1、酶免疫技術第一節 酶免疫技術的特點 基本原理：Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物 顯色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物 顯色 該實驗利用了酶催化底物的生物放大作用，可對標本中抗原（抗體）進行定性、定位和定量分析。相結合的技術酶標記免疫技術又稱酶免疫技術：抗原抗體反應的特異性 酶促反應的專一性辣根過氧化物酶 （HRP） 從辣根菜中提取的，糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基），主酶與酶活性無關， 輔基是酶的活性中心。優點：分子量小，標記物易透入細胞；標記方法簡單；溶解性好； 價格低且有商品供應；底物種類多。 由于有以上優點，因此，是ELISA最常用的酶 。常用酶酶和酶作用底物H

2、RP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRPDH2為供氫體習慣上被稱為底物，底物有多種 酶和酶作用底物HRP催化的反應式H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高。 常用的是過氧化氫（H2O2)和過氧化氫尿素（CH6N2O3) ，過氧化氫很不穩定需用前臨時配制。過氧化氫尿素配制成應用液可長期保存。 HRP的常見底物 鄰苯二胺 OPD四甲基聯苯胺 TMB5-氨基水楊酸5-ASA 2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS常用底物酶和酶作用底物TMB反應后顯藍色 ，加酸終止反應后變為黃色,測定波長450nm ，穩定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。 HRP的常見

3、底物 酶和酶作用底物ELISA試劑盒有兩種液態試劑A（過氧化氫），B（TMB），如出現顏色改變應廢棄。 固相抗體或抗原是非均相酶免技術中將游離和結合的酶標記物迅速分離的最常用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合到固相載體的表面 三、固相載體第二節酶免疫技術分類 酶聯免疫吸附試驗（常用）斑點ELISA斑點酶免疫滲濾實驗 免疫印跡法高靈敏度ELISABAS- ELISA派生出酶免疫技術的分類酶免疫組織化學技術酶免疫測定技術均相測定技術異相測定技術液相法固相法夾心法捕獲法競爭性ELISA非競爭性ELISA間接法酶放大免疫測定技術克隆酶供體免疫分析平衡法；非平衡法第三節酶聯免疫吸附試驗(enzym

4、e linked immunosorbent assay,ELISA) 底物顯色定性或定量的分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離1234一、基本原理固相的抗原或抗體 酶標記物（酶結合物） 酶反應的底物 三個必要試劑 二、方法類型及反應原理1、雙抗體夾心法應用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定，如 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。ELISA檢測抗原的方法4、加酶底物1、包被： 包被已知抗體洗滌 去除未結合抗體2、加樣：加待測標本 （待測抗原）3、加酶標志物：酶標抗體洗滌去除 未結合物洗滌去除 未結合物，酶標抗體加終止液 5、結

5、果判定：肉眼觀察定性分 析；酶標儀檢測定性或定量分析 雙位點一步法？1、已知抗體包3、加酶標抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包2、加待檢物無抗3、加酶標抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2、競爭法 方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。 應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測抗原的方法1、間接法方法 用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優點

6、 一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的方法2、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似 應用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法夾心法：有雙抗原夾心法和雙抗體夾心法，兩者步驟相同，操作原理相同。但酶標志物和檢測對象不同。雙抗原夾心法測抗體，雙抗體夾心法測抗原。3、競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法 應用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測 ELISA檢測抗體的方法捕獲法 應用： 病原體急性感染診斷中的IgM型抗體 甲型肝炎HAV-IgM抗體 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的方法洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY 1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結合