1、 食品安全國家標準食品中維生素A、D、E的測定范圍本標準規定了食品中維生素A和E的兩種測定方法反相高效液相色譜法和正相高效液相色譜法。本標準規定了食品中維生素D的兩種測定方法液相色譜串聯質譜法和高效液相色譜法。本標準第一法適用于各類食品中維生素A和E的測定，本標準第二法適用于各類食用油、堅果、豆類和辣椒粉等天然食物中維生素A和E的測定，本標準第三法適用于各類食品中維生素D2和D3的測定，本標準第四法適用于各類強化食品中維生素D2或D3的測定。第一法 食品中維生素A和E的測定 反相高效液相色譜法原理試樣中的維生素A及維生素E經皂化、提取、凈化、濃縮后，用高效液相色譜C30或PFP反相柱將維生素A

2、、維生素E的四種生育酚異構體與其他雜質分離，經紫外檢測器或熒光檢測器檢測，外標法定量。試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規定的三級水。3.1 試劑3.1.1 無水乙醇（C2H5OH）：經檢查不含醛類物質，檢查方法參見附錄C。3.1.2 抗壞血酸（C6H8O6）。3.1.3 氫氧化鉀（KOH）。3.1.4 乙醚（CH3CH2）2O）：經檢查不含過氧化物，檢查方法參見附錄C。3.1.5 石油醚（C5H12O2）：沸程為3060。3.1.6 無水硫酸鈉（Na2SO4）。3.1.7 pH 試紙（范圍114）。3.1.8 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.1.9

3、Taka-淀粉酶：活力單位100 U/mg。3.2 試劑配制3.2.1 氫氧化鉀溶液（50g/100g）： 稱取50 g氫氧化鉀，加入50 ml水溶解，冷卻后，儲存于聚乙烯瓶中。3.2.2 石油醚-乙醚溶液（1+1，體積比）：200 mL石油醚，加入 200 mL乙醚，混勻。3.3 標準物質3.3.1 維生素A標準物質：視黃醇（C20H30O ）：純度95 %。3.3.2 維生素E標準物質：a-生育酚（C29H50O2 ）， 純度95%；-生育酚（C28H4802）， 純度95%；-生育酚（C28H4802）， 純度95%；-生育酚（C27H4602），純度95%。3.4 標準溶液配制3.4.

4、1 維生素A 標準貯備溶液（0.500 mg/mL）：準確稱取 25.0 mg維生素A標準物質，用無水乙醇溶解于 50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液濃度約為0.500 mg/mL。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20下避光保存。臨用前將溶液回溫至20，并進行濃度校準（校準方法參見附錄A.1）。3.4.2 維生素E 標準貯備溶液（1.00 mg/mL）：分別準確稱取a-生育酚、-生育酚、-生育酚和-生育酚各50.0m g，用無水乙醇溶解于 50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液濃度約為1.00 mg/mL。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20 下避光保存。臨用前將溶液回溫至20

5、，并進行濃度校準（校準方法參見附錄A）。3.4.3 維生素A和維生素E混合標準溶液中間液：準確吸取維生素A 標準貯備溶液1.00 mL和維生素E 標準貯備溶液各10.00 mL于同一50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中維生素A濃度為10.0 g/mL，維生素E各生育酚濃度為200 g/mL。3.4.4 維生素A和維生素E標準系列工作溶液分別準確吸取維生素A和維生素E混合標準溶液中間液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，該標準系列中維生素A濃度為0.50 g/mL、1.00 g/mL、2.00 g/m

6、L、4.00 g/mL、6.00 g/mL，維生素E濃度為10.0 g/mL、20.0 g/mL、40.0 g/mL、80.0 g/mL、120.0g/mL。儀器和設備注：使用的所有器皿不得含有氧化性物質。分液漏斗活塞表面不得涂油。4.1 分析天平，感量為0.1 mg。4.2恒溫水浴振蕩器。4.3 旋轉蒸發儀。4.4 氮吹儀。4.5 紫外分光光度計。4.6 分液漏斗萃取凈化振蕩器。4.7 高效液相色譜儀，帶紫外或二極管陣列檢測器或熒光檢測器。分析步驟 試樣制備將一定數量的樣品按要求經過粉碎、均質、縮分后，儲存于樣品瓶中，避光冷藏，盡快測定。 試樣處理注：使用的所有器皿不得含有氧化性物質；分液漏

7、斗活塞玻璃表面不得涂油；處理過程應避免紫外光照，盡可能避光操作；提取過程應在通風柜中操作。5.2.1 皂化5.2.1.1低淀粉樣品 準確稱取2-5 g（精確至0.001 g）經均質處理的固體試樣或50 g（精確至0.01 g）液體試樣于150 mL平底燒瓶中，固體試樣需用約20mL溫水溶解，加入1.0 g抗壞血酸和0.1 gBHT，混勻，加入30 mL無水乙醇，加入10-20 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振，混勻后于80 恒溫水浴震蕩回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。注：皂化時間一般為30min，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量氫氧化鉀溶液，并適當XX皂化時間。5.2.1.

