方法1、雙名法 通常由一個(gè)屬名加一個(gè)種名加詞構(gòu)成。屬名詞首需大寫(xiě)，種名加詞字首需小寫(xiě)。未確定種名或不指特定的種時(shí)，可在屬名后加sp.表示。 例1：大腸埃希氏菌（簡(jiǎn)稱大腸桿菌）Escherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers 1919例2：枯草芽孢桿菌（簡(jiǎn)稱枯草桿菌）Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn

8、 1872例3：結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis（Zopf）Lehmann et Newmann 1896例4：丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum McCoy，F(xiàn)red，Peterson et Hastings 1926例5：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa（Schroeter）Migula 1920例6：金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus Rosenbach 18842、三名法 當(dāng)該種是一個(gè)亞種（subspecies，簡(jiǎn)稱“subsp”，排正體字）或變種（variety，簡(jiǎn)稱“var

9、”，排正體字）時(shí)，學(xué)名就應(yīng)按“三名法”構(gòu)成，即：例1：蘇云金芽孢桿菌蠟螟亞種Bacillus thuringiensis subspgalleria 例2：橢圓釀酒酵母（或釀酒酵母橢圓變種）Saccharomyces cerevisiae varellipsoideus 例3：脆弱擬桿菌卵形亞種Bacteroides fragilis subspovatus（四）科及以上分類單元的命名細(xì)菌目-亞族等級(jí)的分類單元名稱都有固定的詞尾或詞綴目 ales 亞目 ineae科 aceae 亞科 oideae 族 eae 亞族 inae（五）新菌種名稱的發(fā)表 國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志 IJSB 國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微

10、生物學(xué)雜志 IJSEM 其他期刊英文附本送交 另外，在不同國(guó)家的兩個(gè)保藏機(jī)構(gòu)保藏。 發(fā)表時(shí)注明新分類等級(jí)的縮寫(xiě)詞：新目 ord.nov.新屬 gen.nov. 新種 sp.nov.三、微生物在分類學(xué)中的地位對(duì)生物分類的認(rèn)識(shí)發(fā)展過(guò)程：二界系統(tǒng)、三界系統(tǒng)、四界系統(tǒng)、五界系統(tǒng)、六界系統(tǒng)和三域?qū)W說(shuō)（一）兩界系統(tǒng)（亞里斯多德）動(dòng)物界 Animalia：不具細(xì)胞壁，可運(yùn)動(dòng)，不行光合作用。植物界 Plantae：具有細(xì)胞壁，不運(yùn)動(dòng)，可行光合作用。三界：原生生物界 Protista：（E. H. Haeckel,1866年提出） （二）五界系統(tǒng) 魏塔克(Whittaker) 1969年提出的關(guān)于生物分類的五界

11、系統(tǒng):原核生物界 Monera：細(xì)菌、放線菌等原生生物界 Protistae：藻類、原生動(dòng)物、粘菌等真菌界 Fungi：酵母、霉菌動(dòng)物界 Animalia：植物界 Plantae：微生物涵蓋了三界：原核生物界、原生生物界、真菌界五界系統(tǒng)是以細(xì)胞結(jié)構(gòu)分化的等級(jí)以及和光合、吸收、攝食這三種主要營(yíng)養(yǎng)方式有關(guān)的組織類型為基礎(chǔ)的。（三）六界分類系統(tǒng)：1977年由我國(guó)學(xué)者王大吉提出 非細(xì)胞生物 病毒界 動(dòng)物界 高等生物 生物 植物界 真核生物 真核原生生物界 細(xì)胞生物 低等生物 菌物界 原核生物原核生物界 （四）三域?qū)W說(shuō)：從生物進(jìn)化角度分類：古生菌域生物界細(xì)菌域真核生物域所有生物存在一個(gè)共同祖先，由它分三

12、條進(jìn)化路線，就形成了三個(gè)域：Bacteria(細(xì)菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物域)20世紀(jì)70年代，Woese用寡核苷酸序列編目分析法對(duì)60多株細(xì)菌的16SrRNA序列進(jìn)行比較后，驚奇地發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)甲烷細(xì)菌完全沒(méi)有作為細(xì)菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三種形式-古細(xì)菌(archaebacteria)。隨后他又對(duì)包括某些真核生物在內(nèi)的大量菌株進(jìn)行了16Sr RNA(18S rRNA)序列的分析比較，又發(fā)現(xiàn)極端嗜鹽菌和極端嗜酸嗜熱菌也和產(chǎn)甲烷細(xì)菌一樣， 具有既不同其他細(xì)菌也不同于其核生物的序列特征，而它們之間則具有許多共同的序列特征。古生菌（如甲烷球菌）與真核生物親緣關(guān)系

13、更接近古生菌的特性：（1）與細(xì)菌相同部分 為原核生物，無(wú)核膜，核糖體為 70S，mRNA 無(wú)帽化和 poly A，能產(chǎn)生 H2S，能固氮（2）與真菌相同部分 無(wú)胞壁酸，有多種 RNA 聚合酶（3）特殊特性 能產(chǎn)甲烷，無(wú)葉綠素光合作用古生菌在進(jìn)化譜系上與真細(xì)菌及真核生物相互并列，且與后者關(guān)系更近，而其細(xì)胞構(gòu)造卻與真細(xì)菌較為接近，同屬于原核生物。 四、各大類微生物的分類系統(tǒng)綱要（一）原核微生物分類系統(tǒng)（二）真菌分類系統(tǒng)簡(jiǎn)介（一）原核微生物分類系統(tǒng)1、伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology)美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的細(xì)菌學(xué)教授伯杰(D