8、2高淀粉樣品準確稱取25 g（準確至0.001 g）經均質處理的固體試樣或50 g（精確至0.01 g）液體樣品于150 mL平底燒瓶中，固體試樣需用約20 mL溫水溶解，加入0.51 g淀粉酶，放入60 水避光恒溫振蕩30 min后，取出放入冷水浴降溫，向冷卻后的酶解液中加入1.0 g抗壞血酸和0.1 gBHT，混勻，加入30 mL無水乙醇，10-20 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于80 恒溫水浴震蕩回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。5.2.2 提取 將皂化液用30 mL去離子水轉入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙醚混合液，震蕩萃取5 min，將下層

9、溶液轉移至另一250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的混合醚液再次萃取，合并醚層。 5.2.3 洗滌 用約100 mL水洗滌醚層，約需重復3次，直至將醚層洗至中性（可用廣泛pH試紙檢測下層溶液），去除下層水相。5.2.4 濃縮 將洗滌后的醚層經無水硫酸鈉（約3 g）濾入250 mL旋轉蒸發瓶或氮氣濃縮管中，用約 15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發瓶內，并將其接在旋轉蒸發器或氣體濃縮儀上，于55 水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮，待瓶中醚液剩下約2 mL時，取下蒸發瓶，立即用氮氣吹干。用甲醇分次將蒸發瓶中殘留物溶解并轉移至10mL容量瓶中，定容至刻度。5.3 色譜參考條件色譜柱：C

10、30柱250 mm4.6 mm，3 m或相當者。 柱溫：C30柱溫20 流動相：A：水；B：甲醇，梯度洗脫，0-13 min， 96% B；13-20 min， 96%-100% B；20-24 min， 100% B：24-24.5 min， 100%-96% B，總運行時間30 min。流速：C30柱0.8 mL/mi。紫外檢測波長：維生素A為325 nm; 維生素E 為294 nm。熒光檢測波長：維生素A激發328 nm，發射 440 nm；維生素E激發294 nm，發射 328 nm；進樣量：10 L。標準色譜圖和樣品色譜圖見附錄B。注：1.如實驗室難以將柱溫控制在20 2，可改用PF

11、P柱分離異構體，流動相為水和甲醇梯度淋洗； 2.如樣品中只含a-生育酚，不需分離-生育酚和-生育酚，可選用C18柱，流動相為甲醇。5.4 標準曲線的制作本法采用外標法定量。將維生素A和維生素E標準系列工作溶液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標，以標準測定液濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算直線回歸方程。5.5 樣品測定試樣液經高效液相色譜儀分析，測得其峰面積或峰高，采用外標法通過上述標準曲線計算其濃度。在測定過程中，建議每測定10個樣品用同一份標準溶液或標準物質檢查儀器的穩定性。6 結果計算按式（1）計算維生素A或維生素E的量。（1）式中：X試樣中維生素A或維

12、生素E的含量，單位為微克每百克，g/100g；c根據標準曲線計算得到的試樣中維生素A或維生素E的濃度，單位為微克每毫升，gmL-1；m試樣的稱樣量，單位克，g；V定容液的體積，單位毫升，mL。以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數字。注：如維生素E的測XX果要用-生育酚當量（-TE）表示，可按下式計算：維生素E（mg -TE/100g）= -生育酚（mg/100g） + -生育酚（mg/100g）0.5+ -生育酚（mg/100g）0.1+ -生育酚（mg/100g）0.01。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的10

13、%。8 其他本方法的檢出限：當取樣量為5 g時，維生素A的紫外檢出限為10 g/100g，熒光檢出限為100 g/100g；生育酚的紫外檢出限為40 g/100g，熒光檢出限為5 g/100g。本方法的定量限：當取樣量為5 g時，維生素A的紫外定量限為30 g/100g，熒光定量限為300 g/100g；生育酚的紫外定量限為120 g/100g，熒光定量限為15 g/100g。第二法 食品中維生素A和E的測定 正相高效液相色譜法原理試樣中的維生素A及維生素E用有機溶劑提取、濃縮后，用高效液相色譜硅膠柱或氨基柱將維生素A、維生素E的4種生育酚異構體與其他雜質分離，經熒光檢測器或紫外檢測器檢測，外

14、標法定量。試劑和材料注：除非另有說明，本方法所有試劑所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682規定的三級水。 試劑10.1.1 無水乙醇（C2H5OH）：色譜純，經檢驗不含醛類物質，檢查方法參見附錄C。10.1.2 乙醚（CH3CH2）2O）：分析純，經檢驗不含氧化物，檢查方法參見附錄C。10.1.3 石油醚（C5H12O2）：沸程為3060。10.1.4 無水硫酸鈉（Na2SO4）。10.1.5 正己烷（n-C6H14）：色譜純。10.1.6 異丙醇（CH3）2CHOH）：色譜純。10.1.7 叔丁基甲基醚（CH3OC（CH3）3）：色譜純。10.1.8 甲醇（CH3OH）：色譜純。10.1

15、.9 四氫呋喃（C4H8O）：色譜純。10.1.10 1，4-二氧六環（C4H8O2）；色譜純10.2 試劑配制10.2.1 石油醚-乙醚溶液（1+1，體積比）：200 mL石油醚，加入200 mL乙醚，混勻，臨用前配制。10.3 標準物質10.3.1 維生素A標準物質：視黃醇（C20H30O ）：純度95 %。10.3.2 維生素E標準物質：a-生育酚（C29H50O2），純度95%；-生育酚（C28H4802），純度95%；-生育酚（C28H4802），純度95%；-生育酚（C27H4602 ），純度95%。10.4 標準溶液配制10.4.1 維生素A 標準貯備溶液（0.500mg/mL）

16、：準確稱取 25.0mg維生素A標準物質，用無水乙醇溶解于 50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液濃度約為0.500 mg/mL。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20 下避光保存。臨用前將溶液回溫至20 ，并進行濃度校準（校準方法參見附錄A.1）。10.4.2 維生素E 標準貯備溶液（1.00 mg/mL）：分別稱取4種生育酚異構體標準物質各50.0mg，用無水乙醇溶解于 50 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液濃度約為1.00 mg/mL。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20下避光保存。臨用前將溶液回溫至20 ，并進行濃度校準（校準方法參見附錄A.1）。10.4.3 維生素A和維生

17、素E混合標準溶液中間液：準確吸取維生素A 標準貯備溶液1.00 mL和維生素E 標準貯備溶液各5.00 mL于同一50 mL容量瓶中，用氮氣吹除乙醇后，用流動相定容至刻度，此溶液中維生素A濃度為10 g/mL，維生素E各生育酚濃度為100 g/mL。10.4.4 維生素A和維生素E標準系列工作溶液:分別準確吸取維生素A和維生素E混合標準溶液中間液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL于10mL棕色容量瓶中，用流動相定容至刻度，該標準系列中維生素A濃度為0.50 g/mL、1.00 g/mL、2.00 g/mL、4.00 g/mL、6.00 g/mL，維生

18、素E濃度為5.0 g/mL、10.0 g/mL、20.0 g/mL、40.0 g/mL、60.0 g/mL。11 儀器和設備11.1 分析天平，感量為0.1 mg。11.2 恒溫水浴振蕩器。11.3 旋轉蒸發儀。11.4 氮吹儀。11.5 紫外分光光度計。11.6 索氏脂肪抽提儀或加速溶劑萃取儀。11.7 高效液相色譜儀，帶熒光檢測器或紫外檢測器。12 分析步驟12.1試樣制備將一定數量的樣品按要求經過粉碎、均質、縮分后，儲存于樣品瓶中，避光冷藏，盡快測定。12.2 試樣處理注：使用的所有器皿不得含有氧化性物質；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；處理過程應避免紫外光照，盡可能避光操作。12.2.1

19、 植物油脂準確稱取0.52 g油樣（準確至0.1 mg）于25 mL的棕色容量瓶中，加入0.1 g BHT，用10 mL流動相超聲或渦旋振蕩溶解后，用流動相定容至刻度，搖勻。過孔徑為0.22 um的有機系濾頭于棕色進樣瓶中，待進樣。12.2.2 奶油、黃油 準確稱取25 g樣品（準確至0.1 mg）于50 mL的離心管中，加入0.1 g BHT， 45 水浴融化，加入5 g無水硫酸鈉，渦旋1 min，混勻，加入25 mL流動相超聲或渦旋振蕩提取，離心，將上清液轉移至濃縮瓶中，再用20 mL流動相重復提取1次，合并上清液至濃縮瓶，在旋轉蒸發器或氣體濃縮儀上，于45 水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮，待瓶