14、.Bergey)(1860-1937)伯杰氏手冊(cè): 是目前進(jìn)行細(xì)菌分類、鑒定的最重要參考書(shū)，其特點(diǎn)是描述非常詳細(xì)，包括對(duì)細(xì)菌各個(gè)屬種的特征及進(jìn)行鑒定所需做的實(shí)驗(yàn)的具體方法。1923年以來(lái)已出至第九版(1994)；第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)設(shè)立35個(gè)群，將古細(xì)菌部改編為5個(gè)群，全書(shū)描寫(xiě)了約500個(gè)屬。劃分為四大類： 第一類 具細(xì)胞壁的革蘭氏陰性真細(xì)菌 第二類 具細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性真細(xì)菌 第三類 無(wú)細(xì)胞壁的真細(xì)菌 第四類 古細(xì)菌 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)2、伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)第一版 1984年問(wèn)世，至1989年出齊，共

15、4卷。第二版 由George Garrity主編分為5卷，將從2000年起陸續(xù)出版。這一版納入了研究核糖體RNA測(cè)序所產(chǎn)生的發(fā)育分類系統(tǒng)。古生菌界：2門、5 組、8綱、11目、17科、63屬、208種細(xì)菌界：16門、26組、27綱、62目、163科、814屬、4727種（二）真菌分類系統(tǒng)簡(jiǎn)介真菌界分類系統(tǒng)很多，各國(guó)采用不同的系統(tǒng)，比較混亂。Ainsworth et al(1973) V.Arx (1981) 真菌字典（1983）Kendrick (1992) 真菌字典（1995）Alexopoulos&Mins(1996)近年來(lái)為較多人接受的是Ainsworth的綱要： Ainsworth 菌

16、物詞典1966 年第一版，1995 年第八版含原生動(dòng)物界、假菌界（主要黏菌）、真菌界第三節(jié) 微生物的分類鑒定特征和技術(shù)微生物的分類鑒定方法： 1. 經(jīng)典鑒定分類法 2.數(shù)值分類法 3.化學(xué)分類法 4.遺傳分類法 經(jīng)典鑒定分類法個(gè)體:細(xì)胞形態(tài), 大小, 排列方式, 染色, 運(yùn)動(dòng)等形態(tài)特征:菌落形態(tài)營(yíng)養(yǎng)要求:碳源, 氮源, 礦質(zhì)元素生理生化特征:代謝產(chǎn)物種類, 產(chǎn)量, 現(xiàn)色反應(yīng)酶:產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特征生態(tài)學(xué)特征:生長(zhǎng)溫度, 氧需求, 酸堿度, 宿主種類血清學(xué)反應(yīng)噬菌體的敏感性其他 :全細(xì)胞蛋白的分析等數(shù)值分類法測(cè)定100項(xiàng)以上的各種性狀，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行菌株的相互比較，并得出總的相似值。一般認(rèn)為同種微

17、生物菌株之間的相似值80%。數(shù)值分類法（numerical taxonomy） 又稱統(tǒng)計(jì)分類法，現(xiàn)通稱電子計(jì)算機(jī)分類法（computer taxonomy） 依據(jù)數(shù)值分析的原理，借助電子計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)擬分類的微生物對(duì)象按大量表型性狀的相似度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終給予分類的方法化學(xué)分類法細(xì)胞成分 分析內(nèi)容 在分類水平上的作用 細(xì)胞壁 肽聚糖結(jié)構(gòu) 多糖 種和屬 胞壁酸 脂肪酸 膜 極性類脂 種和屬 霉菌酸 蛋白質(zhì) 氨基酸序列分析 血清學(xué)比較 屬和屬以上單位 電泳圖 酶譜 代謝產(chǎn)物 脂肪酸 種和屬 全細(xì)胞成分分析 熱解-氣液色譜分析 種和亞種 熱解-質(zhì)譜分析遺傳分類法1.DNA堿基比例的測(cè)定每一個(gè)微生物物種的

18、DNA中的(G+C)mol%的數(shù)值是恒定的,不會(huì)隨著環(huán)境及培養(yǎng)條件等的變化而變化,而且在同一個(gè)屬不同種之間,GC含量不會(huì)差異太大,具有一定的范圍,因此可以作為判定的微生物間親緣關(guān)系的依據(jù)相同不能說(shuō)明是同種，但不同則肯定不是同種。差別10%不是同種，10%可能是同種。 2. 核酸分子雜交法遺傳分類法3.rRNA寡核苷酸編目分析遺傳分類法一種通過(guò)分析原核或真核細(xì)胞中最穩(wěn)定的rRNA寡核苷酸序列同源行程度,乙確定不同生物間的親緣關(guān)系和進(jìn)化譜系的方法第四節(jié) 微生物的快速鑒定和自動(dòng)化分析技術(shù)1. 微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)（1）API 20 系統(tǒng)：法國(guó) Bio-梅里埃公司生產(chǎn)，有 20 種不同的生化反應(yīng)，可鑒定 700 多種細(xì)菌，分不同系列，如 20A厭氧菌，20E腸道菌（2）Enterotube 系