20、中醚剩下約2 mL時，取下蒸發瓶，立即用氮氣吹干。用流動相將濃縮瓶中殘留物溶解并轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻。過孔徑為0.22 um的有機系濾頭于棕色進樣瓶中，待進樣。12.2.3 堅果、豆類、辣椒粉等干基植物樣品準確稱取25 g樣品（準確至0.1 mg），用索氏提取儀或加速溶劑萃取儀提取其中的植物油脂，將含油脂的提取溶劑轉移至250 ml蒸發瓶內，于55 水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮至干，取下蒸發瓶，用10mL流動相將油脂轉移至25 mL容量瓶中，加入0.1 g BHT，超聲或渦旋振蕩溶解后，用流動相定容至刻度，搖勻。過孔徑為0.22 um的有機系濾頭于棕色進樣瓶中，待進樣。分別將

21、維生素A、E 標準工作液注入液相色譜儀中，得到峰高（或峰面積）。以峰高（或峰面積）為縱坐標，以維生素A、E 標準工作液濃度為橫坐標分別繪制維生素A、E 標準曲線。12.3 液相色譜參考條件色譜條件一：色譜柱：Si 60硅膠柱，250 mm4.6 mm，5 m，可分離4種-生育酚異構體和視黃醇柱 溫：30流動相：正己烷：1，4-二氧六環（95:5，V/V）流 速：1.0 mL/min。維生素A熒光檢測波長：激發328 nm，發射 440 nm；維生素E熒光檢測波長：激發294 nm，發射 328 nm；進樣量：20 L。色譜條件二：色譜柱：酰氨基柱，150 mm3.0 mm，1.7 m，可分離4

22、種-生育酚異構體和視黃醇柱 溫：30 流動相：正己烷：叔丁基甲基醚四氫呋喃甲醇混合液（20：1：0.1）=（90:10，V/V）流 速：0.8 mL/min。維生素A熒光檢測波長：激發328 nm，發射 440 nm；維生素E熒光檢測波長：激發294 nm，發射 328 nm；進樣量：10L。12.4 標準曲線的制作本法采用外標法定量。將維生素A和維生素E標準系列工作溶液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標，以標準測定液濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算直線回歸方程。12.5 樣品測定試樣液經高效液相色譜儀分析，測得其峰面積或峰高，采用外標法通過上述標準曲線計算

23、其濃度。在測定過程中，建議每測定10個樣品用同一份標準溶液或標準物質檢查儀器的穩定性。13 結果計算按式（2）計算維生素A或維生素E的量。（2）式中：X試樣中維生素A或維生素E的含量，單位為微克每百克，g/100g；c根據標準曲線計算得到的試樣中維生素A或維生素E的濃度， 單位為微克每毫升， gmL-1；m試樣的稱樣量，單位克，g；V定容液的體積，單位毫升，mL。以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數字。注：如維生素E的測XX果要用-生育酚當量（-TE）表示，可按下式計算：維生素E（mg -TE/100g）= -生育酚（mg/100g） + -生育酚（mg

24、/100g）0.5+ -生育酚（mg/100g）0.1+ -生育酚（mg/100g）0.01。14 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。15 其他本方法的檢出限：當取樣量為5 g時，維生素A的紫外檢出限為5 g/100g，熒光檢出限為50 g/100g；生育酚的紫外檢出限為40 g/100g，熒光檢出限為5 g/100g。本方法的定量限：當取樣量為5 g時，維生素A的紫外定量限為15g/100g，熒光定量限為150 g/100g；生育酚的紫外定量限為120 g/100g，熒光定量限為15 g/100g。第三法 食品中維生素D的測定 液相色譜串聯質譜法

25、16 原理試樣中加入維生素D2和D3的同位素內標后，經氫氧化鉀乙醇溶液皂化、提取后，用Silica固相萃取柱凈化，反相高效液相色譜C18柱將維生素D2、D3與其他雜質分離，串聯質譜法檢測，內標法定量。17 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所有試劑所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682規定的三級水。17.1 試劑17.1.1 無水乙醇（C2H5OH）：色譜純，經檢驗不含醛類物質。17.1.2 抗壞血酸 。17.1.3 BHT17.1.4 Taka-淀粉酶：活力單位100 U/mg。17.1.5 氫氧化鉀（KOH）17.1.6 乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。17.1.7 正己烷（n-C6

26、H14）：色譜純。17.1.8 無水硫酸鈉（Na2SO4）。17.1.9 pH 試紙（范圍114）。17.1.10 Silica固相萃取柱: 6 cc，500 mg。17.1.11 甲醇（CH3OH）：色譜純。17.1.12 甲酸（HCOOH）：色譜純。17.1.13 甲酸銨（HCOONH4）：色譜純。17.2 試劑配制17.2.1 氫氧化鉀溶液（50g/100g）：50 g氫氧化鉀，加入50 mL水溶液，冷卻后儲存于聚乙烯瓶中。17.2.2 固相萃取淋洗液：乙酸乙酯正己烷溶液（5+95，體積比）17.2.3 固相萃取洗脫液：乙酸乙酯正己烷溶液（15+85，體積比）17.2.4 流動相17.2

27、.4.1 流動相A：0.05%甲酸-5 mmol甲酸銨水溶液17.2.4.2 流動相B：0.05%甲酸-5 mmol甲酸銨甲醇溶液17.3 標準物質17.3.1 維生素D2標準物質：鈣化醇 （C28H44O，CAS:50-14-6），純度大于98%。17.3.2 維生素D3標準物質：膽鈣化醇 （C27H44O，CAS:511-28-4），純度大于98%。17.3.3 維生素D2-d3內標溶液17.3.4 維生素D3-d3內標溶液17.4 標準溶液配制17.4.1 維生素D2標準儲備溶液： 準確稱取維生素D2標準品10.0 mg，用色譜純無水乙醇溶解并定容至100 mL，使其濃度約為100 ug

28、/mL，轉移至棕色試劑瓶中，于-18 冰箱中密封保存。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度（標定方法參見附錄A.1）。17.4.2 維生素D3標準儲備溶液：準確稱取維生素D2標準品10.0 mg，用色譜純無水乙醇溶解并定容至10 mL，使其濃度約為100 ug/mL，轉移至100 mL的棕色試劑瓶中，于-18 冰箱中密封保存。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度（標定方法參見附錄A.1）。17.4.3 維生素D2標準中間使用液：準確吸取維生素D2標準儲備溶液10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL，濃度約為10.0 ug/mL，準確濃度按校正后的濃度折算。17.4.4 維生素D3標準

29、中間使用液:準確吸取維生素D3標準儲備溶液10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL的棕色容量瓶中，濃度約為10.0 ug/mL，準確濃度按校正后的濃度折算。17.4.5 維生素D2和維生素D3 混合標準使用液：準確吸取維生素D2和維生素D3 標準中間使用液各10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL，濃度為1.00 ug/mL。17.4.6 維生素D2-d3和維生素D3-d3內標混合溶液：分別量取100 L濃度為100 g/mL的維生素D2-d3和維生素D3-d3標準儲備液加入10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 g/mL混合內標。17.5 標準系列溶液的配制 分別準確吸

30、取維生素D2和D3 混合標準使用液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL 、1.50 mL、2.00 mL于10 mL 棕色容量瓶中，各加入維生素D2-d3和維生素D3-d3內標混合溶液1.00 mL， 用甲醇定容至刻度，混勻。此標準系列工作液濃度分別為10 .0g/L、20.0 g/L、50 .0g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L。18 儀器和設備使用的所有器皿不得含有氧化性物質。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。18.1 分析天平，感量為0.1 mg。18.2帶加熱、控溫功能的磁力攪拌器或恒溫振蕩水浴。18.3 旋轉蒸發儀。18.4 氮吹儀。18.5

31、 紫外分光光度計。18.6 萃取凈化振蕩器。18.7 多功能渦旋振蕩器。18.8 高速冷凍離心機，帶50mL離心管轉子。18.9 高效液相色譜串聯質譜儀，帶電噴霧源或大氣壓化學源。19 分析步驟19.1 試樣制備將一定數量的樣品按要求經過粉碎、均質、縮分后，儲存于樣品瓶中，避光冷藏，盡快測定。19.2 試樣處理處理過程應避免紫外光照，盡可能避光操作。19.2.1 皂化 19.2.1.1低淀粉樣品準確稱取2 g（準確至0.0001 g）經均質處理的試樣于50 mL具塞離心管中，加入100 L維生素D2-d3和維生素D3-d3混合內標和0.4 g抗壞血酸，加入6 mL約40 溫水，渦旋1 min，

32、使樣品完全溶解或分散。加入12 ml乙醇渦旋30 s，再加入6 mL氫氧化鉀溶液渦旋30 s后，放入恒溫振蕩器中，80 避光恒溫水浴振蕩30 min（如樣品組織較為緊密，可每隔510 min取出渦旋0.5 min），取出放入冷水浴降溫。混勻后于加熱式磁力攪拌器上80 回流皂化30 min使樣品皂化完全皂化后立即用冷水冷卻至室溫。注：一般為30 min，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量氫氧化鉀乙醇溶液，并XX皂化時間。19.2.1.2高淀粉樣品準確稱取2 g（準確至0.01 g）經均質處理的試樣于50 mL具塞離心管中，加入100 L維生素D2-d3和維生素D3-d3混合內標和和0.4

33、g淀粉酶，加入10 ml約40溫水，放入恒溫振蕩器中，60 避光恒溫振蕩30 min后，取出放入冷水浴降溫，向冷卻后的酶解液中加入0.4 g抗壞血酸，12 ml乙醇渦旋30 s，再加入6 mL 50%氫氧化鉀溶液渦旋30 s后，放入恒溫振蕩器中，同19.2.1.1皂化30 min。19.2.2 提取 向冷卻后的皂化液中加入20 mL正己烷，渦旋提取3 min，10000 r/min條件下離心5 min。轉移上層清液到50 ml離心管，加入25 mL純水中，輕微晃動30次，使用離心機在10000 r/min條件下離心3 min，取上層有機相備用。 19.2.3 凈化將Silica固相萃取柱（6c

34、c，500 mg）依次用8 mL乙酸乙酯活化，8 mL正己烷平衡，取備用液全部過柱，再用6 mL含5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗，用6 mL含15%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫。洗脫液在 40 下氮氣吹干，加入1.00 mL甲醇，渦旋30秒，過0.22 m濾膜，進樣測定。19.3 儀器測定條件19.3.1 色譜條件 Eclipse PAH C18柱或相當者（2.1 mm100 mm，1.8 m）；流速：0.4 ml/min；柱溫：45；進樣量：10 L；流動相A:0.05%甲酸-5 mmol甲酸銨水溶液，流動相B：0.05%甲酸-5 mmol甲酸銨甲醇溶液；流動相洗脫梯度見表1。表1 流動相洗脫梯度

35、時間min流動相A%流動相B%流速ml/min0.012880.41.012880.44.010900.45.07930.45.16940.45.86940.46.001000.417.001000.417.512880.420.012880.419.3.2 質譜條件電離模式：帶有噴射流技術的電噴霧電離源（ESI with Jet Stream）；鞘氣溫度：375 ；鞘氣流速：12 L/min；噴嘴電壓：500 V；霧化器壓力：25 psi；毛細管電壓：4500 V；干燥氣溫度：325 ；干燥氣流速：10 L/min；檢測方式：多反應檢測（MRM）；定性離子對、定量離子對、碰撞能量及對應保留時

36、間等參數見表2。表2 MRM離子選擇條件維生素保留時間母離子Fragmentor定性子離子碰撞電壓定量子離子碰撞電壓維生素D26.0439710637914752510729維生素D2-d36.034001103822714611022維生素D36.333851063672597810725維生素D3-d36.33388113370259361071919.4 標準曲線的制備分別將維生素D2和D3標準系列工作液注入液相色譜-串聯質譜儀，得到維生素D2和D3峰面積。以維生素D2、D3與相應的同位素內標峰面積比為縱坐標，以維生素D2、D3標準系列工作液濃度為橫坐標分別繪制維生素D2、D3標準曲線。

37、19.5 樣品測定吸取維生素D測定液10 L注入反相液相色譜儀中，得到待測物與內標物的峰高（或峰面積）比值，根據標準曲線得到維生素D測定液中維生素D2（或D3）的濃度。20 結果計算按式（4）計算維生素D2（或D3）的量。（4）式中：X試樣中維生素D2（或D3）的含量，單位為微克每百克，g/100g；c根據標準曲線計算得到的試樣中維生素D2（或D3）的濃度，單位為微克每毫升，gmL-1；m試樣的稱樣量，單位克，g；V定容體積，單位毫升，mL。以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數字。按照數值修約規則保留結果的有效數字，測XX果報告平行樣測定值的算術平均值。

38、21 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。22 其他本方法檢出限：當取樣量為2 g時，維生素D2的檢出限為1 g/100 g；維生素D3的檢出限為0.2 g/100 g；本方法定量限：當取樣量為2 g時，維生素D2的定量限為3 g/100 g；維生素D3的定量限為0.6 g/100g。第四法 食品中維生素D的測定 高效液相色譜法23 原理試樣中的維生素D2或D3經氫氧化鉀乙醇溶液皂化、提取、凈化、濃縮后，用正相高效液相色譜半制備，反相高效液相色譜C18柱將維生素D2、D3與其他雜質分離，經紫外或二極管陣列檢測器檢測，內標法定量，如測定維生素D2，用維

39、生素D3作內標；如測定維生素D3，用維生素D2作內標。24 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所有試劑所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682規定的三級水。24.1 試劑24.1.1 無水乙醇（C2H5OH）：色譜純，經檢驗不含醛類物質。24.1.2 抗壞血酸。24.1.3 叔丁基茴香醚（BHT）24.1.4 氫氧化鉀（KOH）。24.1.5 正己烷（C4H10O）。24.1.6 石油醚（C5H12O2）：沸程為3060。24.1.7 無水硫酸鈉（Na2SO4）。24.1.8 pH 試紙（范圍114）。24.1.9 甲醇：色譜純。24.1.10 Taka-淀粉酶：活力單位100 U/mg。2

40、4.2 試劑配制24.2.1 氫氧化鉀溶液：50 g氫氧化鉀，加入50mL水溶解，冷卻后儲存于聚乙烯瓶中，臨用前配制。24.2.2 流動相：24.2.2.1 正相半制備色譜流動相：正己烷環己烷混合溶液（1+1，V/V）99.2份與異丙醇0.8份混合，超聲脫氣，備用。24.2.2.2 反相分析色譜流動相：甲醇水（95+1，體積比）24.3 標準物質24.3.1 維生素D2標準物質：鈣化醇 （C28H44O，CAS:50-14-6），純度大于98%。24.3.2 維生素D3標準物質：膽鈣化醇 （C27H44O，CAS:511-28-4），純度大于98%。24.4 標準溶液配制24.4.1 維生素D

41、2標準儲備溶液： 準確稱取維生素D2標準品10.0 mg，用色譜純無水乙醇溶解并定容至100 mL，使其濃度約為100 ug/mL，轉移至棕色試劑瓶中，于-18 冰箱中密封保存。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度（標定方法參見附錄A.1）。維生素D3標準儲備溶液：準確稱取維生素D2標準品10.0 mg，用色譜純無水乙醇溶解并定容至10 mL，使其濃度約為100 ug/mL，轉移至100mL的棕色試劑瓶中，于-18冰箱中密封保存。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度（標定方法參見附錄A.1）。維生素D2標準中間使用液：準確吸取維生素D2標準儲備溶液10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100

42、mL，濃度約為10.0 ug/mL，準確濃度按校正后的濃度折算。維生素D3標準中間使用液:準確吸取維生素D3標準儲備溶液10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL的棕色容量瓶中，濃度約為10.0 ug/mL，準確濃度按校正后的濃度折算。維生素D2標準使用液:準確吸取維生素D2標準中間使用液10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL的棕色容量瓶中，濃度約為1.00ug/mL，準確濃度按校正后的濃度折算。維生素D3標準使用液:準確吸取維生素D3標準中間使用液10.00 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL的棕色容量瓶中，濃度約為1.00 ug/mL，準確濃度按校正后的濃度折算。2

43、4.4.7 標準系列溶液的配制24.4.7.1 當用維生素D2作內標測定維生素D3時，分別準確吸取維生素D3標準中間使用液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL 、6.00 mL、10.00mL于100 mL 棕色容量瓶中，各加入維生素D2內標溶液5.00 mL， 用甲醇定容至刻度混勻。此標準系列工作液濃度分別為0.05 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL、0.40 g/mL、0.60 g/mL、1.00 g/mL。24.4.7.2 當用維生素D3作內標測定維生素D2時，分別準確吸取維生素D2標準中間使用液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4

44、.00 mL 、6.00 mL、10.00 mL于100 mL 棕色容量瓶中，各加入維生素D3內標溶液5.00 mL， 用甲醇定容至刻度，混勻。此標準系列工作液濃度分別為0.05 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL、0.40 g/mL、0.60 g/mL、1.00 g/mL。25 儀器和設備注：使用的所有器皿不得含有氧化性物質。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。25.1 分析天平，感量為0.1 mg。25.2 帶加熱、控溫功能的磁力攪拌器。25.3 旋轉蒸發儀。25.4 氮吹儀。25.5 紫外分光光度計。25.6 萃取凈化振蕩器。25.7 半制備正相高效液相色譜儀，帶紫外或二極管陣列

45、檢測器，進樣器配500 uL定量環。25.8 反相高效液相色譜分析儀，帶紫外或二極管陣列檢測器，進樣器配100 uL定量環。26 分析步驟26.1 試樣制備將一定數量的樣品按要求經過粉碎、均質、縮分后，儲存于樣品瓶中，避光冷藏，盡快測定。26.2 試樣處理處理過程應避免紫外光照，盡可能避光操作。如不明確樣品中是否同時含有維生素D2和D3，可通過實驗測定樣品中的本底后，再確定是否可選用維生素D2或D3為內標。26.2.1 低淀粉樣品皂化準確稱取510 g（準確至0.01 g）經均質處理的固體試樣或50 g（精確至0.01 g）液體樣品于150 mL平底燒瓶中，固體試樣需用約20 mL溫水溶解，加

46、入1.00 mL內標使用溶液（如測定維生素D2，用維生素D3作內標；如測定維生素D3，用維生素D2作內標。），再加入1.0g抗壞血酸和0.1 gBHT，混勻。加入15 mL約40 溫水，使樣品完全溶解或分散。加入30mL無水乙醇，加入10-20 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于恒溫磁力攪拌器上80 回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。注：一般為30 min，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量氫氧化鉀乙醇溶液，并XX皂化時間。26.2.2 高淀粉樣品皂化準確稱取510 g（準確至0.01 g）經均質處理的固體試樣或50 g（精確至0.01 g）液體樣品于150 mL平底

47、燒瓶中，固體試樣需用約20 mL溫水溶解，加入1.00 mL內標使用溶液（如測定維生素D2，用維生素D3作內標；如測定維生素D3，用維生素D2作內標。）和1 g淀粉酶，放入60 水避光恒溫振蕩30 min后，取出放入冷水浴降溫，向冷卻后的酶解液中加入1.0 g抗壞血酸和0.1 gBHT，混勻。加入30 mL無水乙醇，10-20 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于恒溫磁力攪拌器上80 回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。26.2.3 提取 將皂化液用30 mL去離子水轉入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，震蕩萃取5 min，將下層溶液轉移至另一250 mL的分液漏

48、斗中，加入50 mL的石油醚液再次萃取，合并醚層。 26.2.4 洗滌 用約150 mL水洗滌醚層，約需重復3次，直至將醚層洗至中性（可用廣泛pH試紙檢測下層溶液），去除下層水相。26.2.5 濃縮 將洗滌后的醚層經無水硫酸鈉（約3 g）濾入250 mL旋轉蒸發瓶或氮氣濃縮管中，用約 15 mL石油醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發瓶內，并將其接在旋轉蒸發器或氣體濃縮儀上，于402 水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮，待瓶中醚剩下約2 mL時，取下蒸發瓶，氮吹至干，用正己烷定容至2 mL，過0.22 um濾膜，在半制備正相高效液相色譜系統進行半制備，凈化待測液。26.3 測定條件26.3.1 維生

49、素D 待測液的凈化26.3.1.1半制備正相高效液相色譜參考條件 色譜柱：硅膠柱，150 mm 4.6 mm，或具同等性能的色譜柱。 流動相：環己烷與正己烷按體積比1：1混合，并按體積分數0.8 %加入異丙醇。 流 速：1 mL/min。 波 長：264 nm。 柱 溫：35 1 。 進樣體積：500 L。26.3.1.2 半制備正相高效液相色譜系統適用性試驗取約1.00 mL維生素D2和D3標準中間使用液于10 mL具塞試管中，在40 2 的氮吹儀上吹干。殘渣用10 mL正己烷振蕩溶解。取該溶液500 L注入液相色譜儀中測定，確定維生素D保留時間。然后將100 L待測液注入液相色譜儀中，根據

50、維生素D標準溶液保留時間收集維生素D餾分于試管C中。將試管C置于40 2 條件下的氮吹儀中吹干，取出準確加入1.0 mL甲醇，殘渣振蕩溶解，即為維生素D測定液。26.3.2 反相液相色譜參考條件色譜柱：C18柱，250 mm 4.6 mm，5 m，或具同等性能的色譜柱。流動相：甲醇：水=95:5（V/V）。流 速：1 mL/min。檢測波長：264 nm。柱 溫：35 1 。進樣量：100 L。26.4 標準曲線的制備分別將維生素D2或D3標準系列工作液注入反相液相色譜儀中，得到維生素D2和D3峰高（或峰面積）。以兩者峰高（或峰面積）比為縱坐標，以維生素D2或D3標準工作液濃度為橫坐標分別繪制

51、維生素D2或D3標準曲線26.5 樣品測定吸取維生素D測定液100 L注入反相液相色譜儀中，得到待測物與內標物的峰高（或峰面積）比值，根據標準曲線得到維生素D測定液中維生素D2（或D3）的濃度。27 結果計算按式（3）計算維生素D2（或D3）的量。（3）式中：X試樣中維生素D2（或D3）的含量，單位為微克每百克，g/100g；c根據標準曲線計算得到的試樣中維生素D2（或D3）的濃度，單位為微克每毫升，gmL-1；m試樣的稱樣量，單位克，g；V定容體積，單位毫升，mL。以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數字。按照數值修約規則保留結果的有效數字，測XX果報告平行樣測定值的算術平均值。28 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。29 其他本方法檢出限：當取樣量為10g時，維生素D2或維生素D3的檢出限為0.7g/100 g；本方法定量限：當取樣量為10g時，維生素D2或維生素D3的定量限均為2g/100 g。附 錄A維生素A、D、E標準溶液濃度校正方法 維生素A、